CN107828914B - 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.32fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
背景技术
传染性皮下及造血组织坏死性病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV）是引起对虾传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN)的病源，也就是引起慢性矮小残缺综合症(Runt-deformity syndrome , DRS)的病原。该病于1981年首次在美国夏威夷地区的一个养殖场中发现，最先爆发于细角滨对虾（L. stylirostris）中，随后的调查发现在亚洲和美洲养殖的对虾中也广泛存在。该病对幼虾的危害尤其严重，其影响整个对虾养殖业的发展。世界各地爆发的疫情显示，IHHNV对细角滨对虾（L. stylirostris）造成高达90%的死亡率，对凡纳滨对虾（L. vannamei）、斑节对虾（P. monodon）、日本囊对虾（M. japonicus）则引起矮小畸形症候群（Runt-deformity syndrome， RDS），受感染的对虾永久性长不大，养殖产量大大降低，造成的经济损失是不可忽视的。感染了IHHNV病毒却存活下来的细角滨对虾（L. stylirostris）和滨凡纳对虾（L. vannamei）都会终身携带该病毒并且可以传播给下一代或者死亡后被其他健康虾当做食物，导致其后代感染该病毒，形成垂直传播。目前该病没有任何有效的治疗方法，因此，早期检测筛选虾苗和养殖过程中实施规律性诊断是唯一的有效途径。2003年， OIE将IHHN疾病划为须向其申报的甲壳类重要疾病之一。
目前，有关IHHNV的检测方法主要有 5种，第一种是电镜观察法，第二种是HE染色法，第三种是抗体检测法，第四种是核酸探针杂交法，第五种是PCR检测法。电子显微镜计数虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但操作复杂、耗费时间长、成本高。HE染色法基于病理学计数，不能直接对病毒进行检查，只能利用发病的组织病理征兆进行检测。抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，其检测灵敏度较低，耗时长，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测；IHHNV尚未引发感染或在感染极早期很难用以上的方法检测。IHHNV的PCR检测法，虽然客服了前四种方法的缺点，在实验室条件下能够实现对IHHNV的相对快速准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪器、凝胶电泳和成像系统，且检测时间长，也大大限制了PCR检测方法在实际中的推广应用。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA 不同的是，RAA 扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1 h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒（IHHNV）的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒（IHHNV）核酸的检测试剂盒，包括：对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒标准品和ddH2O中至少一种。
在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mM MgAc。
在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒标准品为含有对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。
在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA 为模板，在对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；
本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA 的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒阴性结果。
有益效果
1、 快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；
2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；
3、高特异性：本发明对对虾其他的病症对虾肝肠胞虫（EHP）、对虾急性肝胰腺坏死病（ AHPND)、对虾白斑综合症病毒（ WSSV)、对虾桃拉综合症病毒（TSV）的DNA均不发生扩增。
4、高灵敏度：本发明的检测极限可以达到0.32fg/反应
5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。
附图说明
图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。
图2为RAA检测方法对IHHNV的灵敏度实验图，从左到右依次为320fg/μL、32fg/μL、3.2fg/μL、0.32fg/μL、32ag/μL的阳性标准品的扩增结果。
图3为RAA检测方法对IHHNV的特异性实验图。
具体实施方法
以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。
实施例1：引物和探针序列的设计与筛选
本发明对对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒在Genebank数据库中搜索对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。
表1引物和探针序列:
由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度( 纵坐标值)，且CT 值较小( 曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)。其它引物探针曲线上升高度较低，CT 值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。
表2引物探针筛选结果分析
| 组别\结果 | CT值 | 荧光强度 |
| 第一组 | 14.02 | 260000 |
| 第二组 | 22.21 | 190000 |
| 第三组 | 17.53 | 330000 |
| 第四组 | 12.13 | 450000 |
实时例2：所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测试剂盒
本发明所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒标准品和ddH2O。
本发明所述的试剂盒，其中，所述的A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mMMgAc。
本发明所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID NO.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2为1:1。
本发明提供的对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒的特异性探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有FAM 荧光报告基团，3’端标记有BHQ1 荧光淬灭基团。
本发明提供的对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒标准品包含有对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒保守区基因序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如SEQ IDNO.4所示。
质粒的碱基序列（SEQ ID NO.4）:
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实施例3：所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒的检测方法
1、样品核酸的提取
1.1、核酸提取：采用海洋动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。
表2 :
| RAA反应体系组分 | 体积（μL） |
| A Buffer | 12.5 μL |
| B Buffer | 2.5 μL |
| 引物混合液 | 4 μL |
| 特异性荧光探针 | 0.6 μL |
| DNA模板 | 2 μL |
| DEPC处理水 | 28.4 μL |
| 总体积 | 50 μL |
A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mM MgAc
3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA 扩增：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。
4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒阳性或阴性结果。
判定结果：FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒阴性结果。
实施例4：本发明所述试剂盒在临床实际应用中的评估
采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验，检测500份对虾；实验结果表明，本发明的第四引物对可以区分出对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒，与巢式PCR阳性符合率很高。在500份中，巢式PCR，有345份为阳性结果，155份为阴性结果，通过RAA方法检测的结果为346份为阳性，有154份也为阴性结果，存在一份阳性结果不同，对这个样本DNA进行PCR扩增并测序，测序结果显示该样本为阳性，说明本发明的RAA检测试剂有更高的准确率。
试验例5：本发明所述试剂盒的灵敏度试验
本发明实施例2所述试剂盒提供的对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到320fg/μL、32fg/μL 、3.2fg/μL、0.32fg/μL、32ag/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。
检测结果如图2所示，从左到右依次为320fg/μL、32fg/μL 、3.2fg/μL、0.32fg/μL、32ag/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达0.32fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对IHHNV的诊断具有高度的灵敏性。
试验例6：本发明所述试剂盒的特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实例3中的检测方法，分别对病毒WSSV、IHHNV、EHP、AHPND、TSV样本进行检测，分析本试剂盒对IHHNV和对虾其他常见病毒的检测情况。
检测结果表明：仅IHHNV样品出现正常扩增，阴性对照（ddH2O）及EHP、WSSV、AHPND、TSV样品均未出现扩增（如图3所示）。上述结果说明，本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出IHHNV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。
同时，采用本发明设计的1-3对引物进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本，特异性不是很好（具体实验数据略）。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
序列表
<110> 杭州众测生物科技有限公司
<120> 传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
<130> 17-100070-00002921
<141> 2017-11-10
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Claims (5)
1.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）核酸的检测试剂盒，包括：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种；还包括对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒标准品和ddH2O中至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括A Buffer和B Buffer，所述ABuffer为20% PEG ；所述B Buffer为280mM MgAc。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括RAA干粉试剂，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的试剂盒，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒标准品为含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒保守区基因部分序列的阳性质粒，所述阳性质粒中含有的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒保守区基因部分序列如SEQ ID NO.4所示。
5.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法，所述方法用于非疾病诊断用途，其步骤为：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA 为模板，在对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述A Buffer为20% PEG ；所述B Buffer为280mM MgAc；所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
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Denomination of invention: RAA Isothermal Fluorescence Detection Method and Reagent for Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) Effective date of registration: 20221204 Granted publication date: 20210514 Pledgee: Pailou Sub branch of Hangzhou United Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HANGZHOU ZC BIO-SCI&TECH CO.,LTD. Registration number: Y2022330003420 |