CN107988433A

CN107988433A - 一种石斑鱼虹彩病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN107988433A
Application number: CN201711381672.1A
Authority: CN
Inventors: 马红玲; 郭志勋; 程长洪; 冯娟
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2018-05-04

Abstract

本发明提供了一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒根据石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒(GIV‑M)和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV‑R)的主衣壳蛋白(MCP)基因序列设计双重PCR引物，建立了单管、同步检测石斑鱼肿大细胞虹彩病毒和蛙虹彩病毒的方法，并对扩增体系和方法进行优化，最终实现了对石斑鱼肿大细胞虹彩病毒和蛙虹彩病毒的高特异、高灵敏、快速同步检测。

Description

一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，具体涉及一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

石斑鱼是全球分布的名贵海洋鱼类，具有重要的经济价值。中国是世界上石斑鱼的主产国，自2014年以来的年总产量稳定在10万吨左右(2016年中国渔业统计年鉴)，占世界石斑鱼总产量约60％，产值超过100亿元人民币。但是，随着石斑鱼养殖业的快速发展，病害发生日益频繁，其中，病毒性病害尤为严重，成为限制石斑鱼产业健康发展的瓶颈之一。

石斑鱼虹彩病毒(grouper iridovirus，GIV)是石斑鱼养殖中危害严重的一类病原，能够感染30多种石斑鱼，导致严重致死，在过去十年对东南亚各国造成了严重的经济损失。虹彩病毒科共包括五个病毒属，其中对石斑鱼危害较大的主要是肿大细胞病毒属(genus Megalocytivirus)和蛙病毒属(genus Ranavirus)，分别简称GIV-M和GIV-R(Ma etal.,2012)。 GIV-M/R可危害各种规格的石斑鱼，致死率皆可达70％以上(Huang et al.,2011)。

2002年，广东惠东的网箱养殖石斑鱼暴发了大规模死鱼事件，吕玲等研究确认引起该死鱼事件的病原是肿大细胞病毒(Lu et al.,2005)，与之前日本的真鲷虹彩病毒(RSIV)，韩国的条石鲷虹彩病毒(RBIV)，中国的鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)属于同一类病毒。据报道， 1992年新加坡发生的石斑鱼昏睡病(Grouper sleepy diseases,GSD)(Chuaet al.,1994)，以及随后中国台湾(Chou et al.,1998)和日本(Kawakami and Nakajima,2002)，以及福建沿海报道的网箱石斑鱼严重死鱼事件(汪彦愔et al.,2001)，都是由GIV-M样病毒引起。

GIV-R于1990年代末期首先发现于中国台湾的网箱养殖石斑鱼，被命名为石斑鱼虹彩病毒(GIV)(Lai et al.,2000)，该类病毒稍晚时候又出现在新加坡的发病网箱养殖石斑鱼，致死率达到90％以上，被称为新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)(Qin et al.,2001)。稍后，对GIV和 SGIV病毒的全基因组测序分析证实它们是一种新型蛙病毒GIV-R(Song etal.,2004；Tsai et al., 2005)。分子流行病学研究显示，GIV-M和GIV-R都是中国台湾地区养殖石斑鱼的重要病毒性病原(Huang et al.,2011)。国内马红玲等先后自发病石斑鱼样品利用细胞培养途径分离培养出两种石斑鱼虹彩病毒(Ma et al.,2012,Aquaculture358-359,170–175；2016,Aquaculture 463, 145-151)，为避免混淆，马等建议将这两种分别属于肿大细胞病毒属和蛙病毒属的虹彩病毒命名为GIV-M和GIV-R(Ma et al.,2012,Aquaculture 358-359,170–175)。

主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)是虹彩病毒的主要结构蛋白，占整个病毒蛋白的40-45％，是虹彩病毒病毒颗粒的最高丰度病毒粒子蛋白。同时，MCP编码基因在不同种属的虹彩病毒中也高度保守，是公认的用于不同种属虹彩病毒进行聚类进化分析的标志性病毒基因。完整的肿大细胞虹彩病毒MCP的开放读码框(ORF)包含1362bp核苷酸，编码一个由453个氨基酸残基组成的蛋白，而完整的蛙虹彩病毒的MCP-ORF则由1392bp核苷酸组成，编码由463个氨基酸残基构成的蛋白。如前文所述，石斑鱼虹彩病毒的本质包含了两种不同病毒属的虹彩病毒，即隶属于肿大细胞虹彩病毒属的GIV-M和隶属于蛙虹彩病毒属的GIV-R，两者都是养殖石斑鱼的重要病毒性病原，两者感染可导致类似临床症状如黑身、趴底及昏睡，通常情况下单凭临床症状很难判断究竟是哪一种虹彩病毒的感染，此外，尽管GIV-M和GIV-R都是鱼虹彩病毒成员，但两者在基因结构、基因组成、致病机制及病毒的抗原性方面具有很大的差异，对两种病毒病的预防和控制也完全不同。因此，一旦出现发病症状，对发病病原进行精确诊断具有重要临床意义。

目前已有一些检测方法如核酸探针、常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)等，还有可对17种鱼类病原同时进行检测的尼龙膜基因芯片方法(中国发明专利CN201010243398.3)。这些方法虽然能检测鱼类病毒，但都存在着致病的缺陷：核酸探针方法检测灵敏度低，低于10⁵拷贝的病毒无法检出，不能满足防控疾病的需求；常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)等方法，因引物相互干扰，各病毒基因的扩增必须在不同的反应管中进行，故通常仅能对一种或几种病毒进行检测，无法对上述多种鱼类病毒同步、快速检测，检测效率低，不能满足未知病原样品的多病毒筛查需求；尼龙膜基因芯片方法虽然可以对17种鱼类病原同时检测，但其仍依赖常规PCR和RT-PCR方法，需要在多个反应管中对病原分别扩增，而不是在同一个反应管内对各病原进行扩增，因此工作量大，容易出现操作失误；且该方法应用尼龙膜点杂交技术对扩增结果进行检测，采用肉眼观察判断检测结果，灵敏度偏低且不易标准化，实际应用范围有限。

因此，有必要提供一种能快速、准确地同时对石斑鱼GIV-M和GIV-R两种不同虹彩病毒进行快速检测的方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供一种可同时检测、鉴别石斑鱼肿大细胞虹彩病毒和蛙虹彩病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。

本发明第一方面提供一种检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物，所述引物根据石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒(GIV-M)和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV-R)的主衣壳蛋白(MCP)基因序列设计，其中，石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病(GIV-M)毒的检测引物，由 SEQID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV-R)的检测引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成。

上述检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物在制备检测石斑鱼虹彩病毒的制品中的应用。

本发明第二方面提供一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品制备基因组总DNA；

2)以制备的基因组DNA为模板，利用如本发明第一方面所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；

3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，所述样品中基因组总DNA的浓度不低于9pg/ml。

在本发明一实施例中，双重PCR引物浓度为0.2-0.5μmol/L。

在本发明一具体实施例中，双重PCR引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2引物浓度为0.5μmol/L；SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8引物浓度为0.4μmol/L。

在本发明一实施例中，所述的双重PCR反应体系包括上述浓度的双重PCR引物，还包括：10×buffer 2μl，MgC1₂ 1.5mmol/L，dNTP 0.4mmol/L，Taq酶2.0U，ddH₂O补齐至 19.8μl反应体系，最后加入待检DNA模板或阳性质控品或阴性质控品0.2μl。

在本发明一实施例中，所述双重PCR方法还包括双重PCR的程序为：95℃5min； 94℃50s，55.6℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；4℃保存备用。

本发明第三方面提供一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如本发明第一方面所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物，还包括10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂、 Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品。

在本发明一实施例中，所述的检测试剂盒可特异性检测GIV-R和GIV-M，不能检测出锦鲤疱疹病毒(KHV)、虎纹蛙病毒(TFV)和大口黑鲈病毒(LMBV)中的一种、两种或三种。

本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR 引物、如本发明第二方面所述的石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法或如本发明第三方面提供的石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒在检测石斑鱼肿大细胞虹彩病毒和蛙虹彩病毒中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。

本发明的有益效果：本发明可同时用于检测石斑鱼肿大细胞虹彩病毒属和蛙虹彩病毒属两种石斑鱼的主要病毒性病原；该发明方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地对石斑鱼虹彩病毒进行诊断和种属鉴定。

附图说明

图1为不同GIV-M引物对和GIV-R引物对组合在不同退火温度条件下对混合模板(GIV-R-SY1301和GIV-M-HN11)的扩增效果，其中M为2000bp DNA ladder。Lane 1-8，引物对组合GIV-M-1/GIV-R-1在退火温度为55.1℃，55.2℃，55.3℃，55.4℃，55.5℃，55.6℃，55.7℃和55.8℃时的扩增情况；Lane9-16，引物对组合GIV-M-2/GIV-R-2在退火温度为55.1℃， 55.2℃，55.3℃，55.4℃，55.5℃，55.6℃，55.7℃和55.8℃时的扩增情况；Lane 17-24，引物对组合GIV-M-3/GIV-R-3在退火温度为55.1℃，55.2℃，55.3℃，55.4℃，55.5℃，55.6℃， 55.7℃和55.8℃时的扩增情况。

图2为石斑鱼虹彩病毒双重PCR检测的不同引物浓度组合的PCR扩增效率，其中lane15，当GIV-M引物浓度0.5μmol/L和GIV-R引物浓度为0.4μmol/L时两者的扩增效率最好。

图3为石斑鱼虹彩病毒双重PCR检测的特异性试验电泳图谱(退火温度55.6℃)，其中M为2000bp DNA ladder，Lane 1-7，模板分别为GIV-R-SY1301，KHV，TFV，LMBV， GIV-M-HN11和阴性对照(NC)。

图4为石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测的灵敏性试验图谱，其中M为2000bp DNAladder，NC为阴性对照(ddH₂O)，泳道1-10分别为GIV-M-HN11和GIV-R-SY1301的混合模板的10^-1～10^-10梯度稀释。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

1.试验用毒株

石斑鱼肿大细胞虹彩病毒GIV-M-HN11和石斑鱼蛙虹彩病毒GIV-R-SY1301由本实验分离鉴定保存；锦鲤疱疹病毒KHV-GZ11，虎纹蛙虹彩病毒TFV，大口黑鲈虹彩病毒LMBV 由中山大学生命科学学院何建国教授提供。

2.病毒的增殖和病毒DNA、RNA的提取

GIV-M-HN11，GIV-R-SY1301，TFV和LMBV全部在鳜仔鱼细胞系(MFF-1)增殖， KHV-GZ11在锦鲤鳍条细胞KCF-1增殖。待完全出现CPE，收集病毒感染细胞悬液，-80℃反复冻融三次。分别取病毒悬液200μl，按照OMEGA组织DNA提取试剂盒说明书进行相关操作。同时提取不接种病毒的细胞DNA，作为阴性对照模板。

3.双重PCR扩增引物的设计与筛选

引物的设计：根据GenBank中肿大细胞虹彩病毒的MCP基因序列(登录号AY894343，AB100413，CQ273492)和石斑鱼蛙虹彩病毒MCP基因序列(登录号AY666015，AY521625)，用Primer 5.0基因分析软件设计高度保守的特异性引物，具体序列见表1：

表1针对石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒(GIV-M)和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV-R)的特异性引物

将上述针对GIV-M和GIV-R的各3组引物两两配对后对混合模板进行双重梯度PCR扩增。反应体系为20μL：

扩增条件为:95℃,5min；94℃,50s；退火温度梯度55.1～55.8℃，45s；72℃45s；35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增后的产物，用12g/L的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳30min，用凝胶成像系统观察并拍照。结果如图1所示，引物组GIV-M-1-F/GIV-M-1-R 与GIV-R-1-F/GIV-R-1-R在退火温度为55.6℃时的扩增效果最优(图1，lane 6)，而其它两组引物组则存在不同程度的干扰现象，因此筛选GIV-M-1-F/GIV-M-1-R与GIV-R-1- F/GIV-R-1-R为石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒(GIV-M)和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV-R) 的双重PCR鉴定引物，最佳退火温度为55.6℃。

4.最佳引物浓度匹配试验

为尽可能的避免GIV-M-1-F/GIV-M-1-R和GIV-R-1-F/GIV-R-1-R两个引物对间可能存在的相互干扰，以优化双重PCR反应的扩增效率，在其他试剂配比和反应条件不变的条件下，分别改变GIV-M-1-F/GIV-M-1-R引物对和GIV-R-1-F/GIV-R-1-R引物对的配比浓度，进行双重PCR反应，以GIV-M-HN11和GIV-R-SY1301同时作为反应模板。结果显示，当 GIV-M-MCP引物浓度为0.5μmol/L，GIV-R-MCP引物对浓度为0.4μmol/L时，两种病毒的扩增效率皆为最优(图2，lane15)，因此确定双重PCR检测石斑鱼虹彩病毒的PCR方法中， GIV-M-MCP和GIV-R-MCP的引物浓度分别为0.5μmol/L和0.4μmol/L。图2中，M为2000 bp DNA ladder，泳道1-16中GIV-M-MCP和GIV-R-MCP的引物浓度配比分别为(0.2μmol/L， 0.2μmol/L)，(0.2μmol/L，0.3μmol/L)，(0.2μmol/L，0.4μmol/L)，(0.2μmol/L，0.5 μmol/L)，(0.3μmol/L，0.2μmol/L)，(0.3μmol/L，0.3μmol/L)，(0.3μmol/L，0.4μmol/L)， (0.3μmol/L，0.5μmol/L)，(0.4μmol/L，0.2μmol/L)，(0.4μmol/L，0.3μmol/L)，(0.4 μmol/L，0.5μmol/L)，(0.5μmol/L，0.5μmol/L)，(0.5μmol/L，0.2μmol/L)，(0.5μmol/L， 0.3μmol/L)，(0.5μmol/L，0.4μmol/L)，(0.5μmol/L，0.5μmol/L)和阴性对照(ddH₂O)。

5.双重PCR检测的特异性

用上述双重PCR方法对石斑鱼来源肿大细胞病毒GIV-M-HN11和蛙虹彩病毒 GIV-R-SY1301，锦鲤疱疹病毒KHV-GZ11、虎纹蛙病毒TFV和大口黑鲈病毒LMBV-GZ13 的病毒悬液总DNA为模板进行扩增，阴性对照以ddH₂O为模板。结果显示采用上述双重PCR 方法，GIV-M-HN11扩增出824bp的条带，GIV-R-SY1301扩增出1168bp的条带，其他病毒 DNA模板及阴性对照皆没有任何条带出现，如图3所示，其中M为2000bp DNA ladder，泳道1-7依次为GIV-R-SY1301，KHV-GZ11、TFV，LMBV-GZ13，GIV-M-HN11和阴性对照 (ddH₂O)。

6.双重PCR检测的灵敏性试验

用紫外分光光度计测定GIV-M-HN11和GIV-R-SY1301模板DNA的浓度，并将两个DNA模板稀释为1.82ng/ml，然后将两种模板等量混合，再进行10倍系列梯度稀释，然后取0.2μl混合模板作为反应模板。对不同浓度混合模板进行双重PCR扩增后，电泳结果显示稀释度为10^-1和10^-2时可见明显条带，10^-3稀释时仅有微弱条带，因此判定双重PCR的检测下限为10^-2稀释度为宜，计算此时的模板浓度约为9.1pg/ml，因此本发明对于石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒(GIV-M)和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒(GIV-R)的双重PCR检测具有较高的灵敏性。如图3所示,其中M为2000bp DNA ladder，NC为阴性对照(ddH₂O)，泳道1-10 分别为GIV-M-HN11和GIV-R-SY1301的混合模板的10^-1～10^-10梯度稀释。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒

<130> 2017

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgttcgggc aagagttt 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttatggtt tacggcgatc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcatcagcc agagcaccca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagcaaagg cagattcacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcatcagcc agagcaccca 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccatgtcca gcgtataaca gt 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcccattccc ctattcttta cc 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgccgtcagc aatcttcat 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcccgttg ccgttcttt 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggctggcgc ttttgatg 18

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcttcaggag cttttagtgt ttca 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgttatggtt tacggcgatc 20

Claims

1.一种检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒的主衣壳蛋白基因序列设计，其中，石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒的检测引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成。

2.如权利要求1所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物在制备检测石斑鱼虹彩病毒的制品中的应用。

3.一种检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品制备基因组总DNA；

2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；

3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

4.如权利要求3所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法，其特征在于，所述样品中基因组总DNA的浓度不低于9pg/ml。

5.如权利要求3所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法，其特征在于,双重PCR引物浓度为0.2-0.5μmol/L。

6.如权利要求5所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测方法，其特征在于,双重PCR的程序为：95℃5min；94℃50s，55.6℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；4℃保存备用。

7.一种石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的检测石斑鱼虹彩病毒的双重PCR引物，还包括10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品。

8.如权利要求4所述的石斑鱼虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒可特异性检测鉴定石斑鱼肿大细胞病毒属虹彩病毒和石斑鱼蛙病毒属虹彩病毒，不能检测锦鲤疱疹病毒、虎纹蛙病毒和大口黑鲈病毒中的一种、两种或三种。

9.一种如权利要求1所述的双重PCR引物、如权利要求3所述的双重PCR检测方法、如权利要求7所述的双重PCR检测试剂盒在石斑鱼虹彩病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。