CN103966358B - 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量检测试剂盒和检测方法。该检测试剂盒和检测方法是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列设计特异引物和探针。本发明采用荧光定量PCR技术，简便快捷、灵敏度高、特异性强、重复性好，可运用于鳜鱼的传染性脾肾坏死病毒病毒监测，也可以对鳜鱼中病毒的含量和病毒滴度进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
鳜鱼(Sinipercachuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖种类之一，由传染性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV）引起的鳜鱼虹彩病毒病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜鱼死亡率接近100％，成为制约鳜鱼养殖业发展的主要瓶颈。1997年，吴淑勤等首先在患病鳜鱼中发现了直径150nm的球形病毒，并认为是鳜鱼暴发性传染病的病原。何建国等通过回归感染进一步证明了该病毒的病原性，通过组织学研究发现鳜鱼脾脏和肾脏是其感染的主要器官，将其命名为传染性脾肾坏死病毒，通过主衣壳蛋白（MCP）基因等序列分析确定其为一种虹彩病毒。
虹彩病毒是二十面体的胞质DNA病毒，直径一般在120-200nm之间，可以感染节肢动物等无脊椎动物和鱼类、两栖、爬行等冷血脊椎动物。根据国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）第八次报告，虹彩病毒科（Iridoviridae）下设虹彩病毒属（Iridovirus）、绿虹彩病毒属（Chloriridovirus）、蛙病毒属（Ranavirus）、淋巴囊肿病毒属（LympHocystivirus）和肿大细胞病毒属（Megalocytivirus）五个属，其中传染性脾肾坏死病毒是肿大细胞病毒属的代表种。由于肿大细胞病毒属病毒对鱼类养殖业的巨大危害，这个属的病毒受到越来越多的重视，目前已有数十种肿大细胞病毒属病毒被发现。但还未见荧光定量PCR应用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒检测的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针。
本发明的另一个目的是提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR检测方法。
本发明的另一个目的是提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒滴度的荧光定量PCR检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针、荧光定量反应液、Tap酶。
所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列设计的。
作为优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针的序列如下所示：
ISKNV-F:5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQIDNO:1）；
ISKNV-R:5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’（SEQIDNO:2）；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’（SEQIDNO:3）。
所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒DNA的质粒。
一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针，序列如下所述
ISKNV-F:5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQIDNO:1）；
ISKNV-R:5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’（SEQIDNO:2）；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’（SEQIDNO:3）。
一种鳜传染性脾肾坏死病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）以鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性引物和探针；
（2）建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线；
（3）利用步骤（1）的特异性引物和探针对鳜鱼传染性脾肾坏死坏死病毒滴度进行荧光定量PCR检测，根据检测CT值，结合标准曲线计算出鳜传染性脾肾坏死病毒滴度与拷贝数的对应关系。
所述特异性引物和探针的序列如下所示：
ISKNV–F：5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQIDNO:1）；
ISKNV-R：5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’（SEQIDNO:2）；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’（SEQIDNO:3）。
本发明的有益效果是：
本发明的有益效果在于可对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病进行快速检测，可以做到对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本，对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的荧光定量PCR检测方法检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的灵敏度实验图，从左到右依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10拷贝/μL的标准品的扩增结果；
图2为本发明荧光定量PCR检测方法的特异性实验图；
图3为本发明荧光定量PCR检测方法中质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线；
图4为本发明荧光定量PCR检测方法的重复性实验图；
图5为本发明荧光定量PCR检测方法中的样品检测实验图；
图6为本发明荧光定量PCR检测方法中拷贝数与病毒滴度关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
1、特异性引物及探针的设计
根据从Genbank上检索到的鳜传染性脾肾坏死病毒ORF007蛋白核酸序列（NC_003494），通过blast比对，在基因保守片段设计用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的引物和探针，其序列如下：
ISKNV–F：5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQIDNO:1）；
ISKNV–R：5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’（SEQIDNO:2）；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’（SEQIDNO:3）；
荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为Eclipse。
2、阳性标准品的制备
提取鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007蛋白核酸序列，利用常规方法将其接入T载体中，即为阳性标准品。
3、病毒DNA的提取
按照Qiagen血液组织DNA提取试剂盒（购自Qiagen公司，货号：69504）的说明书步骤，从感染相应病毒的鱼体内脏组织中提取DNA，作为荧光定量PCR反应的模板。
4．荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系为20μL，配制如下：待检测样品的DNA模板2μL、上、下游引物和荧光探针各2μM，2×TapmanuniversalPCRMasterMix10μL、无菌去离子水补足至15μL。同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性标准品或无菌去离子水2μL进行扩增。
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称设定反应条件为95℃预变性10s，然后经95℃，5s和60℃，30s，40个循环，于60℃采集荧光信号。
5、结果分析和判定
反应结束后，荧光曲线呈S型曲线且Ct值≤35.0，判定为鳜鱼传染性脾肾坏死病毒阳性；若无典型S型曲线或Ct值﹥35.0，判定为鳜鱼传染性脾肾坏死病毒阴性。
6、灵敏度实验
提取鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的DNA1×108拷贝/μL，10倍等比稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10拷贝/μL，进行灵敏度实验。实验结果见图1，从左到右依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10拷贝/μL的标准品的扩增结果。
检测结果表明，本发明试剂盒检测的灵敏度可达1.0×10拷贝/μL，并且Ct值随浓度减少呈梯度改变，精确性优于普通PCR方法，表明本发明试剂盒和检测方法对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的诊断具有高度的灵敏性。
7、特异性实验
为了检测本发明试剂盒的特异性，用本发明的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒来检测锦鲤疱疹病毒3型KHV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、大口黑鲈虹彩病毒LMBV、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV、淋巴囊肿病毒LCDV、大鲵虹彩病毒STIV和阴性对照组（无菌离子水），分析本试剂盒对鱼类其它常见病毒和鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测情况。
检测结果表明：
仅对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV进行扩增（如图2所示），从图2中可以看出，KHV、IHNV、LMBV、LCDV、STIV和阴性对照组均为阴性。
上述结果说明，本发明检测试剂盒能特异性扩增出鳜鱼传染性脾肾坏死病毒，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。
8、标准曲线
用双蒸水对阳性标准品进行10×倍比稀释，采用上述反应体系进行荧光定量PCR反应，建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线。
实验结果显示，标准曲线在8.75×101copy/μL--8.75×108copy/μL之间有较好的线性关系，如图3所示，相关系数：R2=0.999，斜率：Slope=－3.314，截距：Y-lnter=41.48，扩增效率：Eff%=99%。得出质粒拷贝数（X）与CT值之间的线性方程为：CT=-3.314lgX+41.48。
9、重复性实验
取鳜鱼传染性脾肾坏死病毒DNA在一次实验中重复30次，结果表明（图4），同一次实验内的30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，说明本实验所建立的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR快速检测方法重复性好。
10、样品检测
根据上述检测方法，取15份样品进行检测，具体检测结果见图5，从图5中可以看出，15份样品中，检测到阳性样品为8份，检测到阴性为7份。所有参与检测的临床样品同时结合细胞分离和常规的PCR检测来相互验证，其检测结果和本专利申请的检测方法一致。
11、病毒滴度确定
病毒原液梯度稀释后，提取处理样品中的病毒DNA，经实时定量PCR确定病毒DNA的浓度，100、10-1、10-2、10-3、10-4病毒液的拷贝数依次为2×106个拷贝/ml、2×105个拷贝/ml、1×104个拷贝/ml、9×102个拷贝/ml、7×10个拷贝/ml。通过观察细胞形态变化，取第14天记录结果确定病毒滴度。依Karber法计算得100、10-1、10-2、10-3、10-4病毒液的滴度分别为：105.25、104.25、103.25、102.25、101.5。将ISKNV不同稀释度的病毒滴度对数与病毒拷贝数对数进行线性相关回归分析，由图6可见，定量PCR测得的病毒拷贝数的对数与CPE法测得的病毒滴度TCID50的对数呈显著的线性回归关系，病毒拷贝数（y）与病毒滴度（x）线性回归方程为：y=1.1748x+0.187，相关系数为0.9966，说明两者间存在较好的相关性。综合比较传统病毒滴度的测定方法，本发明专利更加快捷、灵敏。
<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120>一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
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Claims (4)
1.一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒的特异性引物及探针、荧光定量反应液、Taq酶；
其特征在于，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列设计的，序列如下所示：
ISKNV-F:5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’；
ISKNV-R:5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒DNA的质粒。
3.一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针，序列如下所述
ISKNV-F:5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’；
ISKNV-R:5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’。
4.一种非诊断目的的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性引物和探针；
（2）建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线；
（3）利用步骤（1）的特异性引物和探针对鳜鱼传染性脾肾坏死坏死病毒滴度进行荧光定量PCR检测，根据检测CT值，结合标准曲线计算出鳜传染性脾肾坏死病毒滴度与拷贝数的对应关系；
其特征在于，所述特异性引物和探针的序列如下所示：
ISKNV–F：5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’；
ISKNV-R：5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’；
ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’。
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