CN102719537A - 耐多药结核分枝杆菌非荧光dna微阵列检测方法及试剂盒 - Google Patents
耐多药结核分枝杆菌非荧光dna微阵列检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种耐多药结核分枝杆菌检测方法及试剂盒。本发明的试剂盒包括针对结核分枝杆菌利福平和异烟肼主要耐药基因核酸片段的PCR正反向扩增引物（正向扩增引物5’端有生物素标记）和寡核苷酸探针序列（5’端有氨基标记），可在一个反应单位中同时检测rpoB基因511、516、526、531和533位、katG基因315位和inhA基因-15位的突变情况。本发明的试剂盒可快速检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼主要耐药基因突变情况，且对仪器和费用要求低廉，操作简单，可应用与结核分枝杆菌的耐药基因检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种耐多药结核分枝杆菌检测方法及试剂盒，尤其涉及利福平和异烟肼耐药基因突变的DNA微阵列杂交检测方法及利用该方法制成的试剂盒。
背景技术
结核病是当今全球范围内对人类最具威胁的传染性疾病之一，20世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势。据世界卫生组织报道，我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5%，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，感染率高于全球人口1/3感染率的水平。
同时，近年来，由于抗结核药物的不规范治疗，患者体内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病，耐药结核病问题日趋严重成为结核病控制的难题之一。世界卫生组织2008年1月的调查报告显示，全球范围耐多药（NDR-TB）结核病的发病率已达到创纪录水平，全球114个国家和地区的结核病新发病例耐药率达到17.0%，多重耐药率达到2.9%。全年新发结核病例940万，死亡病例180万。同年估计有44万耐多药结核病例，15万例耐多药结核病死亡。中国是俄罗斯以外结核病耐药最严重的国家，卫生部2007～ 2008 年全国结核病耐药基线调查显示, 中国肺结核患者耐多药率为8.32%, 广泛耐药率为0.68%。
因此，结核病的快速诊断和最佳个体化治疗方案的建立仍然是结核控制中的重要挑战之一。由于结核分枝杆菌生长缓慢，如今广泛应用的耐药测定方法均是建立在菌株的基础上，虽然使用了新的液体培养基，但仍然耗时较长，推迟了获得菌株敏感型的时间。在现阶段，我国各医院广泛采用痰培养加药物敏感性实验来检测结核杆菌的耐药性，即先培养出结核杆菌，再给予抗结核药物，并观察药物抑菌效果。该法的检测结果可靠，但最大不足之处是培养条件要求高，结核杆菌生长缓慢，往往需要6-8周；同时痰培养检出率低，仅为30%，故药敏试验的检出率也仅有30%左右，不能满足临床检测需要。
随着基因诊断技术的不断发展, DNA序列测定( DNA sequenc ing )、PCR- 单链构象多态性分析( PCR- SSCP)、PCR- 限制性片段长度多态性分析( RFLP)、RNA /RNA 错配试验( RNA /RNA )、异源双链构象( HDF)、多重连接依赖的探针扩增(M LPA) 等分子生物学方法引入结核分支杆菌耐药性的诊断, 相对于传统的检测方法检测时间短, 但这些方法仍存在诸如仪器与成本上的局限性，不适合推广应用。于是，开发一种操作简单，成本低廉的快速准确诊断耐多要结核病的检测方法，对于早期发现、阻断耐药结核病的传播，规范指导用药，提高耐药结核病的治愈率具有非常重要的意义。
临床诊断要求检测方法具有简单、快速、重复性好、高通量和低成本的特点。目前已有的以纤维膜为固相支持物的反向斑点膜杂交技术途径通常采用人工点样、肉眼检测杂交结果的操作方式，不利于检测试验的均质控制。DNA微阵列（DNA microarray）又称DNA阵列或DNA芯片，是一块带有DNA微阵列（micorarray）涂层的特殊玻璃片。在经过特殊处理的玻璃基片上通过点样、原位合成等方法有序固定多条DNA序列，经由一次测验，即可提供大量序列信息，具有操作简单、快速、精确、低成本的特点，在临床诊断中已被广泛应用于人类基因SNP、等位基因及多种微生物病原体DNA的检测。根据基因突变、SNP等位点特异性，针对目的基因片段设计带有特殊标记的探针序列，在待检测位点存在一个碱基的差异。在芯片杂交过程中一个碱基的不同即可引起Tm值的大幅降低，从而使正常碱基配对探针显示阳性结果，而错配探针既成为阴性结果。基于以上技术背景，本发明将基于PCR的DNA微阵列杂交 技术成功引入到结核分枝杆菌耐药基因检测的领域中。
利福平是抗结核联合化疗中主要的一线药物。正常情况下, 利福平( RFP)与RNA 聚合酶β亚基( rpoB ) 特异性结合, 阻断RNA 的合成而起到抑制细菌生长的作用。rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB 亚基构象, 从而降低与利福平的亲和力。突变一般集中在rpoB基因的507～ 533 位的27个氨基酸密码子, 长度81bp的利福平耐药决定区(RRDR)内。
异烟肼是结核病临床治疗方案中5种一线药物中关键的一种，也是最容易出现耐药性的抗结核药物。研究表明，异烟肼耐药主要与编码过氧化氢酶-过氧化物酶的katG基因以及编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性烯酰基载体蛋白还原酶的inhA基因的启动子基因突变相关。其中突变频率最高的是katG 315位点以及inhA -15位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PCR扩增的结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变的DNA微阵列检测方法及检测试剂盒。
本发明提出的基于PCR扩增的快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药相关基因突变的非荧光DNA微阵列检测方法，扩增3个结核耐药相关基因相应DNA序列的PCR体系和同时检测所述耐药相关基因相应点突变的DNA微阵列杂交体系；
所述的3个结核分枝杆菌耐药相关基因是rpoB、inhA和katG基因，所述基因区域中的突变包括：rpoB基因511、516、526、531、533位点，katG基因315位点和inhA基因-15位点；具体步骤如下：
（1）设计针对3个基因的3对特异性扩增引物，应用dUTP-UNG酶系统，采用PCR扩增体系进行扩增，得到相应3个基因目的DNA；
（2）采用DNA微阵列杂交体系检测结核分枝杆菌rpoB、inhA和katG基因突变情况；
其中，反向扩增引物5 ‘端作生物素标记，引物序列及其扩增产物包含的突变位点如表1所示：
表1 引物序列及扩增产物信息
本发明中，所述PCR扩增体系及反应条件如表2和表3所示。
表2 PCR扩增体系：
| PCR体系，rpoB/katG/inhA | 体积，单位μL |
| 10×PCR缓冲液 | 5 |
| dNTP， 2μM | 1 |
| 正向引物，10μM | 1 |
| 反向引物，10μM | 3 |
| Taq酶，5U/μL | 0.5 |
| MgCl2溶液，25μM | 3 |
| UNG酶，5U/μL | 0.1 |
| dUTP，2μM | 0.25 |
| 模板DNA | 2 |
| 水 | 34.15 |
| 总体积 | 50 |
表3 PCR反应条件
本发明中，所述DNA微阵列杂交体系中用于检测相关基因突变的探针 5’端作氨基修饰，探针序列信息如表4所示：
表4 探针信息
相应于所述检测方法的检测试剂盒，包括：
（1）3对扩增引物：如表1所示；
（2）dUTP-UNG酶系统的PCR扩增体系，如表2所示；
（3）DNA微阵列杂交体系中用于检测相关基因突变的探针 5’端经氨基修饰，探针序列信息如表4所示。
所述检测试剂盒的制备步骤如下：
1、基片制备：芯片固相支持物采用可自行制备或通过商业途径获得的经醛基修饰的玻片或硅片。
2、探针合成、标记与芯片点样： 针对rpoB、katG和inhA基因多态性位点设计并合成16条寡核苷酸探针，分别与结核分枝杆菌基因组DNA rpoB基因511、516、526、531、533位点、katG基因315位点和inhA基因-15位点附近野生型及常见突变型序列完全互补，探针长度在13～19个碱基之间。根据结核分枝杆菌16SrDNA特异性序列设计一条监控探针（结核分枝杆菌监控探针）（P0），用于检测样本中结核分枝杆菌的存在情况。探针的5’端进行氨基修饰。将各寡核苷酸探针配制成溶液，之后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片表面，排列成预定的序列或阵列，然后放置3小时以固定，即可得到本发明的基因芯片。阵列中各探针应至少保证3个以上重复点。探针序列如表4所示。
在芯片点样制备过程中，需要进行用于监控杂交显色反应的标识列探针，该探针属于上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒的组成部分。
3、结核分枝杆菌基因组DNA获取： 结核分枝杆菌基因组DNA的获取可根据处理对象区分为二:（1）以临床样本分离株为样品提取基因组DNA：菌体80℃灭活2h，可使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒进行样本DNA的提取，也可使用实验室常规细菌基因组DNA抽提方法提取。取得的基因组DNA可直接作为PCR反应模板用于后续技术方案中的进一步操作，也可-20℃储存备用。（2）以临床取得的痰液为样品提取基因组DNA： 痰液2mL，加入2.5倍体积4%NaOH, 37℃温浴30min。将液化后的痰液离心去上清。所得沉淀可使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，或使用实验室常规细菌基因组DNA抽屉方法提取。取得的基因组DNA可直接作为PCR反应模板用于后续技术方案中的进一步操作，也可-20℃储存备用。
4、引物合成与PCR反应： 设计3对特异性引物，分别扩增rpoB基因RRDR区域及附近、katG基因315位点附近和inhA基因-15位点附近的结核分枝杆菌基因组DNA，并且相互之间没有干扰。有关引物设计的方法、软件和引物的合成均可从商业途径获得。用PCR方法扩增基因组DNA特定片段的方法已经是本领域公知技术。本发明涉及的结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因相关片段的扩增可采用不对称PCR方式以获得丰度较高的单链PCR产物，为尽可能降低污染，本发明涉及的PCR扩增体系中引入了dUTP-UNG酶。引物序列如下：
rpoB基因：
正向引物： rpoB-F： 5’-GTGGTCGCCGCGATCAAGG-3’ （SEQ ID NO:18）
反向引物： rpoB-R： 5’- Biotin-GTTTCGATCGGGCACATCC-3’ (SEQ ID NO:19）
katG基因：
正向引物： katG-F： 5’-CGCTGCCCAGAAAGGGAT-3’ （SEQ ID NO:20）
反向引物： katG-R： 5’- Biotin-GACTGAACGGGATACGAATGG -3’（SEQ ID NO:21）
inhA基因：
正向引物： inhA-F： 5’- GATGGGCTTGGGCTGGAA-3’ （SEQ ID NO:22）
反向引物： inhA-R： 5’- Biotin-AGCCGTACAGGATCTCGAGGAA -3’（SEQ ID NO:23）。
5、PCR扩增产物的标记： 对扩增产物进行标记采用5’端带标记基团的引物进行扩增的方法，所述标记基团为生物素分子（Bio），5’端带有生物素标记的引物通过商业途径合成。本发明涉及的反向引物rpoB-R、katG-R、inhA-R 5’端带有生物素标记。
6、扩增产物的变性与杂交显色：
带标记的扩增产物与基因芯片杂交前，先将扩增产物变性。可采用常规变性方法变性PCR扩增产物。此类方法例如将扩增产物加热至98℃，保温10min并迅速置于冰上。本发明所涉及的芯片杂交信号显示方法为基于链亲和素标记的碱性磷酸酶（AP酶）催化的四氮唑蓝和BCIP或四甲基联苯胺（TMB）的显色反应。本发明所涉及的扩增产物与基因芯片之间的固相杂交采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行，所述芯片杂交试剂盒包含：预杂交液，杂交缓冲液，洗液1，反应舱，标识列探针；所述芯片显色试剂盒包含：抗体液，洗液2，洗液3，显色液。
7、芯片扫描、信号输出与结果判读
将杂交显色洗涤完毕的芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪中（BSE01021，上海百傲科技有限公司）扫描输出图像与数字信号。信号扫描与输出由 扫描程序完成，输出点阵信号图与信号强度表数据文件。检测结果可通过点阵信号图直接判读，信号强度表为其数值依据；具体地，信号强度表中用于检测反应正常进行的标识列探针信号均值达到80以上表示微阵列杂交显色反应正常，反之表示杂交显色反应出现异常，结果无效；各位点探针信号阳性判定阈值为10，即：当某探针各重复探针点杂交信号均值达到10，即判定所检测样本DNA含有该探针所对应基因型，检测结果为阳性，否则为阴性。针对同一位点的不同探针同时检测为阳性则表示所检测样本DNA在该位点存在1种以上基因型。
本发明的优点：使用一张芯片，一次试验同时完成结核菌利福平和异烟肼两种药物耐药性突变位点的检测，操作方便快捷，对仪器、试剂要求低；可使用常规扩增、杂交和显色体系完成检测，大大降低了检测成本；扩增体系中使用dNTP-UNG酶，杂交、显色反应可做到完全封闭反应，有效降低了污染；利福平和异烟肼两种药物耐药性主要突变均有对应的野生、突变型探针，检测结果清晰准确，准确显示突变类型特征；检测结果同时以图象信号与数字信号形式输出，便于监测与质量控制；检测反应在6小时内完成，极大地节省了时间。
附图说明
图1是本发明芯片阵列图，每一个单元格表示三个重复的点。其中，左起前三列为试剂盒自带的标识列探针，用以监控显色反应并确定芯片扫描位置；芯片阵列中每个单元格代表同一探针的3个重复。
图2是本试剂盒检测WH27号菌株中rpoB、inhA和katG基因相关突变情况的点阵显色信号结果，显示该样本rpoB基因531位点发生了TCG -> TTG突变，其他位点为野生型。
图3是本试剂盒检测WH57号菌株中rpoB、inhA和katG基因相关突变情况的点阵显色信号结果，显示该样本rpoB基因516位点发生了GAC -> GTC突变、katG基因315位点发生了AGC-> ACC突变，其他位点为野生型。
图4是本试剂盒检测WH34号菌株中rpoB、inhA和katG基因相关突变情况的点阵显色信号结果，显示该样本511位点发生了CTG -> CCG突变，526位点发生了CAC -> AAC突变，katG基因315位点发生了AGC-> ACC突变，其他位点为野生型。
具体实施方式
实施例1：探针合成与基因芯片的制备
购置醛基修饰的载玻片。设计16条寡核苷酸探针，探针的5’端进行氨基修饰，委托 相关公司合成探针。合成好的探针稀释为100μM浓度的水溶液，与2×点样缓冲液（上海百傲科技有限公司产品）等比混合。使用Affymetrix公司的点样仪按照说明书所述方法点制芯片阵列，室温放置3小时备用。探针信息如表4所示。
实施例2：结核分枝杆菌基因组DNA的提取
（1）取经培养后鉴定为结核分枝杆菌阳性的临床样本分离株作为样品，菌体80℃灭活2h，使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒进行样本DNA的提取，取得的基因组DNA可直接作为PCR反应模板，也可-20℃储存备用。
（2）取临床取得的痰液2mL，加入2.5倍体积4%NaOH, 37℃温浴30min。液化后的痰液离心去上清。所得沉淀用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，取得的基因组DNA可直接作为PCR反应模板或-20℃储存备用。
实施例3：引物合成、PCR反应与产物标记
从NCBI数据库下载结核分枝杆菌rpoB基因、katG基因和inhA基因启动子序列，使用Primer Priemer 5 软件设计正反向引物并委托捷瑞生物进行合成（反向引物rpoB-R、katG-R、inhA-R 5’端带有生物素标记）,引物信息如表1所示。
将合成好的引物用水溶解并稀释至10μM。将一对正向与反向引物和Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP、UNG酶、dUTP、MgCl2溶液、纯水及实施例2获取的扩增模板混合配制成针对rpoB/katG/inhA基因目的片段的PCR扩增体系。PCR扩增体系配方如下：
| PCR体系（rpoB/katG/inhA） | 体积（μL） |
| 10×PCR缓冲液 | 5 |
| dNTP（2μM） | 1 |
| 正向引物（10μM） | 1 |
| 反向引物（10μM） | 3 |
| Taq酶（5U/μL） | 0.5 |
| MgCl2溶液（25μM） | 3 |
| UNG酶（5U/μL） | 0.1 |
| dUTP（2μM） | 0.25 |
| 模板DNA | 2 |
| 水 | 34.15 |
| 总体积 | 50 |
使用PCR仪按以下程序扩增：
扩增产物4℃保存备用。
实施例4：生物素标记的PCR产物与基因芯片的杂交
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行杂交试验。反应步骤如下：
（1）将实施例3中的扩增产物加热至98℃，保温10min，迅速置于冰上10min以完成变性。
（2）将实施例1制备的基因芯片贴上反应舱，加入41℃预热的预杂交液600mL，41℃静置预杂交5min，除去反应舱中液体。
（3）取变性后的PCR产物20μL，与180μL41℃预热的杂交缓冲液混合均匀，加入反应舱，41℃静置杂交30min。除去反应舱中溶液。
（4）向反应舱中加入41℃预热的洗液1 600mL，41℃静置5min，除去反应舱中溶液；重复该步骤1次。
（5）向反应舱中加入洗液2 800mL，室温静置5min，除去反应舱中溶液；重复该步骤1次。
（6）向反应舱中加入抗体液200μL，室温静置20min，除去反应舱中溶液。
（7）向反应舱中加入洗液2 800mL，室温静置5min，除去反应舱中溶液；重复该步骤1次。
（8）向反应舱中加入洗液3 600mL，室温静置5min，除去反应舱中溶液；重复该步骤1次。
（9）向反应舱中加入显色液，41℃避光静置30min，除去反应舱中溶液。
（10）将反应舱揭去，纯水冲洗芯片显色区域，烘干。
实施例5：芯片杂交信号的检测与结果判读
将洗涤完毕的芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪（BSE01021，上海百傲科技有限公司）中，运行扫描程序输出点阵信号图及信号强度表，判定检测结果。
实施例6：使用本发明试剂盒检测临床分离的结核分枝杆菌菌株中利福平及异烟肼耐药基因突变
为检测本发明试剂盒检测结核分枝杆菌菌株利福平及异烟肼耐药基因突变的准确性和有效性，使用本试剂盒对12例临床样品进行了检测，以判断rpoB、katG和inhA基因相关位点是否发生突变。12例临床分离菌株通过实施例二中所述方法获取PCR反应模板，而后用实施例3中所述PCR反应体系及程序扩增、实施例4中所述反应程序杂交显色、实施例5中所述程序输出检测数据及实施例6中结果判读方法进行检测。将使用本发明方法及试剂盒获取的检测结果与测序方法的检测结果比较，以鉴定本发明的检测方法及试剂盒的临床诊断的有效性。
表5 结核分枝杆菌临床分离株基因组DNA样本相关基因测序法与DNA微阵列法检测结果比较
注：W表示野生型。
表5结果表明，本发明的DNA微阵列检测方法及试剂盒对12例临床标本检测结果与测序法（金标准）比较，准确率为100%。
以上所述可以说明：本发明涉及的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒与方法可简捷准确地检测出与利福平、异烟肼两种药物耐药性相关的主要基因位点突变，作为检测结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼基因的检测工具，在耐药结核的诊断和监控中可发挥重要作用。
序列表
<110>复旦大学 上海百傲科技有限公司
<120>耐多药结核分枝杆菌非荧光DNA微阵列检测方法及试剂盒
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<213>Mycobacterium tuberculosis
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<223> inhA-R
<400>23
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Claims (4)
1.一种基于PCR扩增的快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药相关基因突变的非荧光DNA微阵列检测方法，其特征在于扩增3个结核耐药相关基因相应DNA序列的PCR体系和同时检测所述耐药相关基因相应点突变的DNA微阵列杂交体系；
所述的3个结核分枝杆菌耐药相关基因是rpoB、inhA和katG基因，所述基因区域中的突变包括：rpoB基因511、516、526、531、533位点，katG基因315位点和inhA基因-15位点；具体步骤如下：
（1）设计针对3个基因的3对特异性扩增引物，应用dUTP-UNG酶系统，采用PCR扩增体系进行扩增，得到相应3个基因目的DNA；
（2）采用DNA微阵列杂交体系检测结核分枝杆菌rpoB、inhA和katG基因突变情况；
其中，反向扩增引物5’端作生物素标记，引物序列及其扩增产物包含的突变位点如表1所示：
表1 引物序列及扩增产物信息
2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系及反应条件如下：
表2 PCR扩增体系：
表3 PCR反应条件
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA微阵列杂交体系中用于检测相关基因突变的探针 5’端作氨基修饰，探针序列信息如表4所示：
表4 探针信息
4.一种基于如权利要求3所述检测方法的检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）3对扩增引物：SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；
（2）dUTP-UNG酶系统的PCR扩增体系：
（3）DNA微阵列杂交体系中用于检测相关基因突变的探针 5’端经氨基修饰，探针序列信息如下表所示：
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