CN107699635B - 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了用于RPA技术快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)中的M基因的引物、探针组合及检测方法。正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明所建立的RPA方法可在39℃恒温反应20min，可实现对PEDV的有效检测，以包含PEDV病毒M基因片段的puc57质粒为模板，RPA检测限为101拷贝；RPA仅特异性扩增PEDV病毒M基因，对TGEV，PRRSV，PCV‑2以及CSF病毒的膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列没有扩增。而且，应用该RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本发明所建立的RPA方法操作简单，反应快速，检测准确，灵敏度高，为PEDV的检测防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

Description

猪流行性腹泻病毒荧光RPA检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)技术快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)中的M基因成分。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科(Coronaviridae)的猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的高毒接触性肠道传染病，可导致未断乳仔猪大量死亡，造成重大经济损失[1-2]。PEDV为单股正链RNA病毒，有囊膜，病毒粒子直径约120nm，病毒基因组具有5’端的帽子结构和3’端的Poly(A)尾巴。其主要基因包括非结构蛋白编码区、S基因、ORF3、 E基因、M基因、N基因等[3-4]。有研究表明，该疫病的爆发可能与携带PEDV的血浆蛋白粉饲料有关[6-7]。PEDV的快速准确检测对于PED 的防控至关重要。
等温核酸扩增(isothermal amplification)技术于20世纪90年代初出现，其理念是在恒定温度下，通过特殊的蛋白(酶)使得DNA双链解旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果[8]。因等温核酸体外扩增不需要高温变性、退火和延伸的环节，核酸扩增变得更加迅速和高效。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)，该技术是一种在常温下可以使核酸快速扩增的方法[9]。在25～42℃范围内的等温条件下，重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single stranded protein，SSP) 的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，结合荧光探针，恒温条件下20到30min即可获得检测结果[10]。目前，RPA技术已经在一系列的病原微生物分子检测中得到应用，包括口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒以及结核分枝杆菌等[11-13]。但是，未见RPA技术在PEDV检测中的应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是建立一种以 PEDV病毒M基因序列为靶标的荧光RPA检测方法，测试了其灵敏度和特异性，并成功检测了血浆和血浆蛋白粉中PEDV核酸。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种用于通过重组酶聚合酶扩增技术检测猪流行性腹泻病毒M基因的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ IDNo.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
本发明在具体实施方式中所使用的相应引物及探针均由华大基因(北京)合成。
本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，该试剂盒包含前述引物和探针组合。
本发明还提供了一种通过重组酶聚合酶扩增技术检测猪流行性腹泻病毒M基因的方法，提取待测样品的DNA作为模板，或提取待测样品的总RNA，将反转录得到的cDNA作为模板，利用前述的引物及探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品含有猪流行性腹泻病毒M基因。
作为优选，RPA扩增试剂盒的反应体系为50μL：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水12.5μL，10μmol/L的引物各2μL， 10μmol/L的探针0.5μL，模板DNA 1μL，最后加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL；
扩增程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39℃恒温反应20分钟。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明方法是通过参考Genbank中PEDV病毒M基因序列，选择特异性保守区域，设计大量RPA引物及探针，从中筛选出一套可快速有效检测出PEDV病毒M基因成分的引物及探针组合。利用该对引物进行快速扩增及实时荧光检测，以pUC57-PM，pUC57-GM，pUC57-VM，pUC57-RM以及pUC57-CM为模板，进行PEDV RPA检测。结果只有 pUC57-PM出现特异性扩增条带，说明该方法具有良好的特异性。将阳性模板稀释至106～100拷贝/μL，结果都有扩增曲线，该方法具有较高的灵敏度。
本发明建立的PEDV的RPA荧光等温扩增方法结合了荧光PCR重复性好、灵敏度高以及等温扩增方法检测时间短等优势，其灵敏度高于常规PCR、LAMP方法，检测限值为10拷贝/μL；其检测时间为20min，只有LAMP检测方法的一半，荧光PCR方法的三分之一。
附图说明
图1为本发明PEDV病毒RPA方法特异性检测；
图2为本发明PEDV病毒RPA方法灵敏度检测；
图3为本发明PEDV病毒RPA检测血浆及血浆蛋白粉样品。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、材料与方法
1.1主要试剂
TwistAmpTM DNA amplification kit，购自英国TwistDx公司；病毒 RNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix，；质粒DNA小量抽提试剂盒，均购自凯杰(QIAGEN)生物工程有限公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。
DMEM培养基购自Gibco公司，进口胎牛血清购自Hyclone，胰酶购自Washington公司。
1.2主要仪器
RPA荧光检测仪，英国TwistDx公司；2720型常规PCR仪，ABI 公司；高速离心喷雾干燥塔(中国农科院农产品加工所)恒温干燥箱、温度计。
1.3实验材料
PEDV弱毒疫苗株CV777(本实验室保存)；新鲜牛血在屠宰场采集(由北京第五肉联厂提供)，抗凝剂为15％柠檬酸钠(食品级)；Vero 细胞本实验室保存。
1.4疫苗毒培养
PEDV疫苗CV777的培养、传代及滴度鉴定方法参考文献[14]。
1.5血浆蛋白粉制作
血浆蛋白粉工艺流程：牛血抗凝→冷链运输→低温储存→分离血球液→喷雾干燥→收料包装→指标检测。
制作含感染性病毒的血浆原料。经过Vero等细胞系体外培养，扩增获取CV777疫苗毒)，人工添加上述疫苗毒到牛新鲜抗凝血浆中，制作含病毒滴度TCID50分别为2.5×104/ml，5×104/ml，1×105/ml的血浆原料。
将含疫苗血浆原料制成血浆蛋白粉。按标准工艺，经过超微过滤、高温喷雾干燥等流程，将含疫苗血浆原料加工为血浆蛋白粉。
1.6 RNA基因组提取及逆转录
将含有疫苗毒的血浆及血浆蛋白粉重悬液(各200/μL)作为RNA 提取材料，依照QIAGEN公司的RNA提取试剂盒的操作手册，进行总 RNA的提取。得到的核酸通过凝胶电泳和Nano Drop 1000分光光度计测定RNA的纯度和浓度。
按照逆转录试剂盒使用说明反转录RNA为cDNA。
1.7 PEDV病毒及对照病毒基因重组质粒的合成及拷贝数确定
根据Genbank数据库中PEDV参考序列，确定M基因 (KY499262.1)序列信息，由华大基因合成并克隆至pUC57载体，命名为pUC57-PM，将pUC57-M质粒转化至感受态细胞DH5a，过夜培养后提取质粒并测定浓度。
根据PEDV的分类地位、感染导致的临床症状和与其他病毒的亲缘关系，选择序列相近的四种病毒的相应囊膜蛋白编码序列作为对照，分别是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)(HQ462571.1)、猪圆环病毒2型(PCV-2)(AY181945.1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)(JF276434.1)、古典猪瘟病毒(CSFV)(AY259122.1)等病毒，参照各病毒M基因序列。构建对照质粒pUC57-GM(TGEV)、pUC57-VM (PCV-2)、pUC57-RM(PRRSV)以及pUC57-CM(CSFV)。
根据下列公式，计算pUC57-PM等重组质粒拷贝数：拷贝数 (copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660)
1.8 RPA检测方法
RPA反应体系：RPA的反应体系是50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL Twist Amp Exo反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer) 29.5μL，去离子水12.5μL，引物各2μL(10μmol/L)，探针0.5μL (10μLmol/L)，RNA反转录cDNA 1μL，最后加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，充分混匀后将反应试管放在RPA荧光检测仪(Twista) 中进行实时荧光扩增，39℃恒温反应20min(对于低拷贝数的模板 DNA，4min后拿出反应管再次混匀，离心3～5s)。阳性样品将会出现明显的扩增曲线，而阴性对照样品则无扩增曲线。
1.9引物探针设计
参考Genbank中PEDV病毒M基因序列，选择特异性保守区域，设计RPA扩增引物和探针。引物及探针均由华大基因(北京)合成(表 1和表2)。
1.10特异性和敏感性试验
分别以pUC57-PM，pUC57-GM，pUC57-VM，pUC57-RM以及 pUC57-CM为模板，进行PEDVRPA检测，确定是否出现特异性扩增条带。将重组质粒pUC57-PM进行10倍倍比稀释，其终浓度在106～100 copies/μL之间，并将其作为模板进行RPA反应，确定该方法的最低检测浓度，即为PEDV荧光RPA方法的敏感度。
1.11 RPA方法的应用
以制作含疫苗毒滴度TCID50分别为2.5×104/ml，5×104/ml， 1×105/ml的血浆原料以及由含疫苗血浆制作的血浆蛋白粉为样本，检测PEDV核酸。
2、结果与分析
2.1 RPA扩增引物设计
根据PEDV的保守M基因序列，与四种比对病毒膜蛋白、核衣壳蛋白等序列比对，设计大量RPA引物及探针，从中筛选出一套可快速有效检测出PEDV病毒M基因成分、且特异性及灵敏度最佳的引物及探针组合。具体引物序列(PEDV-11)及扩增片段长度见表1。
表1扩增引物序列
Figure BDA0001325802660000071
2.2 RPA探针设计
而后设计检测探针probe-pedv-11-1。如表2所示。
表2探针序列
Figure BDA0001325802660000072
注：C3 Spacer代表3’端的C3间臂；FAMdT代表FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶；THF代表四氢呋喃分子；BHQ1-dT代表荧光淬灭基团BHQ1 标记的胸腺嘧啶。
2.3特异性实验
以pUC57-PM，pUC57-GM，pUC57-VM，pUC57-RM以及 pUC57-CM为模板，进行PEDV RPA检测。结果只有pUC57-PM出现特异性扩增条带，说明该方法具有良好的特异性(图1)。
2.4灵敏度实验
使用106～100copies系列浓度的pUC57-PM进行RPA的灵敏度试验。图2试验结果显示RPA检测方法灵敏度良好，检测限值为101 copies/μL。
2.5样品检测
以含有PEDV疫苗毒滴度TCID50分别为2.5×104/ml，5×104/ml， 1×105/ml的血浆原料以及由上述血浆制作的血浆蛋白粉为样品，进行RPA检测，图3显示RPA检测方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV疫苗毒核酸序列。
3、讨论
猪流行腹泻病毒(PEDV)导致的猪流行腹泻与猪传染性胃肠炎 (由TGEV引起)症状类似，表现为病猪严重腹泻、呕吐和脱水等临床特征的高毒接触性传染病[15]。区分两种疫病最好的方法就是分子生物学诊断方法。目前已经研发的PEDV分子生物学检测方法主要包括：限制性酶切片段长度多态性分析实验(RFLP)、常规PCR扩增技术 (RT-PCR)、荧光PCR检测技术(Real-time PCR)以及等温扩增检测技术 (Isothermal AmplificationTechniques)等[16-19]。PEDV的常规PCR与 RFLP检测方法耗时长，检测步骤复杂，经测试，其敏感度不高，为 102copies/uL[16-17]。荧光PCR检测技术其主要有两种原理不同的方法，包括SYBR Green以及Taqman荧光探针检测。PEDV荧光检测技术的检出限可为10copies/uL，特异性强，整个检测耗时约为60min至 90min[18]。与上述方法相比，PEDV的环介导等温扩增技术(LAMP) 具有检测时间短(40min至60min)，灵敏度较好(16copies/uL)，以及仪器要求低等优点[19]。本文建立的PEDV的RPA荧光等温扩增方法是结合了荧光PCR重复性好、灵敏度高以及等温扩增方法检测时间短等优势，其灵敏度高于常规PCR、LAMP方法，检测限值为10copies/uL；其检测时间为20min，只有LAMP检测方法的一半，荧光 PCR方法的三分之一。
猪血浆蛋白粉被广泛用于饲喂断奶仔以提高生长率和饲料摄入量，同时减少腹泻[20]。2013年，美国、加拿大地区PED疫情爆发后，研究人员在商用猪血浆蛋白粉中检测到了PEDV的RNA核酸，而且证实了传染性PEDV可以在血浆蛋白粉中存活[5-7]。因此，携带PEDV的血浆蛋白粉可能是PED疫情传播的重要途径。尽管而后的研究表明：高温喷雾干燥流程可有效灭活PEDV，但饲料通过接触污染源等方式携带并传播PEDV的可能性依然存在[21-22]。而快速、准确、高灵敏度的PEDV检测方法就成为防控PED的关键。本研究建立的荧光RPA检测方法操作简单、快速准确，在PED的检疫防控中具有重要的应用前景。
4、结论
本发明根据PEDV保守M基因序列设计一对可有效扩增出233bp 目的片段的RPA引物以及荧光检测探针，构建了质粒阳性对照。经检测，该PEDV荧光RPA检测方法可特异性检测PEDV核酸序列，检测限值为101copies/uL，20min即可获得结果，可为PED的一线检疫防控提供了有效的技术支撑。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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序列表
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 2
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caattgttgt agtggccttg gcgactgtga cg 32
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcactactt ctgtgatggg ccgacaggtc gatccagtgc ttggagc 47

Claims (1)

1.一种通过重组酶聚合酶扩增技术检测猪流行性腹泻病毒M基因的引物和探针组合在制备检测猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
通过所述重组酶聚合酶扩增技术检测猪流行性腹泻病毒M基因的方法为，提取待测样品的DNA作为模板，或提取待测样品的总RNA，将反转录得到的cDNA作为模板，利用所述的引物和探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明待测样品含有猪流行性腹泻病毒M基因；
所述重组酶聚合酶扩增技术扩增的反应体系为50μL：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液Rehydration Buffer29.5μL，去离子水12.5μL，10μmol/L的引物各2μL，10μmol/L的探针0.5μL，模板DNA 1μL，最后加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL； 扩增程序为：重组酶聚合酶扩增技术扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39℃恒温反应20分钟，对于低拷贝数的模板 DNA，4min后拿出反应管再次混匀，离心3～5s，所述试剂盒的检测限值为101 copies/μL。
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