CN106566896A

CN106566896A - 一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂、检测方法及应用

Info

Publication number: CN106566896A
Application number: CN201610956744.XA
Authority: CN
Inventors: 曾少灵; 曹琛福; 叶奕优; 刘建利; 王潇; 林彦星; 张彩虹; 吕建强; 杨俊兴; 花群义
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本申请公开了一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂、检测方法及应用。本申请的用于猪圆环病毒2型检测的试剂，包括用于猪圆环病毒2型重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，引物对正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；探针第31个碱基标记BHQ1，第33位碱基以四氢呋喃替换，第35位碱基标记FAM，探针3’末端磷酸基团修饰。本申请用于猪圆环病毒2型检测的试剂，为猪圆环病毒2型检测提供了一种新检测方案和途径。基于本申请试剂的猪圆环病毒2型RPA检测方法，快速准确，对硬件设备要求低，适于现场快速检测，特别适合检验检疫等部门使用。

Description

一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及猪圆环病毒2型检测领域，特别是涉及一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂，基于该试剂的检测方法，及其应用。

背景技术

根据致病性和基因组的差异，猪圆环病毒(Porcine circovirus，缩写PCV)可分为无致病性的猪圆环病毒1型(缩写PCV1)和有致病性的猪圆环病毒2型(缩写PCV2)。PCV2是猪圆环病的主要病原，可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemwasting syndrome，缩写PMWS)，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难和黄疸等。此外，PCV2还与猪皮炎与肾炎综合征(porcine dermatitis and nephropathysyndrome，缩写PDNS)、猪呼吸道病综合征(porcine respiratory disease complex，缩写PRDC)、繁殖障碍以及肠炎等疾病有关，是一种免疫抑制性疾病，一旦爆发，传播速度很快，是给世界养猪业造成严重经济损失的重要猪病。

2000年，我国首次报道了PCV2感染，至今，PCV2感染已在我国猪群中广泛流行，种猪有很高感染率，且与其它疾病混合感染的现象非常严重，临床上表现为不同的综合征，对养猪业的影响很大。急需研制简单的现场或基层实验室使用的、可以实现更加快速、准确、高通量的PCV2检测技术方法。

近年来，多种恒温核酸扩增技术的出现解决了传统PCR技术成本高、耗时长、依赖精密温度循环仪器等局限。其中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)是被视为“最可能替代传统PCR”的恒温扩增技术。首先，RPA在检测时间上具有明显优势，整个反应在5min～20min内即可完成，远快于其他恒温扩增技术或PCR。其次，RPA检测简单，易操作。最后，RPA反应试剂可以冻干形式存储，便于运输及保存。

RPA反应的原理是，在恒温下重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA bingding，缩写SSB)的协助下，解链模板DNA，然后在DNA聚合酶作用下，形成新的DNA互补链。可见，RPA整个反应过程只需要在恒温下就可以完成，也不需要高温变形。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可在便携式恒温反应装置中实现恒温扩增后实现检测结果的直接读取，非常适用于设备简配的基层或现场实验室。目前尚没有猪圆环病毒2型检测的相关RPA技术研究和报道。

发明内容

本申请的目的是提供用于猪圆环病毒2型检测的试剂，以及基于该试剂的猪圆环病毒2型检测方法，及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂，该试剂包括用于猪圆环病毒2型重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，引物对的正向引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.1：5’-CTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCC-3’

Seq ID No.2：5’-CATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGC-3’

Seq ID No.3：

5’-TGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGGAC-3’

其中，Seq ID No.3所示序列的探针中，第31个碱基标记BHQ1淬灭基团，第33位碱基以四氢呋喃替换，第35位碱基标记FAM发光基团，探针的3’末端以磷酸基团进行修饰。

需要说明的是，重组酶聚合酶扩增(缩写RPA)是2006年由英国公司TwistDx Inc研发的一种新型的核酸恒温扩增技术。RPA检测的关键在于扩增引物和探针的设计。而就目前来说，常规PCR引物及其设计方案是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。并且，不同于常规PCR引物的设计，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。目前，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，也没有任何引物或探针设计软件可以使用，科研人员需要进行反复的试验和研究分析、优化，以获得适合的引物和探针。

本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备猪圆环病毒2型检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的另一面公开了一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。

本申请的再一面公开了一种猪圆环病毒2型的检测方法，包括采用本申请的试剂，对待测样品进行重组酶聚合酶扩增检测，重组酶聚合酶扩增检测的温度和条件为40℃反应20分钟，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的一种实现方式中，具体采用了探针荧光法进行RPA检测，可以理解，其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等，也可以用于对RPA扩增产物进行检测，可以根据不同的使用需求或者条件进行选择。

本申请的有益效果在于：

本申请的用于猪圆环病毒2型检测的试剂，为猪圆环病毒2型的检测提供了一种新的检测方案和途径。并且，基于本申请试剂的猪圆环病毒2型RPA检测方法，快速而准确，对硬件设备要求低，适用于现场快速检测，特别适合检验检疫等部门使用，为保障生产安全，控制猪圆环病毒2型传播提供了有力的科学工具。

附图说明

图1是本申请实施例中猪圆环病毒2型特异性检测的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试毒株和试剂

本例使用的猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型和非洲猪瘟病毒(ASFV)等灭活毒株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心(下称“深圳检验检疫局动植中心”)提供和保藏。

含有PCV2的RPA检测目标基因的重组质粒pMD18T-PCV2由深圳检验检疫局动植中心构建及保存。大肠埃希氏菌TOP10感受态细胞由深圳检验检疫局动植中心制备及保存。小量病毒DNA/RNA提取试剂盒、小量质粒提取试剂盒及相关生化试剂均购自宝生物(大连)有限公司。DNA凝胶电泳染料Biotium GelRed购自广州宸源生物科技有限公司。ABI Ag-pathone step荧光PCR体系试剂盒购自广州测迪生物科技有限公司。Quant-iTTM Pico GreenReagent and Kit购自美国Invitrogen公司。Twist Amp TM Basic kit试剂盒购自英国Twist DX公司。

2.主要设备

本例采用的主要设备包括：恒温扩增检测仪、ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，Eppendorf 5415R型高速离心机，BioRad PowerPac Universal型核酸电泳仪，BioRadUniversal Hood Ⅱ型凝胶成像仪，Amersham Biosciences型核酸计数仪等。

3.引物和探针

本例根据猪圆环病毒2型基因组中序列保守稳定的rep基因和cap基因，进行特异性引物和探针设计，所设计的引物和探针通过BLAST比较，确定其特异性。当前，由于尚未有针对RPA引物和探针设计的自动化软件，有关设计需靠人工手动设计。其中，引物长度一般为30nt-35nt，探针一般为46nt-53nt。

具体的，本例根据rep基因设计了一条特异性探针，和与探针配套的四条上游引物和四条下游引物；根据cap基因设计了一条特异性探针，和与探针配套的四条上游引物和四条下游引物。本例所有的引物和探针均由上海生工合成与修饰。引物和探针的序列如表1所示。

表1设计的猪圆环病毒2型引物和探针序列

表1中Seq ID No.3所示的PCV2cap-exo probe探针，第31个碱基标记BHQ1淬灭基团，第33位碱基以四氢呋喃替换，第35位碱基标记FAM发光基团，探针的3’末端以磷酸基团进行修饰；Seq ID No.4所示的PCV2rep-exo probe探针，第31个碱基标记BHQ1淬灭基团，第32位碱基以四氢呋喃替换，第34位碱基标记FAM发光基团，探针的3’末端以磷酸基团进行修饰；PCV2rep-probe-F1至PCV2rep-probe-F4是与探针PCV2rep-exo probe配套的上游引物，PCV2rep-probe-R1至PCV2rep-probe-R4是与探针PCV2rep-exo probe配套的下游引物；PCV2cap-probe-F1至PCV2cap-probe-F4是与探针PCV2cap-exo probe配套的上游引物，PCV2cap-probe-R1至PCV2cap-probe-R4是与探针PCV2cap-exo probe配套的下游引物。

4.核酸提取

本例的各病毒的核酸提取采用购自宝生物(大连)有限公司的小量病毒DNA/RNA提取试剂盒，具体步骤详见试剂盒说明书，在此不累述。分别从各灭活毒株中提取核酸，保存于-80℃，备用。

5.重组质粒构建

以Seq ID No.19所示的上游引物PCV2-F和Seq ID No.20所示的下游引物PCV2-R，按“95℃10min；95℃30s，56℃45s，72℃1.5min，共35个循环；72℃10min”的扩增反应程序，对本例提取到的PCV2核酸进行扩增。对PCR产物进行回收纯化后，连接到pMD18-T载体，转化大肠埃希氏菌TOP10感受态细胞。挑取阳性重组菌，采用PCV2-F和PCV2-R引物对进行重组质粒的PCR鉴定，能扩增出预期大小为1722bp含有PCV2中cap和rep全基因序列的DNA片段。按宝生物(大连)有限公司的小量质粒提取试剂盒操作说明书，提取重组质粒，测定插入片段的序列，经比对确认碱基序列无误后，即可确认用作阳性对照的重组质粒构建成功。

Seq ID No.19：5’-CACCT CGGCA GCACC TCGGC AGCA-3’

Seq ID No.20：5’-TCGTT TTCAG ATATG ACGTA TCCAA-3’

按美国Invitrogen公司的Quant-iTTM Pico GreenReagent and Kit定量试剂盒，测定重组质粒模板液的浓度，计算出对应质粒拷贝数，再依次进行倍比稀释，获得质粒拷贝数浓度从10⁸个拷贝/μL至10¹个拷贝/μL的系列梯度浓度模板液，保存在-80℃，备用。

6.引物和探针的筛选

对引物与探针进行筛选时，相应RPA探针固定不变，每一条上游引物分别与配套的每一条下游引物进行配对，以荧光值、平台期和反应耗时等因素为考察依据，确定适配探针的最佳上下游引物对组合。每条探针筛选出最佳的上下游引物组合后，再采用相同的判断方法，比较两条探针，以获得最佳的猪圆环病毒2型检测试剂。

反应体系按Twist Amp TM Basic kit试剂盒操作说明书进行配制，反应条件为40℃恒温反应20min。

7.RPA检测方法的建立

按Twist Amp TM Basic kit试剂盒操作说明书进行标准反应体系的配制，反应体系设定为50μL。在一干净的EP管中先配制Rehydration solution：依次加入浓度为10μmol/L的RPA上下游引物溶液各2.1μL，10μmol/L的RPA探针溶液0.6μL，Rehydration buffer溶液29.5μL，核酸模板5.0μL(约含DNA 50ng)，以及灭菌双蒸水8.2μL。将Rehydration solution充分混匀，快速离心收集到管底后，全部转入含有冻干酶粉的200μL TwistAmp Exo专用反应管中。盖上反应管盖，上下颠倒混匀，直至管内酶颗粒充分溶解。快速离心将液体收集到管底。最后每个反应管中加入试剂盒提供的280nmol/L的醋酸镁溶液2.5μL，充分混匀，再次快速离心将液体收集到管底。

反应条件的优化：将上述反应管放置在恒温反应器中，温度设定为38℃～40℃，恒温作用4min。取出反应管，涡旋混匀，快速离心收集到管底。重新放置在恒温反应器中，温度设定为38℃～40℃，恒温作用15min～30min。摸索RPA的最佳反应条件，每次试验采用等量模板，由38℃～40℃以1℃递增，由15min～30min以5min递增，每次试验只设一个变量，每个反应条件重复试验3次，用荧光检测仪收集荧光。以Ct值、荧光值、平台期和反应耗时等因素为考察依据，确定最佳反应条件。

8.特异性试验

采用本例筛选的引物对和探针组合，按“7.RPA检测方法的建立”中最终筛选的反应条件，对PCV2、PRV、CSFV、SVDV、VSV、PCV1、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型和ASFV等9种核酸模板进行检测。并设置一个PCV1核酸为模板的阴性对照和一个灭菌双蒸水的空白对照。

9.灵敏度试验

将“5.重组质粒构建”中获得的质粒拷贝数浓度从10⁸个拷贝/μL至10¹个拷贝/μL的系列梯度浓度模板液，每个浓度重复试验10次，按照“7.RPA检测方法的建立”中最终筛选的反应条件进行检测。每次试验设置一个PCV1核酸为模板的阴性对照和一个灭菌双蒸水的空白对照。

二、结果及分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，最终从多个引物对和探针的组合中，筛选出Seq ID No.1所示序列的PCV2cap-probe-F2正向引物、Seq ID No.2所示序列的PCV2cap-probe-R3反向引物和SeqID No.3所示序列的PCV2cap-exo probe探针，该组合的扩增效率高、特异性强。

根据筛选结果可见，不同的正向和反向引物组合，对重组酶聚合酶扩增的扩增效率、特异性和灵敏度都有影响；并且，即便是相同序列的探针，不同的标记和修饰，其扩增效果也不同。

2.最佳反应条件

按Twist Amp TM Basic kit试剂盒操作说明书，配制标准反应体系，总体系设定为50μL，包括Rehydration buffer溶液29.5μL，浓度均为10μmol/L的上下游引物溶液各2.1μL，10μmol/L的探针溶液0.6μL，核酸模板溶液5.0μL(约含DNA 50ng)，以灭菌双蒸水(ddH₂O)补足反应体系至47.5μL；充分混匀后，加入280nmol/L的醋酸镁溶液2.5μL。在判定为阳性结果的前提下，平台期出现最早，平台期对应的荧光值最大、耗时最短等为指标，确定最佳的反应条件为：40℃恒温下反应20min。

3.特异性检测结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为猪圆环病毒2型核酸的RPA检测结果。可见，只有猪圆环病毒2型的核酸有荧光曲线，呈阳性；而其它疫病病原核酸和水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针组合能够对猪圆环病毒2型进行特异性检测，而不会检出其他疫病病原核酸，具有良好的特异性。

对比例

本例采用实施例中所筛选的引物和探针，以及实施例中所确认的最优反应条件进行试验。与此同时，采用行业标准《猪圆环病毒病检疫技术规范》(SN/T2708-2010)中推荐的实时荧光PCR方法作为对照试验的方法。采用以上两种方法，分别对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒1型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪水泡病病毒、水泡性口炎病毒、非洲猪瘟病毒的核酸模板进行检测，设置一个水空白对照，以验证两种方法的特异性。

采用以上两种方法分别对重组质粒pMD18T-PCV2的10⁸个拷贝/μL至10¹个拷贝/μL的系列梯度浓度模板液进行检测，并设置一个水空白对照，以比较两种方法的灵敏度。

特异性比对检测结果显示，RPA检测方法和行业标准实时荧光PCR检测方法都只对猪圆环病毒2型核酸模板产生荧光曲线，而对其他病毒的核酸模板和水空白对照都没有扩增。表明，本申请的RPA检测方法和行业标准实时荧光PCR检测方法一样具有良好的特异性，两种方法的特异性相当，检测结果符合率达100％，证明本申请的猪圆环病毒2型的RPA引物与探针组合可靠实用。

灵敏度比对检测结果显示，RPA检测方法的灵敏度可以达到10¹个质粒拷贝数/μL；行业标准实时荧光PCR检测的灵敏度同样可以达到10¹个质粒拷贝数/μL。表明本申请的RPA检测方法和行业标准实时荧光PCR检测方法具有相当的检测灵敏度。同时，本申请提供的猪圆环病毒2型的RPA引物与探针组合的检测方法在20min内可判读检测结果，检测周期仅为行业标准SN/T 2708-2010推荐的实时荧光PCR方法的1/4至1/3，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂、检测方法及应用

<130> 16I23377

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctacatttcc agtagtttgt agtctcagcc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cataacccag cccttctcct accactcccg c 31

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgatttcttt tgttgtttgg ttggaagtaa tcaatagtgg aatctaggac 50

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgaaaggaa cagatcagca gaataaagaa tctgcagtaa agaaggca 48

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggtatttgg gtgcccgctg ccacatcgag 30

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaagtggta tttgggtgcc cgctgccaca tcg 33

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgaagtggta tttgggtgcc cgctgccaca tc 32

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taaagtgaag tggtatttgg gtgcccgctg ccac 34

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgagatcta ggagctccac actccatcag 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccctgagatc taggagctcc acactccatc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtccctgag atctaggagc tccacactcc 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctcctagat ctcagggaca acggagtgac ctg 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacatttcca gtagtttgta gtctcagcca c 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctacatttc cagtagtttg tagtctcagc 30

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctctacattt ccagtagttt gtagtctcag c 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctaccactc ccgctacttt acccccaaac 30

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagcccttct cctaccactc ccgctacttt ac 32

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctatgacccc tatgtaaact actcctcccg c 31

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cacctcggca gcacctcggc agca 24

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcgttttcag atatgacgta tccaa 25

Claims

1.一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于猪圆环病毒2型重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，所述引物对的正向引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的反向引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.1：5’-CTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCC-3’

Seq ID No.2：5’-CATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGC-3’

Seq ID No.3：

5’-TGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGGAC-3’

2.根据权利要求1所述的试剂在制备猪圆环病毒2型检测试剂盒或设备中的应用。

3.一种用于猪圆环病毒2型检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的试剂。

4.一种猪圆环病毒2型的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的试剂，对待测样品进行重组酶聚合酶扩增检测，所述重组酶聚合酶扩增检测的温度和条件为40℃反应20分钟，并采用荧光检测仪收集荧光。