CN103388027B - 不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法，涉及豹纹鳃棘鲈。1）提取东星斑的基因组DNA；2）以步骤1）所得的基因组DNA为模板，两次PCR扩增东星斑的线粒体基因组中的COI基因，获得PCR扩增产物；3）将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出104bp的PCR扩增产物，则该样品为红东星斑，若检测不出104bp的PCR扩增产物，则该样品为白东星斑。鉴别方法简便快速，易于操作。
Description
技术领域
本发明涉及豹纹鳃棘鲈，尤其是涉及不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法。
背景技术
豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）又名东星斑，隶属于鲈形目（Perciformes），石斑鱼科（Epinephelidae），鳃棘鲈属（Plectropomus），其野生群体广泛分布于分布于印度洋-西太平洋区，北自日本南部，南迄澳洲，东至斐济，是我国东南沿海乃至世界名贵的海产品。目前市场上的东星斑存在两种类群，其中一种类群体色红润，俗称红东星斑，其因富有喜庆色彩，符合国人购物偏好，价格昂贵，约为500元/kg，而另一种类群体色灰白，俗称为白东星斑，其价格显著低于红东星斑，约为250元/kg。目前，东星斑在海南、广东均有养殖，而红东星斑因其成体价格较高，其种苗成为养殖苗种的首选，价格显著高于白东星斑种苗，然而由于两种类群除体色外其他形态特征都极为相似，而在受精卵及苗种阶段（尚未形成真实体色）难于准确鉴别，从而给予许多不法分子以次充好的机会，以白东星斑苗或受精卵代替红东星斑苗或受精卵出售给养殖户以牟取暴利。目前，用于准确鉴别红东星斑苗和白东星斑苗的方法还未见正式报道。通过研究发现，红白两类群东星斑的线粒体存在一个可供鉴别的单核苷酸多态性（SNP）标记，其中R1～5分别为红东星斑的5个平行样，W1～5分别为白东星斑的5个平行样；东星斑线粒体中的SNP标记位于线粒体基因组中COI基因5’端的第606个碱基，其中红东星斑的标记为A，白东星斑的该碱基为G，这种碱基的差异可作为鉴别不同类群的标记。
发明内容
本发明的目的在于提供不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法。
所述鉴别东星斑种群的单核苷酸多态性标记位于东星斑线粒体基因组中COI基因5’端的第606个碱基，红东星斑线粒体基因组中COI基因5’端的第606个碱基为A，白东星斑线粒体基因组中COI基因5’端的第606个碱基为G。
本发明包括以下步骤：
1）提取东星斑的基因组DNA；
2）以步骤1）所得的基因组DNA为模板，两次PCR扩增东星斑的线粒体基因组中的COI基因，获得PCR扩增产物；
3）将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出104bp的PCR扩增产物，则该样品为红东星斑，若检测不出104bp的PCR扩增产物，则该样品为白东星斑。
在步骤2）中，所述两次PCR扩增的引物均为：
COI-606H：5’-CAGTATCTTCTCCTATCACTACCTGTTATA-3’
COI-606L：5’-AATAAGTGCTGGTAGAGGATTGGGT-3’
所述两次PCR扩增的反应体系均为：25μL总体积，Buffer10mM，dNTP0.2mM，Mg2+1.5mM，COI-606H0.32mM，COI-606L0.4mM，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补齐到25μL。
所述两次PCR扩增分别为阳性检测反应的扩增和选择性扩增反应的扩增；阳性检测反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前35个循环为每个循环于95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min；选择性扩增反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s（退火温度每个循环后降低1度），72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min。
在步骤3）中，所述电泳分析可采用1%琼脂糖凝胶电泳分析。
本发明用于进行鉴别的SNP标记位于线粒体基因组中细胞色素c氧化酶I(COI)基因的5’端第606个碱基位点，为单碱基变异。
本发明合成一对选择性扩增引物COI-606H：5’-CAGTATCTTCTCCTATCACTACCTGTTATA-3和COI-606L：5’-AATAAGTGCTGGTAGAGGATTGGGT-3’；提取所需鉴别的东星斑样品的DNA；利用上述引物对该东星斑的DNA样品进行两次PCR扩增，阳性检测反应的程序为：95℃5min→（95℃30s→58℃30s→72℃30s）×35个循环→72℃5min；选择性扩增反应的程序为：95℃5min→（95℃30s→67℃（每个循环减1℃）30s→72℃30s）×5个循环→（95℃30s→62℃30s→72℃）×20个循环→72℃5min；扩增产物经1%琼脂糖电泳分析，在阳性检测反应中存在104bp大小扩增产物的前提下，若选择性扩增反应亦存在104bp大小的扩增产物，该样品即为红东星斑，反之即为白东星斑。
本发明的鉴别方法简便快速，易于操作。
本发明利用申请人发现的东星斑不同类群间存在的一个线粒体单核苷酸多态性位点差异，设计了一对选择性扩增引物COI-606H和COI-606L，对东星斑的DNA进行PCR扩增。通过检测PCR扩增产物的有无，从而辨别东星斑所属类群。该方法具有简单易行、准确快捷、公正客观、经济实用的优点。
附图说明
图1为实施例1中阳性检测反应产物1%琼脂糖胶电泳图。
图2为实施例1中选择性扩增反应产物1%琼脂糖胶电泳图。
在图1和2中，M为DNA分子量标记（Marker1），600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp为DNA分子量标记的大小；R1～5分别红东星斑的5个平行样，W1～5分别为白东星斑的5个平行样。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1）选用样品为红东星斑与白东星斑个体肌肉样，按常规方法采用酚氯仿抽提法（参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月）提取东星斑DNA；
2)设计合成一对选择性扩增引物
COI-606H：5’-CAGTATCTTCTCCTATCACTACCTGTTATA-3’
COI-606L：5’-AATAAGTGCTGGTAGAGGATTGGGT-3’。
对东星斑的线粒体DNA基因进行两次PCR扩增，其中阳性检测反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前35个循环为每个循环于95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min。选择性扩增反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s（退火温度每个循环后降低1度），72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min。两次PCR反应的体系组成皆为：25μL总体积，Buffer10mM，dNTP0.2mM，Mg2+1.5mM，COI-606H0.32mM，COI-606L0.4mM，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补齐到25μL。
扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在阳性检测反应中，两个DNA样品皆存在104bp的扩增产物，说明整个反应体系无其他干扰因素；选择性扩增中，若存在104bp的扩增产物，则该DNA样品为红东星斑，若无任何扩增产物，则该DNA样品为白东星斑。（参见图1和2）。
Claims (2)
1.不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
1)提取东星斑的基因组DNA；
2)以步骤1)所得的基因组DNA为模板，两次PCR扩增东星斑的线粒体基因组中的COI基因，获得PCR扩增产物；
所述两次PCR扩增的引物均为：
COI-606H：5’-CAGTATCTTCTCCTATCACTACCTGTTATA-3’
COI-606L：5’-AATAAGTGCTGGTAGAGGATTGGGT-3’；
所述两次PCR扩增的反应体系均为：25μL总体积，Buffer 10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，COI-606H 0.32mM，COI-606L 0.4mM，Taq酶1U，模板50ng，用双蒸水补齐到25μL；
所述两次PCR扩增分别为阳性检测反应的扩增和选择性扩增反应的扩增；所述阳性检测反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前35个循环为每个循环于95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min；所述选择性扩增反应的扩增程序为：95℃预变性5min；前5个循环为每个循环于95℃变性30s，67℃退火30s，退火温度每个循环后降低1度，72℃延伸30s；后20个循环为每个循环于95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；最后一次循环结束后于72℃延伸5min；
3)将PCR扩增产物进行电泳分析，若检测出104bp的PCR扩增产物，则该样品为红东星斑，若检测不出104bp的PCR扩增产物，则该样品为白东星斑。
2.如权利要求1不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法，其特征在于在步骤3)中，所述电泳分析采用1％琼脂糖凝胶电泳分析。
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| 16S rRNA 基因和COI 基因序列分析在石斑鱼物种鉴定中的应用;陈双雅等;《生物技术通报》;20121231(第10期);第124－130页 * |
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