CN116200539A - 一种基于era技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法 - Google Patents

一种基于era技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，该方法包括以下步骤：(1)选取传染性皮下及造血坏死病毒的保守区域ORF1区段1936‑2244nt作为检测靶位点，设计合成引物；其中，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)的引物进行基础型ERA检测或荧光型ERA检测，得到ERA扩增产物；根据ERA扩增产物荧光信号判断检测结果。本发明实验操作简单，耗时短，速度快，可特异性的检测传染性皮下及造血组织坏死病毒，且灵敏度高，灵敏度可达101copies/μL。

Description

一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检 测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法。
背景技术
由于凡纳滨对虾生长迅速、养殖密度高、盐度适应范围大，其养殖产量在世界对虾总产量中占比最大。目前对虾养殖业中累计出现了大约20多种病毒，已造成大量的对虾死亡和严重的经济损失。其中，传染性皮下及造血坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV)是对虾最常见的病原体之一，也是引起慢性矮小残缺综合症(Runtdeformity syndrome，DRS)的病原。感染IHHNV的对虾永久性生长停滞，养殖产量大大降低，造成了不容忽视的经济损失。2003年，世界动物卫生组织(OIE)将传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN)划为必须申报的甲壳类重要疾病之一。然而，该病没有任何有效的治疗方法。因此，在筛选虾苗和养殖过程中，实施早期检测、规律性诊断是唯一的有效途径。IHHNV的诊断技术有组织学检测、免疫学检测以及分子生物学检测。组织学检测方法是指通过对病理组织切片，苏木精和伊红(HE)染色，对特定的成分进行原位的定性、定量或定位研究，但该操作步骤繁琐，检测时间很长，不适于常规诊断。免疫学检测技术主要包括：酶联免疫技术(ELISA)、免疫胶体金技术以及免疫荧光抗体技术，由于检测灵敏度较差，抗体制备的步骤繁琐，成本较高且耗时长等不利条件，限制了其在现场检测中的应用。目前，分子生物学检测技术已广泛应用于病毒和其他病原体的检测。根据扩增温度，可以将分子生物学检测技术分为基于PCR的变温扩增检测技术和等温扩增检测技术，包括聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)、巢式PCR(nest PCR)、荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)、绝缘等温PCR(insulated isothermal PCR，iiPCR)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)。基于PCR的扩增技术需要成本较高的热循环仪器，耗时长。LAMP技术仍存在一定的缺点和不足，例如引物设计复杂、反应温度需要60℃左右且时间较长，这些不足限制了其在现场检测中的应用。酶促重组等温扩增技术(EnzymaticRecombinase Amplification，ERA)是中国苏州先达基因科技有限公司开发出的等温扩增技术，具有快速简便、操作简单、结果可靠的优点。目前还没有将ERA技术应用于快速检测凡纳滨对虾中的传染性皮下及造血坏死病毒的报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本申请提出一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，采用real-time ERA(RT-ERA)技术进行传染性皮下及造血坏死病毒的快速检测，该发明技术在对虾病原体快速检测的实践具有广阔的应用前景和明显的实用价值。
本发明技术方案主要包括以下内容：
一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，包括以下步骤：
(1)选取传染性皮下及造血坏死病毒的保守区域ORF1区段1936-2244nt作为检测靶位点，设计合成引物；其中，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQID NO:6所示；
(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)的引物进行基础型ERA检测或荧光型ERA检测，得到ERA扩增产物；结果判定；
其中，若步骤(2)进行荧光型ERA检测，则步骤(1)还设计有探针。
进一步的，所述探针依序包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4序列之间插入四氢呋喃作为外切酶的切断位点；在四氢呋喃左右分别加入一个荧光基团和一个猝灭基团；探针3’端加入C3-space阻断基团。
进一步的，SEQ ID NO:3序列自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸，SEQ ID NO:4序列自5’端起第二位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸；
进一步的，结果判定的方法是：
步骤(2)进行基础型ERA检测，所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若在100-250bp处出现特异性条带，则表明扩增结果为阳性。
进一步的，结果判定的方法是：
步骤(2)进行荧光型ERA检测，若在扩增的30min内扩增曲线的荧光值出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染传染性皮下及造血坏死病毒；若不满足上述条件，则表明扩增结果显示为阴性，即表明待测样品未感染传染性皮下及造血坏死病毒。
进一步的，ERA检测程序：42℃反应30min。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明通过基因组序列比对分析，选取传染性皮下及造血坏死病毒的保守区域ORF1区段1936-2244核苷酸(nt)(Gen Bank登录号：AF218266)作为检测靶位点，并针对该靶基因序列设计了RT-ERA检测引物和探针，建立了检测传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA技术。通过实验证明：本发明的传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA引物和探针可以有效扩增靶基因，灵敏性为101copies/μL，可以达到与OIE推荐的单步PCR、qPCR灵敏性相当的水平，并且与白斑综合征病毒(WSSV)、副溶血弧菌(AHPND)、肝肠胞虫(EHP)以及健康对虾DNA均无交叉反应，特异性好。本发明的RT-ERA等温扩增体系在32-45℃下30min以内可实现靶基因的高效扩增。
与现有技术相比，本发明实验操作步骤简单，耗时短，速度快；检测灵敏度高；摆脱了PCR过程中对热循环仪的依赖。本发明不仅可用于传染性皮下及造血坏死病毒感染的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。该方法也可应用到临床检验、海关违禁生物检测、企业质检等领域，为其提供技术支持，具有明显的实际应用价值。
附图说明
图1.传染性皮下及造血坏死病毒的不同ERA检测引物的基础型扩增结果。其中1-6引物分别为IHHNV-F1/IHHNV-R1、IHHNV-F/IHHNV-R、IHHNV-F3/IHHNV/R3、IHHNV-F4/IHHNV-R4、IHHNV-F5/IHHNV/R5、IHHNV-F6/IHHNV/R6；M为DL2000 Marker。
图2.传染性皮下及造血坏死病毒的不同ERA检测引物的荧光型扩增结果。
图3.传染性皮下及造血坏死病毒在6个不同温度下的RT-ERA扩增曲线。分别为32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃；NC为阴性对照。
图4.传染性皮下及造血坏死病毒RT-ERA扩增体系的特异性检测。其中包含传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、副溶血弧菌(AHPND)、肝肠胞虫(EHP)以及健康对虾DNA。
图5.传染性皮下及造血坏死病毒RT-ERA扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies；NC为阴性对照。
图6.传染性皮下及造血坏死病毒单步PCR扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为1010copies、109copies、108copies、107copies、106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies；9为阴性对照；M为DL2000 Marker。
图7.传染性皮下及造血坏死病毒qPCR扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies；NC为阴性对照。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中ERA基础型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号为KS101；下述实施例中ERA荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号为KS103。
实施例1传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测引物和探针设计与筛选
(一)传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测引物和探针的设计及合成
对传染性皮下及造血坏死病毒全基因组序列进行序列比对分析，选取种内保守、种间特异的ORF1区段1936-2244nt(Gen Bank登录号：AF218266)作为检测靶位点。ERA反应的引物不同于常规PCR引物设计，按照如下要求设计传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测引物和探针：(1)引物长度28-35nt；(2)鸟嘌呤避免在5’末端，从而有利于重组酶细丝的形成；(3)3’端出现鸟嘌呤，为PCR提供稳定的夹持靶标；(4)扩增产物的长度控制在100-250bp之间。为了用荧光法检测ERA扩增产物，我们设计了一种exo探针专门检测扩增子。探针长度46-52bp，并插入THF(四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点，其中THF位点的5’端至少30nt，3’端至少15nt，在THF左右分别加入一个荧光基团和一个猝灭基团。3’端加入C3-space阻断基团。荧光基团和猝灭基团选择FAM和BHQ1。
根据上述引物和探针设计要求，序列如下：
表1.传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测引物和探针
Figure BDA0004006357540000041
Figure BDA0004006357540000051
上述探针中，序列3自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸(FAMdT)，序列4自5’端起第二位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)；THF(四氢呋喃)为外切酶exo的切断位点，C3-space：序列4的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端exo外切酶和聚合酶发挥作用。
上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(二)传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测引物的筛选
以连续10倍稀释的质粒为模板，采用基础型ERA和荧光型ERA先后进行引物筛选。具体步骤如下：
基础型ERA检测体系为：上下游引物(10μM)各2μL，溶解剂(ERA基础型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS101)20μL，DNA模板1μL，ddH2O 23μL。将上述混合液加入至含有扩增试剂的ERA反应管中，振荡混匀，最后在每反应管中加入激活剂乙酸镁(280mM)2μL，混匀离心后迅速将反应管置于PCR仪(Thermo Fisher Scientific)中开始恒温(42℃)反应20min。反应结束后加入7.5μL Loading Buffer，置于PCR仪(Thermo Fisher Scientific)中孵育(56℃)5min，进行琼脂糖凝胶电泳的检测。
结果如图1所示。结果表明，6对引物在42℃下，均可成功扩增传染性皮下及造血坏死病毒的ORF1区段，引物对IHHNV-F/IHHNV-R、IHHNV-F5/IHHNV/R5特异性最好，无非特异性扩增。
通过荧光型ERA，采用表1所述探针对2对引物(IHHNV-F/IHHNV-R、IHHNV-F5/IHHNV/R5)进一步筛选，具体步骤如下：
荧光型ERA检测体系为：上下游引物(10μM)各1μL，探针(10μM)0.6μL，溶解剂(ERA荧光型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS103)20μL，DNA模板1μL，ddH2O 24.4μL。将上述混合液加入至含有扩增试剂的ERA反应管中，振荡混匀，使RT-ERA反应管中的扩增试剂(ERA荧光型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS103)充分溶解，最后在每反应管中加入激活剂乙酸镁(280mM)2μL，混匀离心后迅速将反应管置于荧光扩增检测仪中开始恒温(42℃)反应30min，并检测荧光信号。
结果如图2所示。结果表明，2对引物在42℃下，均可成功扩增传染性皮下及造血坏死病毒的ORF1区段，且引物对IHHNV-F/IHHNV-R扩增效率最好。
另外，进一步研究表明采用引物对IHHNV-F/IHHNV-R的灵敏度可达到101copies/μL，而采用IHHNV-F5/IHHNV/R5在模板量为101copies/μL时无法有效检出。相对于其他引物，采用引物对IHHNV-F/IHHNV-R的灵敏度提高了10倍，灵敏度更好。
实施例2RT-ERA反应温度的优化
在32℃-45℃温度范围内，为了确定RT-ERA扩增反应的最适温度，将传染性皮下及造血坏死病毒重组质粒进行10倍梯度稀释，选择105copies作为反应模板，并采用实施例1中传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA检测方法，分别在32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃条件下进行扩增，以到达阈值且荧光值最高的温度作为最佳反应温度。
结果如图3所示。结果表明，RT-ERA反应体系在32℃-45℃温度范围内，均可成功扩增传染性皮下及造血坏死病毒的ORF1区段，说明该体系具有较宽的扩增反应温度范围。
实施例3传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA引物和探针的特异性检测
分别以传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、副溶血弧菌(AHPND)、肝肠胞虫(EHP)以及健康对虾DNA作为模板，采用实施例1中传染性皮下及造血坏死病毒的ERA检测方法检测本发明的RT-ERA引物和探针的特异性。
结果如图4所示。实验结果表明本发明设计的引物和探针可特异地扩增靶位点，且与WSSV、AHPND、EHP以及健康对虾DNA均无交叉反应，说明本发明设计的引物和探针具有较好的特异性。
实施例4传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA方法与OIE推荐的单步PCR、qPCR灵敏度比较
1、传染性皮下及造血坏死病毒RT-ERA检测
采用实施例1中传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA检测方法，以10倍梯度稀释传染性皮下及造血坏死病毒重组质粒作为模板(模板量分别为105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies)进行扩增。
2、传染性皮下及造血坏死病毒单步PCR检测
根据OIE推荐的单步PCR检测方法实施，以10倍梯度稀释传染性皮下及造血坏死病毒重组质粒作为模板(模板量分别为1010copies、109copies、108copies、107copies、106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies)，采用表2中的引物利用2×Taq Master Mix(Novoprotein，产品货号为E005)进行单步PCR检测，每个扩增管中的反应体系如表3所示，将反应体系置于PCR仪(Thermo Fisher Scientific)中进行反应，反应程序如表4所示：
表2.单步PCR引物序列
Figure BDA0004006357540000061
Figure BDA0004006357540000071
表3.单步PCR反应体系
Figure BDA0004006357540000072
表4.单步PCR反应程序
Figure BDA0004006357540000073
3、传染性皮下及造血坏死病毒qPCR检测
根据OIE推荐的qPCR检测方法实施，以10倍梯度稀释传染性皮下及造血坏死病毒重组质粒作为模板(模板量分别为106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies)，采用表5中的引物利用Premix Ex Taq(TaKaRa，产品货号为RR390A)进行qPCR检测，每个扩增管中的反应体系如表6所示，将反应体系置于荧光定量PCR仪(Bio-Rad，CFX96)中进行反应，反应程序如表7所示：
表5.qPCR引物和探针序列
Figure BDA0004006357540000074
注：5-FAM：荧光报告基团；TAMRA-N：荧光猝灭基团。
表6.qPCR反应体系
Figure BDA0004006357540000075
/>
Figure BDA0004006357540000081
表7.qPCR反应程序
Figure BDA0004006357540000082
RT-ERA、单步PCR和qPCR的扩增结果如图5、图6、图7所示。经分析可得，传染性皮下及造血坏死病毒的RT-ERA方法可达到与单步PCR和qPCR相似的灵敏度，达到101copies/μL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取传染性皮下及造血坏死病毒的保守区域ORF1区段1936-2244nt作为检测靶位点，设计合成引物；其中，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQIDNO:6所示；
(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)的引物进行基础型ERA检测或荧光型ERA检测，得到ERA扩增产物；结果判定；
其中，若步骤(2)进行荧光型ERA检测，则步骤(1)还设计有探针。
2.根据权利要求1所述基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，所述探针依序包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。
3.根据权利要求2所述基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列之间插入四氢呋喃作为外切酶的切断位点；在四氢呋喃左右分别加入一个荧光基团和一个猝灭基团；探针3’端加入C3-space阻断基团。
4.根据权利要求1所述基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，结果判定的方法是：
步骤(2)进行基础型ERA检测，所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若在100-250bp处出现特异性条带，则表明扩增结果为阳性。
5.根据权利要求1所述基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，结果判定的方法是：
步骤(2)进行荧光型ERA检测，若在扩增的30min内扩增曲线的荧光值出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染传染性皮下及造血坏死病毒；若不满足上述条件，则表明扩增结果显示为阴性，即表明待测样品未感染传染性皮下及造血坏死病毒。
6.根据权利要求1所述基于ERA技术的传染性皮下及造血组织坏死病毒快速检测方法，其特征在于，ERA检测程序：42℃反应30min。
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