CN110894546A

CN110894546A - 鱼类病毒性神经坏死病病毒（vnnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂

Info

Publication number: CN110894546A
Application number: CN201811067966.1A
Authority: CN
Inventors: 刘荭; 钱冬; 程奇; 史秀杰; 张建勋; 肖文; 余国君; 贾鹏; 郑晓聪; 王津津; 于力; 何俊强; 刘莹; 温智清
Original assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2020-03-20

Abstract

本发明公开了一种鱼类病毒性神经坏死病病毒（VNNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.4fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

Description

鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鱼类病毒性神经坏死病病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis，VNN)又称病毒性脑病和视网膜病(Viral encepha-lopathy and retinopathy，VER)，是世界范围内的一种鱼类流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100％。VNN的病原为病毒性神经坏死病毒(viralnervous necrosis virus，VNNV)，它属于野田村病毒科(Nodaviridae)中的乙型野田村病毒属。VNNV对寄主的选择性并不严格，即一种血清型NNV可以感染多种鱼类，同一种寄主也可能感染不同血清型VNNV病毒，因此VNNV的发病范围非常广，至今已报告的受该病危害的鱼类包括鳗鲡目、鲈形目、鲽形目、鲀形目、鳕形目中的40余种。

VNNV对仔鱼和幼鱼危害性很大，各种鱼类感染VNNV后的发病及死亡率各不相同，最早发病时间是孵化后1d，一般在孵化后1～3周开始发病，死亡率可达100％。而该病毒对成鱼的感染死亡率相对较低，但近年来越来越多的报告表明,许多鱼类的成鱼患病死亡率也很高。对于VNNV的防治没有的有效的手段，因为大部分的传染方式是通过垂直传播，只能通过检测亲本来进行预防。

对于病害检测这方面使用方法主要有镜检观察，分子检测和免疫学检测。PCR分子检测方法是最为常用的检测方法，其方法敏感、准确、快速而被广泛应用，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场检测和普及使用。本发明建立了RAA恒温荧光来检测鱼类病毒性神经坏死病病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国水产养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)核酸的检测试剂盒，包括：鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鱼类病毒性神经坏死病病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，30ng/mL RTE逆转录酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品为含有鱼类病毒性神经坏死病病毒保守基因部分序列的阳性质粒。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有鱼类病毒性神经坏死病病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种鱼类病毒性神经坏死病病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA为模板，在鱼类病毒性神经坏死病病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鱼类病毒性神经坏死病病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述的鱼类病毒性神经坏死病病毒核酸RNA提取采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。

在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；

本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为鱼类病毒性神经坏死病病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为鱼类病毒性神经坏死病病毒阴性结果。

有益效果

1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先解链等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；

3、高特异性：本发明对鱼类其他的病症GCRV1、CYHV2、IHNV、CEV、ISAV、IPNV的质粒DNA均不发生扩增。

4、高灵敏度：本发明的检测极限可以达到0.4fg/μL反应

5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。

附图说明

图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。

图2为RAA检测方法对VNNV的灵敏度实验图，从左到右依次为4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL的阳性标准品的扩增结果。

图3为RAA检测方法对VNNV的特异性实验图。

具体实施方法

以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。

实施例1：

本发明对鱼类病毒性神经坏死病病毒在Genebank数据库中搜索鱼类病毒性神经坏死病病毒株基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。

表1引物和探针序列:

由图1结果可见，第三组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第三组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。

表2引物探针筛选结果分析

组别\结果	CT值	荧光强度
			第一组	6.36	355,000
第二组	8.71	384,500
			第三组	6.15	642,500
第四组	6.25	375,000

实时例2：所述试剂盒鱼类病毒性神经坏死病病毒

本发明所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品和DEPC处理水。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶、30ng/mL RTE逆转录酶。

本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID NO.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2为1:1。

本发明提供的鱼类病毒性神经坏死病病毒的特异性探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

本发明提供的鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品包含有鱼类病毒性神经坏死病病毒保守区基因序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

质粒的碱基序列(SEQ ID NO.4):

ATGGTACGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGGCCGCGAATCCGCAACCCCGCCGACGTGCTAACAATCGTCGGCGTAGTAATCGCACTGACGCACCTGTGTCTAAGGCCTCGACTGTAACTGGATTTGGACGTGGGACCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATGTCGAGAATCTCCCAGGCCGTCCTCCCAGCCGGGACAGGAACAGACGGATACGTTGTTGTTGACGCAACCATCGTCCCCGACCTCCTGCCACGACTGGGACACGCTGCTAGAATCTTCCAGCGATACGCTGTTGAAACACTGGAGTTTGAAATTCAGCCAATGTGCCCCGCAAACACGGGCGGTGGTTACGTTGCTGGCTTCCTGCCTGATCCAACTGACAACGACCACACCTTCGACGCGCTTCAAGCAACTCGTGGTGCAGTCGTTGCCAAATGGTGGGAAAGCAGAACAGTCCGACCTCAGTACACCCGTACGCTCCTCTGGACCTCGTCGGGAAAGGAGCAGCGTCTCACGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGTGTGTCGGCAACAATACTGATGTTGTCAACGTGTCAGTGCTGTGTCGCTGGAGTGTTCGACTGAGCGTTCCATCTCTTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGAC ATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTGGACCGTCCGCTGTCCATTGACTACAGCCTTGTAACTGGAGATGTTGACCGTGCTGTTTACTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAACAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTGCACCAGGGTTGACTCGGGAAACTAA

本发明提供的DEPC处理水购买于Solarbio公司。

实例3：本发明所述试剂盒鱼类病毒性神经坏死病病毒

1、阳性样品核酸的提取

1.1、核酸提取：采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。

2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。

表3:

RAA反应体系组分	体积(μL)
		A Buffer	12.5μL
B Buffer	2.5μL
		引物混合液	4μL
特异性荧光探针	0.6μL
		RNA模板	2μL
DEPC处理水	28.4μL
		总体积	50μL

A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc

3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA扩增：39℃，40s；39℃，20min，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。

4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定鱼类病毒性神经坏死病病毒阳性或阴性结果。

判定结果：FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为鱼类病毒性神经坏死病病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为鱼类病毒性神经坏死病病毒阴性结果。

实施例4：本发明RAA检测试剂盒在临床实际应用中的评估

采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验，检测20份灰鲳；实验结果表明，本发明的第三引物对可以区分出鱼类病毒性神经坏死病病毒，与反转录PCR阳性符合率很高。在20份中，反转录PCR，有18份为阳性结果，2份为阴性结果，通过RAA方法检测的结果为18份为阳性，有2份也为阴性结果，两组实验的结果一致，说明本发明的RAA检测与PCR检测具有相同的可靠性。

试验例1：本发明所述试剂盒的灵敏度试验

本发明实施例2所述试剂盒提供的鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。

检测结果如图2所示，从左到右依次为4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达0.4fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对VNNV的诊断具有高度的灵敏性。

试验例2：本发明所述试剂盒的特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实例3中的检测方法，分别对病毒GCRV1、CYHV2、IHNV、CEV、ISAV、IPNV样本进行检测，分析本试剂盒对VNNV和鱼类其他常见病毒的检测情况。

检测结果表明：仅VNNV样品出现正常扩增，阴性对照(DEPC处理水)及GCRV1、CYHV2、IHNV、CEV、ISAV、IPNV样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出VNNV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。

同时，采用本发明设计的2-3对引物进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本，特异性不是很好(具体实验数据略)。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 杭州众测生物科技有限公司

<120> 鱼类病毒性神经坏死病病毒（VNNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

<130> 18-100070-00006980

<141> 2018-09-13

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgctcccat catgacacaa ggttccctg 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctccagttc caaggctgta gtcaatgg 28

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attccctttc cacaaatgac ttcaagtcca cccctaggat ccacacc 47

<210> 4

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc cgcgaatccg 60

caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc acctgtgtct 120

aaggcctcga ctgtaactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180

tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa cagacggata cgttgttgtt 240

gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300

cgatacgctg ttgaaacact ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360

ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgaccacac cttcgacgcg 420

cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480

cagtacaccc gtacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcacct 540

ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aatactgatg ttgtcaacgt gtcagtgctg 600

tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660

cccatcatga cacaaggtcc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga cttcaagtcc 720

atcctcctag gatccacgcc actggacatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggac 780

cgtccgctgt ccattgacta cagccttgta actggagatg ttgaccgtgc tgtttactgg 840

cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900

tgggacaact tcaacaagac gttcacagat ggcgttgcct actactctga tgagcagccc 960

cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcaccaggg ttgactcggg aaactaa 1017

Claims

1.一种鱼类病毒性神经坏死病病毒（VNNV）核酸的检测试剂盒，包括：鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鱼类病毒性神经坏死病病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂、鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mMMgAc。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶， 30ng/mL RTE逆转录酶、 100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸检测试剂盒，鱼类病毒性神经坏死病病毒标准品为含有鱼类病毒性神经坏死病病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，所述含有鱼类病毒性神经坏死病病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

9.鱼类病毒性神经坏死病病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA 为模板，在鱼类病毒性神经坏死病病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述鱼类病毒性神经坏死病病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述鱼类病毒性神经坏死病病毒反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.2 所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

10.根据权利要求9所述，鱼类病毒性神经坏死病病毒核酸RNA提取采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。