CN114540524A - 一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于结核分枝杆菌及利福平耐药位点的数字PCR检测试剂盒。本发明提供了用于结核分枝杆菌核酸及利福平耐药位点的数字PCR检测试剂盒，该试剂盒靶向检测结核分枝杆菌核酸，通过数字PCR技术来检测结核分枝杆菌rpoB基因的511突变位点、516突变位点、526突变位点、531突变位点和533突变位点。本发明基于非竞争性探针的设计理念，通过检测利福平耐药基因rpoB来确定样品中是否含有结核菌核酸，以及是否含有利福平耐药位点。

Description

一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字PCR检测试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB)，俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，是引起结核病的病原体。结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。
1998年，随着MTB标准菌株H37Rv全基因组序列的破译，人们对结核菌的研究从表型深入到基因水平，MTB对一线药物的分子耐药机制成为国内外研究的热点，研究者发现MTB耐药性的产生主要与相关基因发生突变有关。一线药物中，利福平(RIF)耐药机制阐释的较为完全，研究发现约95％的RIF耐药性产生与MTB编码RNA聚合酶β亚基基因(即rpoB基因)特定区域发生突变有关。
目前结核菌常用的诊断方法包括结核菌素试验、细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验、标本直接涂片或集菌后涂片检测、病原菌分离培养、PCR检测等。数字PCR技术是一种核酸分子的绝对定量技术，其检测需要的时间短，且样品需求量低，检测灵敏度高。如能将数字PCR技术应用于结核分枝杆菌的检测以及耐药位点的检测，则可大幅提高检测效率，及早确定治疗方案。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于结核分枝杆菌及利福平耐药性的数字PCR检测试剂盒。
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌及利福平耐药性的数字PCR检测试剂盒，其包括靶向结核分枝杆菌rpoB基因内参的引物和探针，和靶向结核菌利福平耐药位点的探针。
本发明中，所述结核菌利福平rpoB基因的耐药位点，包括511突变位点、516突变位点、526突变位点、531突变位点和533突变位点。
靶向所述rpoB基因的2条引物的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明中，以靶向rpoB基因的引物为通用引物，分别设计利福平耐药决定区(RRDR)的511位点的野生型探针、516位点的野生型探针、526位点的野生型探针、531位点的野生型探针和533位点的野生型探针，分别采用不同荧光修饰；同时在扩增子内部设计一条rpoB的探针，作为结核菌的鉴定探针。
其中，511位点存在一种突变型，其为CCG，516位点存在3种突变型，分别为GGC、GTC、TAC，526位点存在4种突变型，分别为CGC、GAC、TAC、CTC，531位点存在2种突变型，分别为TGG和TTG，533位点存在一种突变型，其为CCG。
靶向所述结核分枝杆菌的探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
靶向所述511位点野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
靶向所述516位点野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
靶向所述526位点野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
靶向所述531位点野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
靶向所述533位点野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明所述探针的两端分别修饰荧光基团和淬灭基团。本发明探针修饰的荧光基团和淬灭基团设置合理，在进行多重检测时，彼此间不产生干扰。
所述如SEQ ID NO:3所示探针的两端分别修饰CY7基团和BHQ3基团；
所述如SEQ ID NO:4所示探针的两端分别修饰FAM基团和MGB基团；
所述如SEQ ID NO:5所示探针的两端分别修饰VIC基团和BHQ1基团；
所述如SEQ ID NO:6所示探针的两端分别修饰ROX基团和BHQ2基团；
所述如SEQ ID NO:7所示探针的两端分别修饰CY5基团和MGB基团；
所述如SEQ ID NO:8所示探针的两端分别修饰CY5.5基团和BHQ3基团。
本发明所述的数字PCR检测试剂盒中，还包括外源内参的引物和探针。
本发明以IC基因作为检测的外源内参。
一些实施例中，所述外源内参的2条引物的核酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示。
一些实施例中，所述外源内参的探针的核酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明所述如SEQ ID NO:11所示探针的两端分别修饰A425基团和BHQ1基团。
一些实施例中，本发明所述的数字PCR检测试剂盒中还包括数字PCR反应试剂，所述数字PCR反应试剂包括ddPCR Mix和水。
本发明还提供了非诊断目的检测结核分枝杆菌及利福平耐药位点的方法，包括以本发明所述的数字PCR检测试剂盒对样品进行检测。
本发明提供的数字PCR检测试剂盒不仅能够实现对人体或动物体样本进行检测，还能够对来自环境的样本进行检测，例如实验室物品、生活用品、动物饲料、土壤和/或水样。
本发明检测方法中，所述样品经前处理提取获得基因组DNA。
一些实施例中，所述检测的反应体系包括：
Figure BDA0003578566900000031
一些实施例中，所述检测的反应的程序包括98℃5min；然后98℃15s，60℃1min，40个循环。
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌及利福平耐药性的数字PCR检测试剂盒，该试剂靶向结核分枝杆菌的利福平耐药基因rpoB，以及rpoB基因的511野生型位点、516野生型位点、526野生型位点、531野生型位点和533野生型位点。本发明基于非竞争性探针的设计理念，可以检测样品中是否含有结核菌核酸，以及是否含有利福平的耐药位点。
附图说明
图1示rpoB基因RRDR区域的引物探针。
具体实施方式
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字PCR检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
>RPOB野生型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGcggtctgtcacgtgagcgtgccgggCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>511CCG突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCCGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>516GGC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGGCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>516GTC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGTCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>516TAC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGTACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>526CGC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCCATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCGCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>526GAC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>526TAC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCAAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>526CTC突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCTCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>531TGG突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTGGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>531TTG突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTTGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>533CCG突变型
AGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGcgatcaaggagttcttcggcACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCCGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCacccgtcgcactacggcCGGAT
>IC
GGCTTTCGTATTTGCTGCTCGTCTATACTTTCACAATCTTGACCTGCACGGCAAAGAGACgcttcttgtggagctcgacaaCGCAACAAcgcgacggatctacgtcacagcgAGTATAGtgaaaacgaagttgctgacggCGGAAGCGACATAGGGAT
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
采用rpoB基因作为结核菌的检测位点，并对结核菌耐药位点：511野生型位点、516野生型位点、526野生型位点、531野生型位点和533野生型位点进行检测。通过计算每个位点检测值与rpoB基因内参检测值的比值来判定样品中是否含有结核菌DNA以及利福平的耐药位点。
1、引物探针设计
依据结核菌耐药决定区(RRDR)序列，设计相应位点的的野生型探针。具体信息如下：
Figure BDA0003578566900000071
2、数字PCR扩增体系
15*rpoB引物探针混合液
Figure BDA0003578566900000072
Figure BDA0003578566900000081
ddPCR反应体系
试剂 体积(μL) 终浓度
水 <u>9</u>
5*ddPCR Mix 3 1*
15*rpoB 1 1*
IC 1
模板<u>DNA</u> 1
合计 15
3、扩增程序
98℃5min【98℃15s，60℃1min】*40
4、结果如下表(检测值单位：copies/μL)
Figure BDA0003578566900000082
Figure BDA0003578566900000091
比值计算
Figure BDA0003578566900000092
Figure BDA0003578566900000101
检测空白对照，除外源性内参A425有检测值，其他通道均无检测值。
检测野生型模板，FAM/VIC/ROX/CY5/CY5.5/CY7/A425均有检测值，且FAM/CY7，VIC/CY7，ROX/CY7，CY5/CY7，CY5.5/CY7的比值都为1。
检测一种511突变型模板，VIC/ROX/CY5/CY5.5/CY7/A425均有检测值，且VIC/CY7，ROX/CY7，CY5/CY7，CY5.5/CY7的比值都为1，FAM无检测值。
检测三种516突变型模板，FAM/ROX/CY5/CY5.5/CY7/A425均有检测值，且FAM/CY7，ROX/CY7，CY5/CY7，CY5.5/CY7的比值都为1，VIC无检测值。
检测四种526突变型模板，FAM/VIC/CY5/CY5.5/CY7/A425均有检测值，且FAM/CY7，VIC/CY7，CY5/CY7，CY5.5/CY7的比值都为1，ROX无检测值。
检测两种531突变型模板，FAM/VIC/ROX/CY5.5/CY7/A425均有检测值，且FAM/CY7，VIC/CY7，ROX/CY7，CY5.5/CY7的比值都为1，CY5无检测值。
检测一种533突变型模板，FAM/VIC/ROX/CY5/CY7/A425均有检测值，且FAM/CY7，VIC/CY7，ROX/CY7，CY5/CY7的比值都为1，CY5.5无检测值。
综合上述，本发明提供的引物和探针能够准确对模拟样本进行检测，检测结果与预期完全相符，说明本检测体系的准确性正常；三个重复的检测值基本一致，说明检测体系的稳定性也较好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字PCR检测试剂盒
<130> MP21034552
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgatcaaca tccggccg 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgatgttggg cccctca 17
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggtctgtca cgtgagcgtg ccggg 25
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagccagctg agc 13
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcgggttg ttctggtcca tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggggttga cccacaagcg 20
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcgccgac agt 13
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgtcggcgc tggggcc 17

Claims (10)

1.一种用于结核分枝杆菌及利福平耐药位点的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包括靶向结核分枝杆菌rpoB基因的引物和探针以及利福平耐药位点的探针；
所述结核菌利福平耐药位点包括511突变位点、516突变位点、526突变位点、531突变位点和533突变位点。
2.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，
靶向所述rpoB基因的2条引物的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
靶向所述结核分枝杆菌rpoB基因的探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，
靶向所述511野生型位点的探针的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，
靶向所述516野生型位点的探针的核酸序列如SEQ ID NO:5所示，
靶向所述526野生型位点的探针的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，
靶向所述531野生型位点的探针的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，
靶向所述533野生型位点的探针的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求2所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述如SEQ ID NO:3所示探针的两端分别修饰CY7基团和BHQ3基团；
所述如SEQ ID NO:4所示探针的两端分别修饰FAM基团和MGB基团；
所述如SEQ ID NO:5所示探针的两端分别修饰VIC基团和BHQ1基团；
所述如SEQ ID NO:6所示探针的两端分别修饰ROX基团和BHQ2基团；
所述如SEQ ID NO:7所示探针的两端分别修饰CY5基团和MGB基团；
所述如SEQ ID NO:8所示探针的两端分别修饰CY5.5基团和BHQ3基团。
4.根据权利要求1～3任一项所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒中还包括外源内参的引物和探针，
所述外源内参的2条引物的核酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
所述外源内参的探针的核酸序列如SEQ ID NO:11所示。
5.根据权利要求4所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述如SEQ ID NO:11所示探针的两端分别修饰A425基团和BHQ1基团。
6.根据权利要求1～5任一项所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR反应试剂，所述数字PCR反应试剂包括ddPCR Mix和水。
7.非诊断目的检测结核分枝杆菌及其耐药位点的方法，其特征在于，包括，以权利要求1～6任一项所述的数字PCR检测试剂盒对样品进行检测。
8.根据根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品经前处理提取获得基因组DNA。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测的反应体系包括：
Figure FDA0003578566890000021
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测的反应的程序包括98℃5min；然后98℃15s，60℃1min，40个循环。
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