CN105063222A - 人adh2基因型检测试剂盒 - Google Patents

人adh2基因型检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人ADH2基因型检测试剂盒，包括野生型和突变型ADH2基因特异性扩增引物对以及Ms1I限制性内切酶。采用本发明的试剂盒，不需要额外购买测序仪、QPCR仪或芯片扫描仪，可以在大量普通的分子实验室开展检测。同时，与其它检测方法相比，本发明还有快速、便宜、稳定和准确的特点，具有全面的优势。

Description

人ADH2基因型检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人ADH2基因型检测试剂盒。
背景技术
乙醇脱氢酶2与人体内的乙醇代谢密切相关。当人摄入酒精后，体内的乙醇脱氢酶2首先将其氧化为乙醛，然后通过乙醛脱氢酶把乙醛进一步转化成为乙酸。
rs1229984是位于人的GRCh38版基因组4号染色体上99318162位置的突变位点，chr4:99318142-99318182的序列为：
GGTGGCTGTAGGAATCTGTCRCACAGATGACCACGTGGTTA，R为简并碱基，表示A或G。该位点位于人的ADH1B(ADH2)基因内，ADH2基因编码乙醇脱氢酶2。rs1229984位点为G时，对应基因编码精氨酸(Arg)；为A时，编码组氨酸(His)。含精氨酸的乙醇脱氢酶2代谢效率高，含组氨酸的代谢效率低。如下表所示，现有文献报道，有rs1229984(A)的人比没有的只有其0.56倍的上消化道患癌风险。
因此，对该位点的基因型检测对人的日常生活具有指导意义。
现有技术中，已有检测的用于ADH2基因突变的技术有以下几种：(1)采用基因芯片的方法进行ADH2基因突变检测，该技术在野生型和突变型的碱基差异位置设计寡核苷酸序列，通过是否能与芯片杂交来判别检测对象为野生型还是突变型。基于基因芯片的技术步骤繁琐，每个样本的处理时间较长，很难进行大样本量的批量处理，而且单次检测的成本较高，同时还需要芯片扫描仪来进行诊断，需要购置额外的检测设备。(2)采用一代测序的方法来区分野生型和突变型，所述技术需要一代测序仪进行测序，同时实验周期较长。(3)采用QPCR的方法来区分野生型和突变型，但是所述技术需要QPCR仪进行测序，操作复杂。(4)用特异性的引物进行PCR来区分野生型和突变型，但是所述技术的准确率低。
发明内容
针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测快速、准确率高、操作简单、成本低的ADH2基因上rs1229984位点的基因型检测试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供所检测试剂盒的应用及其使用方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种人ADH2基因型检测试剂盒，包括野生型和突变型ADH2基因特异性扩增引物对以及Ms1I限制性内切酶。
优选地，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5’-AGACTGAATAACCTTGGGGATAAAC-3’；反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：5’-CACTGTGTCTCTTTTGATCCTCAC-3’。
本发明试剂盒的关键是所述引物对和所述限制性内切酶的首次组合使用。本发明的发明人经过反复比较和优化，获得了所述能同时扩增野生型和突变型ADH2基因的引物对。根据野生型和突变型ADH2基因的单碱基差异位点，设计了所述Ms1I限制性内切酶，野生型ADH2基因能够被所述限制性内切酶识别并消化，而突变型ADH2基因对所述限制性内切酶不敏感，因此不能够被识别消化。所述PCR扩增引物对扩增出的基因片段，采用所述限制性内切酶酶切后获得的酶切片段和未酶切片段能有效通过电泳方法分离。
本发明是通过“能否被内切酶消化”作为ADH2基因分型的依据，所以只需要观察是否存在600bp的主带或消化后的条带，即可实现分型。
将消化后的产物直接进行电泳，若电泳结果只有一个完整的600bp左右的条带，则说明受试者的ADH2基因的两个拷贝都不能被Ms1I限制性内切酶消化，为纯合突变型ADH2基因；若电泳结果有一条被消化的400bp条带，则受试者的ADH2基因的两个拷贝均能够被Ms1I限制性内切酶消化，为野生型ADH2基因；若电泳结果有两个条带(其中有一条600bp左右的未被消化的条带以及一条被消化的400bp左右的条带)，则受试者的ADH2基因有一个拷贝能够被Ms1I限制性内切酶消化，一个不能够被Ms1I限制性内切酶消化，为杂合突变型ADH2基因。
基于本发明的所述试剂盒采用的是PCR来进行定量检测，所述试剂盒中还可以包括其他一些试剂，如：总DNA抽提试剂、PCR试剂、PCR产物纯化试剂、凝胶电泳试剂以及对照品中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。
所述总DNA抽提试剂可采用各种常规的抽提DNA的试剂，这些试剂可市购获得。
所述PCR试剂可采用各种常规的PCR试剂，这个试剂可市购获得。
所述PCR产物纯化试剂可采用各种常规的PCR产物纯化试剂，这个试剂可市购获得。
所述对照品包括野生型ADH2基因阳性对照样品、纯合突变型ADH2基因阳性对照样品、杂合突变型ADH2基因阳性对照样品。
所述试剂盒还包括阴性对照品，所述阴性对照品为ddH2O。
此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书，便于本领域技术人员使用。
进一步的，本发明的第二方面，还提供了一种前述试剂盒的使用方法，包括步骤：
(1)待测DNA样品的制备：采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA备用；
(2)配置PCR反应体系：将待测DNA样品、野生型ADH2基因阳性对照样品、纯合突变型ADH2基因阳性对照样品、杂合突变型ADH2基因阳性对照样品、ddH2O分别加入装有含2倍PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、野生型和突变型ADH2基因特异性扩增引物对的PCR管，并加ddH2O补足体积，盖好管盖，组成PCR反应体系；
(3)PCR扩增：对步骤(2)的PCR反应体系进行PCR扩增；
(4)PCR产物纯化：对步骤(3)所得PCR产物进行纯化；
(5)限制性内切酶消化：用Ms1I限制性内切酶对步骤(4)纯化后的PCR产物进行消化；
(6)凝胶电泳：对步骤(5)限制性内切酶消化后的产物直接进行琼脂糖凝胶电泳；
(7)结果分析：按上述条件进行检测结果判断。
较优的，步骤(1)中，所述的样本来源于受试者人体的任何含DNA的组织，包括但不限于：唾液，血液，口腔拭子等。
较优的，步骤(2)中，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5’-AGACTGAATAACCTTGGGGATAAAC-3’；反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：5’-CACTGTGTCTCTTTTGATCCTCAC-3’。
除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反应体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。
本发明的第三方面，还提供了前述试剂盒在制备ADH2基因检测试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的核心创新点在于发现了一个ADH2基因上的Ms1I限制性酶切位点，可以通过“能否被限制性内切酶消化”来判别突变型和野生型，只需要常规的PCR和凝胶电泳技术就可以实现对ADH2基因的突变位点检测。不需要额外购买测序仪、QPCR仪或芯片扫描仪，可以在大量普通的分子实验室开展检测。同时，与其它检测方法相比，本发明还有快速、便宜、稳定和准确的特点，具有全面的优势。
概括起来，本发明具有如下优势：
(1)只要基本的PCR仪和电泳设备就能完成检测，不需要依赖QPCR仪、测序仪和芯片扫描仪等设备，有利于检测的普及；
(2)步骤简单，DNA抽提、PCR、内切酶消化和凝胶电泳，都是最基本的分子生物学技术，有利于检测的稳定和标准化；
(3)成本低；
(4)周期短，能够在4个小时内完成检测。
附图说明
图1：本发明实施例2采用了9个ADH2基因型已知的样本(1～9号)进行验证，并对两个ADH2基因型未知样本(10～11)进行检测，从左自右分别代表Marker，1～11号样本样本。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1引物及限制性内切酶
根据野生型ADH2基因和突变型ADH2基因设计引物，针对突变位点在基因结构中所处的位置以及突变的特点，对于引物的序列长短、位置均作为考察的因素。本发明人经过反复比较和优化，获得以下能同时扩增野生型和突变型ADH2基因的引物对：
正向引物：5’-AGACTGAATAACCTTGGGGATAAAC-3’(SEQIDNO.1)；
反向引物：5’-CACTGTGTCTCTTTTGATCCTCAC-3’(SEQIDNO.2)。
根据野生型和突变型ADH2基因的单碱基差异位点，设计了一个Ms1I限制性内切酶，具体信息详见http://rebase.neb.com/rebase/enz/MslI.html。
Ms1I限制性内切酶的特异性识别位点如下：
5'..CAYNNNNRTG..3'
3'..GTRNNNNYAC..5'
空格处为酶切位点。
ADH2的snp位点序列如下：
GGTGGCTGTAGGAATCTGTC|RCACAGATG|ACCACGTGGTTA
若R＝A，可被酶切，若R＝G，不可被酶切。
亦即，野生型ADH2基因能够被所述限制性内切酶识别并消化，而突变型ADH2基因对所述限制性内切酶不敏感，因此不能够被识别消化。
人体内有两个ADH2基因的拷贝，分别来自父本和母本。如果两个拷贝都是野生型，则受检者为野生型；如果一个为野生型，一个为突变型，则受检者为杂合突变型；如果两个都是突变型，则为纯和突变型。
本发明首先对受试者唾液样本的基因组DNA进行抽提，然后采用上述能同时扩增野生型和突变型ADH2基因的引物对ADH2基因进行PCR扩增，在对所得PCR产物进行纯化后，用Ms1I限制性内切酶进行消化，然后将消化后的产物直接进行电泳。
本发明是通过“能否被内切酶消化”作为ADH2基因分型的依据，所以只需要观察是否存在600bp的主带或消化后的条带，即可实现分型。
若电泳结果只有一个完整的600bp左右的条带，则说明受试者的ADH2基因的两个拷贝都不能被Ms1I限制性内切酶消化，为纯合突变型ADH2基因；若电泳结果有一条被消化的400bp条带，则受试者的ADH2基因的两个拷贝均能够被Ms1I限制性内切酶消化，为野生型ADH2基因；若电泳结果有两个条带(其中有一条600bp左右的未被消化的条带以及一条被消化的400bp左右的条带)，则受试者的ADH2基因有一个拷贝能够被Ms1I限制性内切酶消化，一个不能够被Ms1I限制性内切酶消化，为杂合突变型ADH2基因。
实施例2试剂盒检测
通过本发明的ADH2基因检测试剂盒及试剂盒的使用方法，对11名实验者的样本进行ADH2基因型进行检测，具体步骤如下：
1.待测DNA样品的制备：通过基因组提取试剂盒，从分别来自于11份受试者唾液样本中提取基因组DNA备用；其中，1～9号的ADH2基因型已知样本，而10～11号为ADH2基因型未知样本。
2.配置PCR反应体系：
试剂 体积(ul)
2倍PCR缓冲液(含聚合酶和dNTP) 10ul
DNA模板(浓度为500ng/μl) 10ul
正向引物(浓度为10μM) 0.3ul
反向引物(浓度为10μM) 0.3ul
ddH2O 补足
总体积 20ul
3.PCR扩增：95℃热启动5分钟后进行40个PCR循环，解链温度95℃30秒，退火温度58℃30秒，延伸温度72℃40秒；最后一轮PCR后72℃延伸10分钟，进入4℃保存；
4.PCR产物纯化：用磁珠法对PCR产物进行回收纯化，并进行质检；
5.限制性内切酶消化：用Ms1I限制性内切酶对纯化后的PCR产物进行消化，反应体系为20μl，反应条件为37℃，反应时间为1.5个小时；
试剂 体积(ul)
2倍PCR缓冲液(含聚合酶和dNTP) 2ul
DNA模板(浓度为500ng/μl) 10ul
酶 0.5ul
ddH2O 补足
总体积 20ul
6.凝胶电泳：对限制性内切酶消化后的产物直接进行琼脂糖凝胶电泳；
7.结果分析：通过凝胶电泳所得条带的大小和数量进行ADH2基因的SNP分型。
本实验采用了9个ADH2基因型已知(通过一代测序法进行检测)的样本(1～9号)进行验证，并对两个ADH2基因型未知样本(10～11)进行检测。结果如图1所示，从左自右分别代表Marker，1～11号样本样本。具体的，1,2,3所对应条带中，没有未被酶切的600bp条带，有被酶切的400bp条带，因此，样本1,2,3中ADH2基因的SNP分型为rs1229984(A；A)，与一代测序结果一致。样本4,5,6,有未被酶切的600bp条带，也有被酶切的400bp条带，因此，样本4,5,6,中ADH2基因的SNP分型为rs1229984(A；G)，与一代测序结果一致。7,8,9样本中，有未被酶切的600bp条带，没有被酶切的400bp条带，因此，样本7,8,9中ADH2基因的SNP分型为rs1229984(G；G)，与一代测序结果一致。
待测样本10,11中，有未被酶切的600bp条带，也有被酶切的400bp条带，因此，样本10,11中ADH2基因的SNP分型为rs1229984(A；G)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种ADH2基因型检测试剂盒，包括野生型和突变型ADH2基因特异性扩增引物对以及Ms1I限制性内切酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括总DNA抽提试剂、PCR试剂、PCR产物纯化试剂、凝胶电泳试剂以及对照品中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括野生型ADH2基因阳性对照样品、纯合突变型ADH2基因阳性对照样品、杂合突变型ADH2基因阳性对照样品。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品还包括阴性对照品，所述阴性对照品为ddH2O。
6.根据权利要求1～5任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，包括步骤：
(1)待测DNA样品的制备：采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA备用；
(2)配置PCR反应体系：将待测DNA样品、野生型ADH2基因阳性对照样品、纯合突变型ADH2基因阳性对照样品、杂合突变型ADH2基因阳性对照样品、ddH2O分别加入装有含2倍PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、野生型和突变型ADH2基因特异性扩增引物对的PCR管，并加ddH2O补足体积，盖好管盖，组成PCR反应体系；
(3)PCR扩增：对步骤(2)的PCR反应体系进行PCR扩增；
(4)PCR产物纯化：对步骤(3)所得PCR产物进行纯化；
(5)限制性内切酶消化：用限制性内切酶对步骤(4)纯化后的PCR产物进行消化；
(6)凝胶电泳：对步骤(5)限制性内切酶消化后的产物直接进行琼脂糖凝胶电泳；
(7)结果分析：根据步骤(6)的检测结果进行ADH2基因型判断。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本来源于受试者的唾液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；步骤(5)所述限制性内切酶为Ms1I限制性内切酶。
9.根据权利要求1～5任一权利要求所述的试剂盒在制备ADH2基因检测试剂中的用途。
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