CN111394487A - 用于检测结核杆菌及其耐药性的方法 - Google Patents

用于检测结核杆菌及其耐药性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其包括使预混液和油在微滴发生器内生成含有众多微滴的反应体系，然后在能够进行PCR反应的条件下处理反应体系，随后使处理后的反应体系中各微滴依次分别通过双色检测器来检测荧光，基于获得的荧光信号检测结核杆菌及其耐药性。本发明的检测方法具有更高的检测灵敏度和准确性，可以快速鉴别结核分枝杆菌及其耐药性。

Description

用于检测结核杆菌及其耐药性的方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体地涉及用于检测结核杆菌及其耐药性的方法。
背景技术
耐药结核病是当今世界非常严峻的公共卫生问题，它直接影响着全球结核病疫情的控制。耐药结核病是指病原体对抗结核药物产生了耐受性的疾病状态，抗结核药物的出现几乎与耐药结核病相伴而生，随时间推移和新药的应用，病原体耐药性不断提高，导致了结核病的难以控制。根据体外药物敏感性试验(drug sensitivity test,DST)结果，通常可将耐药分为单耐药(monoresistance，MR)、多耐药(耐2种以上药物但不同时包括异烟肼、利福平)结核病。在所有抗结核药物中，异烟肼和利福平是目前最佳核心药物，一旦对它们耐受，就意味着结核病的治疗陷入困境。
耐药结核病的诊断主要是通过实验室检测进行，主要有以下三种方法。
第一种为分离培养方法。作为传统方法，适用于所有结核杆菌及其他病原体。但其耗时长，费工费力，操作需要准确的菌量和培养基的药物浓度匹配，其在国内各医院的使用受到易得性、准确性、可重复性、标准化的限制，其结果对指导临床治疗作用有限。
第二种为基因检测方法。结核杆菌基因突变是其耐药的分子机制，如耐异烟肼的katG和inhA基因，耐利福平的rpoB基因，耐链霉素的rpsL和rrs基因，耐吡嗪酰胺的pncA基因，耐乙胺丁醇的embA、embB和embC基因，以及耐氟喹诺酮的gyrA和gyrB基因等。一旦基因突变，其药物作用的靶位结构就发生了相应的变化，直接影响着药物疗效。许多基因检测技术已经成为临床鉴定的重要步骤得以推广应用，与传统分离比较，检测周期大大缩短了，提高了利福平耐药性检出效率，在国内以及许多结核病高负担国家已经逐渐被接受。
第三种方法为荧光PCR法。利用实时荧光定量PCR技术检测结核杆菌核酸，时间上较以上两种方法要快，受限于检测灵敏度，易出现假阳性和假阴性的结果。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于检测结核杆菌及其耐药性的方法。本发明的方法可以定量鉴别结核杆菌，同时检测其是否发生了耐药突变。
具体地，用于检测结核杆菌及其耐药性的方法包括使预混液和油在微滴发生器内生成含有众多微滴的反应体系，然后在能够进行PCR反应的条件下处理反应体系，随后使处理后的反应体系中各微滴依次分别通过双色检测器来检测荧光，基于获得的荧光信号检测结核杆菌及其耐药性。其中，所述反应体系的预混液包含引物对、探针组和来源于样品的模板，所述探针组中各探针分别具有不同的荧光基团，且各探针的靶序列不同，这些靶序列中分别一部分靶序列位于第一靶基因位，至少一部分靶序列位于第二靶基因内，各探针与靶序列完全互补。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，反应体系包含5000至50000个体积为0.5-3nL的微滴，且各微滴分别包含引物对和由两条探针组成的探针组。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，所述方法包括生成第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系，且第一反应体系包含第一引物对和第一探针组，第二反应体系包含第一引物对和第二探针组，第三反应体系包含第一引物对、第二引物对和第三探针组，其中：第一引物对用于扩增第一靶基因的序列，第二引物对用于扩增第二靶基团的序列，第一探针组和第二探针组中的各探针的靶序列分别位于第一靶基因内，而第三探针组中的一条探针的靶序列位于第一靶基因内，另一条探针的靶序列位于第二靶基因内。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，所述第一基因为利福平耐药基因，所述第二基因为多拷贝保守基因。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，第一靶基因内的不同靶序列分别对应不同的耐药位点。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，第一探针组的探针如SEQ ID No.1和2所示，第二探针组的探针如SEQ ID No.3和4所示，第三探针组的探针如SEQ ID No.5和6所示，所述第一引物对的序列如SEQ ID No.7和8所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID No.9和10所示。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，所述反应体系中模板的拷贝数控制为小于微滴数以下。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，各反应体系为20μL，引物对浓度为0.3μM，探针总浓度为0.25μM，模板拷贝数在20000以下。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，所述PCR反应条件为：95℃/10min，(94℃/30s，58/60s)×40，98℃/10min，12℃保持。
根据本发明的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，优选地，第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系中包含来源于相同样品的模板。
本发明的检测方法具有更高的检测灵敏度和准确性，可以快速鉴别结核分枝杆菌及其耐药性，例如利福平耐药性。现有基于PCR的检测方法难以检测到低拷贝数的模板。而本发明的方法通过多个独立反应体系，每个反应体系在在分割的数万个微滴进行扩增和检测，保证了个位数的模板数量都可以被检测到。
另外，本发明的方法无需标准品，通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来。此外，本发明的方法使模板和抑制物分配到不同的体系，从而显著降低了抑制物的干扰。本发明的PCR检测的是终点荧光，即使微体系稍微受到了影响，也不会影响最终结果的判读。
附图说明
图1人工克隆质粒的检测信号图。
图2临床分离培养提取的耐药结核分枝杆菌DNA的检测信号图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中的反应体系是指用于进行PCR扩增反应的体系，在反应体系中含有众多微滴。微滴的数量不特别限定，一般而言，在20μL预混液和油的混合物中，包含5000至50000个微滴，优选10000-30000个微滴，更优选10000-20000个微滴。微滴的体积也不特别限定，一般可以控制为0.5-5nL，优选1-3nL，更优选1.5-2nL。通过控制预混液中模板的数量和微滴的数量，可以控制每个微滴内模板的数量，例如可以使每个微滴内模板数为1以下。例如，在20μL反应体系内，通过微滴发生器控制微滴数量为20000个，同时控制反应体系内模板的拷贝数为20000个以下。微滴使反应体系分割为众多独立单元。每个独立单元内可以进行独立的PCR反应。
本发明的检测方法中，反应体系可以是多个，每个反应体系需要包含模板、引物对和探针组。不同反应体系中除了模板为样品来源的相同模板外，引物对和/或探针组不同。本发明中，至少一个反应体系内部需包含针对第二靶基因的引物对和探针组。第二靶基因为用于定性结核杆菌是否存在的基因。优选地，第二靶基因为结核杆菌基因组内多拷贝基因。还优选地，第二靶基因为结核杆菌基因组的保守区。需要说明的是此处的多拷贝基因不一定为编码蛋白质的基因，例如可以是IS6110区序列。
在某些实施方案中，本发明的方法还可以进一步另外的反应体系，其内部包含针对第一靶基因的引物对和探针组。第一靶基因为耐药性相关基因，例如rpoB基因，其中靶序列优选位于核心耐药区。
本发明的探针组包含多个探针。例如每个探针组可以由第一探针和第二探针组成。第一探针和第二探针的靶序列不同，并且每个探针对应于一种突变信息，且第一探针和第二探针与野生型结核杆的对应靶序列完全互补，即100％完全互补。优选地，第一探针的靶序列与第二探针的靶序列不存在重叠。另外，第一探针和第二探针需具有不同的荧光基团，从而能够产生不同的荧光信号。只要能够产生不同的荧光信号，则不特别限定第一探针和第二探针的荧光基团的类型。本发明的荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素；基于罗丹明的荧光团，例如ROX(6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5。本发明还可使用其他荧光素，例如具有不同发射光谱的荧光素，如NED和JOE。可使用其他荧光基团，例如Alexa、Atto、Dyomics、Dyomics Megastokes和Thilyte染料家族中的荧光基团。
实施例
一、实验材料
人工克隆的带有结核杆菌IS6110区序列和突变的rpoB核心耐药区序列的质粒；临床分离培养提取的耐药结核分枝杆菌DNA。
二、实验方法
1.检测原理：
整个检测体系由三个独立的反应体系(well 1、well 2、well 3)组成，三个反应体系检测同一个样本，每个孔位由一对或两对引物、两条不同荧光标记的探针完成检测，三个孔位均能检测耐药突变，并且well 3在检测耐药突变的同时也检测了IS6110区域。当一个位点产生耐药突变时，覆盖该位点的探针无法结合到模板DNA链上，从而导致信号值降低，最终体现为探针覆盖区域检测到的拷贝数下降。
每个反应体系中可同时检测IS6110区和检测rpoB区。其中，引物及探针信息如表1所示。各反应体系中的引物的探针组成如表2所示。
表1
编号 序列
SEQ ID No:1 5’-FAM-CCAGCGCCGACAG-MGB-3’ rpoB P1
SEQ ID No:2 5’-HEX-TTGACCCACAAGCG-MGB-3’ rpoB P2
SEQ ID No:3 5’-FAM-AACCCCGACAGCG-MGB-3’ rpoB P3
SEQ ID No:4 5’-HEX-CCAATTCATGGACCAGA-MGB-3’ rpoB P4
SEQ ID No:5 5’-HEX-AGCTGGCTGGTGCC-MGB-3’ rpoB P5
SEQ ID No:6 5’-FAM-ACACATAGGTGAGGTCTG-MGB-3’ IS6001 P6
SEQ ID No:7 5’-GTCGCCGCGATCAAGG-3’ rpoBF
SEQ ID No:8 5’-GACAGACCGCCGGGC-3’ rpoBR
SEQ ID No:9 5’-GGTGACAAAGGCCACGTAGG-3’ IS6001F
SEQ ID No:10 5’-TCGGACCACCAGCACCTAAC-3’ IS6001R
表2
反应体系 引物及探针组成
Well 1 1、2、7、8
Well 2 3、4、7、8
Well 3 5、6、7、8、9、10
具体步骤如下：
1.配制反应液：将引物、探针、DNA模板、ddPCR supermix配制成20μl反应液，加入到Bio-Rad Droplet Digital PCR仪的微滴发生卡。
2.制备微滴：将微滴发生卡放入微滴生成器，在2.5分钟内将每个20ul反应液分成20000个微滴。
3.PCR扩增：将微滴转移到96孔PCR板上，于PCR仪上进行扩增。每个反应体系的配置(终浓度)如下：Bio-Rad Droplet Digital PCR master mix，正向引物：0.3uM，反向引物：0.3uM，探针：0.25uM，检测模板拷贝数控制在20000以下。
扩增程序：95℃/10min，(94℃/30s，58/60s)×40，98℃/10min，12℃/hold。
4.检测微滴：将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器。
5.分析数据：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，利用软件记录每个反应体系中阳性微滴的比例。
6.结果显示：利用软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果。
三、实验结果
1.人工克隆的带有结核杆菌IS6110区序列和突变的rpoB核心耐药区序列的质粒检测结果
使用Bio-Rad Droplet Digital PCR仪检测的信号图如图1所示。表3示出了实验过程中的数据。
表3
Figure BDA0002445350750000081
2.临床分离培养提取的耐药结核分枝杆菌DNA检测结果
使用Bio-Rad Droplet Digital PCR仪检测的信号图如图2所示。表4示出了实验过程中的数据。
表4
Figure BDA0002445350750000082
注：上述DNA样品编号1-4分别对应于不同浓度的同一样品。
上述实验结果与临床药敏实验结果一致，都是耐药。
本发明的检测方法灵敏度和特异性高，可以检测反应体系中结核杆菌DNA拷贝数，信噪比高，信号高出噪音至少一个数量级，不易出现假阳性和假阴性。与此同时，还可以准确的检测低至1个拷贝的结核杆菌基因组DNA。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 元码基因科技（北京）股份有限公司
<120> 用于检测结核杆菌及其耐药性的方法
<141> 2020-04-10
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccagcgccga cag 13
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttgacccaca agcg 14
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aaccccgaca gcg 13
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccaattcatg gaccaga 17
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agctggctgg tgcc 14
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acacataggt gaggtctg 18
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtcgccgcga tcaagg 16
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gacagaccgc cgggc 15
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggtgacaaag gccacgtagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tcggaccacc agcacctaac 20

Claims (10)

1.一种用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，包括使预混液和油在微滴发生器内生成含有众多微滴的反应体系，然后在能够进行PCR反应的条件下处理反应体系，随后使处理后的反应体系中各微滴依次分别通过双色检测器来检测荧光，基于获得的荧光信号检测结核杆菌及其耐药性，其中，所述预混液包含引物对、探针组和来源于样品的模板，所述探针组中各探针分别具有不同的荧光基团，且各探针的靶序列不同，并能够与靶序列完全互补，各探针的靶序列分别位于第一靶基因或第二靶基因内。
2.根据权利要求1所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，所述反应体系包含5000至50000个体积为0.5-3nL的微滴，且各微滴分别包含引物对和由两条探针组成的探针组。
3.根据权利要求2所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，所述方法包括生成第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系，且第一反应体系包含第一引物对和第一探针组，第二反应体系包含第一引物对和第二探针组，第三反应体系包含第一引物对、第二引物对和第三探针组，其中：第一引物对用于扩增第一靶基因的序列，第二引物对用于扩增第二靶基团的序列，第一探针组和第二探针组中各探针的靶序列分别位于第一靶基因内，而第三探针组中的一条探针的靶序列位于第一靶基因内，另一条探针的靶序列位于第二靶基因内。
4.根据权利要求3所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，所述第一基因为利福平耐药基因，所述第二基因为多拷贝保守基因。
5.根据权利要求3所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，第一靶基因内的每一靶序列对应于不同的耐药位点。
6.根据权利要求3所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，第一探针组的探针如SEQ ID No.1和2所示，第二探针组的探针如SEQ ID No.3和4所示，第三探针组的探针如SEQ ID No.5和6所示，所述第一引物对的序列如SEQ ID No.7和8所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID No.9和10所示。
7.根据权利要求1所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，所述反应体系中模板的拷贝数控制为小于微滴数。
8.根据权利要求1所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，反应体系为20μL，引物对浓度为0.3μM，探针总浓度为0.25μM，模板拷贝数在20000以下。
9.根据权利要求1所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃/10min，(94℃/30s，58/60s)×40，98℃/10min，12℃保持。
10.根据权利要求3所述的用于检测结核杆菌及其耐药性的方法，其特征在于，第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系中包含来源于相同样品的模板。
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