CN104561383A - 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用 - Google Patents

流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104561383A
CN104561383A CN201510019605.XA CN201510019605A CN104561383A CN 104561383 A CN104561383 A CN 104561383A CN 201510019605 A CN201510019605 A CN 201510019605A CN 104561383 A CN104561383 A CN 104561383A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
virus
pcr
influenza
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510019605.XA
Other languages
English (en)
Inventor
翟建新
康康
潘艳萍
苟德明
张利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201510019605.XA priority Critical patent/CN104561383A/zh
Publication of CN104561383A publication Critical patent/CN104561383A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用，所述引物的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；所述探针的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:6所示。使用本发明的引物和探针进行流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测，克服了常规RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，可以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测效率，节省成本，有效避免交叉污染，能进行流感病毒的高通量检测，对快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。

Description

流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及流感病毒的分子生物学检测技术领域，具体涉及流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用。
背景技术
流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。感染鸟类、猪等其它动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同。
近年来发现流感不仅严重危害禽类、猪等动物，尤其是可以感染人并致人死亡，极大地威胁着人类公共卫生安全。流感病毒的遗传物质由8个大小不等的独立单股负链RNA片段组成。其中第7个节段即M基因全长为1027bp，编码2种蛋白M1和M2。在M基因编码的蛋白中，M1蛋白具有种群特异性，是病毒分类和诊断的基础。
目前，检测流感病毒的方法包括病毒的分离和培养、血清学诊断、免疫荧光法、酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。核酸检测技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为流感病毒检测的常用方法。相比常规RT-PCR，荧光定量PCR技术(real-time RT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率。
然而，目前基于RT-PCR检测流感病毒的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA为模板进行检测。这一RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高通量检测。此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。因此，现有的基于RT-PCR检测流感病毒的方法还有待于改进和发展。
为了提高流感病毒检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一种较好的解决方案是设法实现流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测，即直接以采集的液体样本作为检测对象进行RT-PCR反应，同时检测流感病毒A型和B型。然而，受限于引物和探针易受样本复杂因素的影响，目前还没有找到可以这样使用的引物和探针。
发明内容
本发明提供一种流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用。本发明用于RT-PCR中，克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，可以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测效率，节省成本，有效避免交叉污染，能进行流感病毒的高通量检测，对快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。
作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1(BlackHole Quencher-1，黑洞淬灭染料-1)荧光淬灭基团，5’端结合有FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX(Carboxy-X-Rhodamine)荧光报告基团。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述探针的序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:6所示。
作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX荧光报告基团。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括反转录酶和Taq DNA聚合酶。优选地，所述反转录酶和Taq DNA聚合酶具体是直接RT-PCR酶混合物(DirectRT-PCR enzyme mix)的形式，即包含有反转录酶和Taq DNA聚合酶的混合物，可以直接用于RT-PCR反应中。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括PCR增强剂；优选地，所述PCR增强剂选自肉碱(L-carnitine)、海藻糖(D-(+)-trehalose)和非离子去污剂NP-40中的一种或多种。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭子液、组织渗出液或尿囊液。
根据本发明的第四方面，本发明提供第一方面所述的引物在制备流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
根据本发明的第四方面，本发明还提供第二方面所述的探针在制备流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测引物和探针，能够用于流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法，在该方法中，直接将液体样本加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；实现了无需提取病毒RNA、直接从采取的样本中检测流感病毒的目的，从得到待检测样本到获得检测结果只需要1.5个小时。因此，有效克服了传统RT-PCR需要提取RNA的不足，减少操作步骤，可以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染和容易降解的问题。基于本发明引物和探针的检测方法的灵敏性不低于传统RT-PCR，甚至在低浓度PBS或体液的情况下灵敏性高于传统RT-PCR。该检测方法能进行病毒的高通量检测，对于快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要而深远的意义。
此外，在原始生物样本中，往往含有大量抑制PCR的物质，比如全血(或血清、血浆)中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素等；土壤中含有较多腐殖酸，牛奶中含有较多乳铁蛋白等。这些物质会抑制Taq DNA聚合酶的活性，使PCR失效，为了进一步提高效果，本发明的试剂盒可以采用一种高耐受性Taq DNA聚合酶，可以耐受这些物质的影响。
此外，本发明的试剂盒内还可以含有多种PCR增强剂，包括但不限于肉碱(L-carnitine)、海藻糖(D-(+)-trehalose)、非离子去污剂NP-40，它们既能提高GC含量基因的扩增效率，又能增加反应体系对PCR抑制物质的耐受性。此外，某些抑制物质(如血红蛋白)会造成荧光定量PCR的荧光淬灭，本发明的试剂盒可以包含PCR增强剂，能够有效降低抑制物质的荧光淬灭效应。因此，本发明的直接扩增RT-PCR方法能使用染料法或探针法，进行病毒RNA的实时荧光定量PCR检测。
附图说明
图1为本发明实施例2中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法与提取RNA的传统RT-PCR方法检测咽拭子液样本的灵敏性比较图；
图2为本发明实施例2中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法与提取RNA的传统RT-PCR方法检测尿囊液样本的灵敏性比较图；
图3为本发明实施例3中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法对不同浓度咽拭子液(10～40％)的耐受能力图；
图4为本发明实施例4中采用本发明RT-PCR检测方法检测流感病毒A型的动态范围；
图5为本发明实施例4中采用本发明RT-PCR检测方法检测流感病毒A型的线性度。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
以下实施例中涉及的实验材料如下：
1.样本处理：
咽喉拭子液、泄殖腔拭子液：在装有拭子的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s，尽量挤出液体移到离心管中6000rpm离心20s，取上清备用。
组织渗出液、尿囊液：取样本6000rpm离心1min，取上清备用。
2.试剂：
Direct RT-PCR 2×buffer mix(包含20％(V/V)甘油，50mM KCl，10mMTris-HCl(pH7.5)，1.5mM MgCl2，0.8mM dNTPs，0.4mM肉碱(L-carnitine)，0.5mM海藻糖(D-(+)-trehalose)，0.1％(V/V)NP-40(Nonidet P-40)，1wt％BSA，0.01％(V/V)Tween-20，1U/μL RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)，其余为去离子水)；Direct RT-PCR enzyme mix(2.5U/μL Taq DNA聚合酶与5U/μL反转录酶按2:1体积比混合而得)；病毒RNA柱提试剂盒。
3.仪器：荧光定量PCR仪(ABI7500)，冷冻离心机(5804R,Eppendorf)。
实施例1流感病毒A型和B型的RT-PCR检测方法(直接扩增RT-PCR方法)
1、流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测引物及探针的设计
根据GenBank的流感病毒核苷酸序列，选择M基因的保守序列区作为扩增区域，利用ABI Primer Express软件(ABI公司提供)分别设计流感病毒A型和B型的上下游引物和流感病毒A型和B型的检测探针，其序列如下：
流感病毒A型的上游引物(AIV A-PF)的序列为：
5’-GACCAATCCTGTCACCTCTGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)；
流感病毒A型的下游引物(IV A-PR)的序列为：
5’-CGCATTTTGGACAAAGCGTCTG-3’(SEQ ID NO:2)；
流感病毒A型的检测Taqman探针(IV A-PB)的序列为：
5’-CTCACTCCGCATTGTGACGGTG-3’(SEQ ID NO:3)。
流感病毒B型的上游引物(IV B-PF)的序列为：
5’-AGCAGCTCTGATGTCCATC-3’(SEQ ID NO:4)；
流感病毒B型的下游引物(IV B-PR)的序列为：
5’-GCAATAGGTCTTTCCACTGC-3’(SEQ ID NO:5)；
流感病毒B型的检测Taqman探针(IV B-PB)的序列为：
5’-TGGCCAGACCCTCCGTCT-3’(SEQ ID NO:6)。
其中，流感病毒A型的检测探针的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；流感病毒B型的检测探针的3’端结合BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合ROX荧光报告基团。
2、直接扩增RT-PCR反应体系的摸索
在25μL反应体系中包含Direct RT-PCR 2×buffer mix、Direct RT-PCRenzyme mix、上游引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4)、下游引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5)、流感病毒A型和B型直接扩增的检测探针(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6)及适量的液体样本。其中，Direct RT-PCR 2×buffer mix中包含dNTP、Mg2+、NP-40，Direct RT-PCR enzyme mix中包含反转录酶和高耐受性Taq DNA聚合酶。对一系列参数进行摸索，包括引物浓度、探针浓度、DirectRT-PCR enzyme mix的用量等。设置阳性对照和阴性对照；其中阳性对照使用1μL AIV RNA为模板(100μL AIV样本用柱提法来提取，用100μL RNase-free水来洗脱RNA)；阴性对照用1μL AIV阴性样本为模板。每种样本(包括阴性、阳性对照)各3个重复。
经过摸索，确定了直接扩增RT-PCR的反应体系。在25μL反应体系中包含12.5±0.5μL Direct RT-PCR 2×buffer mix,1±0.25μL Direct RT-PCR enzyme mix，0.3±0.1μM流感病毒A型上游引物(SEQ ID NO:1)，0.3±0.1μM流感病毒A型下游引物(SEQ ID NO:2)，0.2±0.1μM流感病毒A型探针(SEQ ID NO:3)，0.3±0.1μM流感病毒B型上游引物(SEQ ID NO:4)，0.3±0.1μM流感病毒B型下游引物(SEQID NO:5),0.2±0.1μM流感病毒B型探针(SEQ ID NO:6)，2～10μL检测样本，其余为去离子水。
最优的直接扩增RT-PCR反应体系为：在25μL反应体系中包含12.5μLDirect RT-PCR 2×buffer mix,1μL Direct RT-PCR enzyme mix，0.3μM流感病毒A型上游引物(SEQ ID NO:1)，0.3μM流感病毒A型下游引物(SEQ ID NO:2)，0.2μM流感病毒A型探针(SEQ ID NO:3)，0.3μM流感病毒B型上游引物(SEQ ID NO:4)，0.3μM流感病毒B型下游引物(SEQ ID NO:5)，0.2μM流感病毒B型探针(SEQ IDNO:6)，10μL检测样本，其余为去离子水。
3、荧光定量直接扩增RT-PCR反应条件的摸索
将步骤2中筛选出最优反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪中，对系列反应条件进行摸索，包括：
(1)病毒RNA释放及反转录的温度(55～60℃)；
(2)退火/延伸温度(60～65℃)、退火/延伸时间(30～120s)、PCR循环数(35～45)。
在PCR过程中，在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光信号(FAM和ROX)。
经过摸索，确定了荧光定量直接扩增RT-PCR的反应程序：55±1℃反应20min，50℃反应10min，95℃反应5min；94℃变性5s，56±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。最优的荧光定量直接扩增RT-PCR反应条件为：55℃反应20min，50℃反应10min，95℃反应5min；94℃变性5s，56℃退火/延伸40s，反应40个循环。
4、结果判定
采用步骤2的最优反应体系，步骤3的最优反应条件对检测样本进行直接扩增RT-PCR，从荧光定量PCR上获取各反应管的扩增曲线和Ct值，计算每种样本的Ct平均值。当阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照Ct值小于30并且有典型的扩增曲线时结果有效。
样本的靶基因检测，若无扩增曲线，则为阴性；FAM通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本A型流感阳性；ROX通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本B型流感阳性；Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于该检测方法检测限。
以流感病毒A型和B型临床样本(A型11个样本，B型9个样本)进行直接扩增RT-PCR，结果如表1所示。
表1直接扩增RT-PCR检测结果
样本 流感病毒A型 流感病毒B型
直接扩增的RT-PCR检测平均Ct值 31.2 30.5
基于RT-PCR检测平均Ct值 28.8 31.0
该结果显示：直接扩增的RT-PCR检测平均Ct值与基于RT-PCR检测平均Ct值相当，说明本发明的直接扩增RT-PCR方法检测流感病毒跟传统的以纯化的RNA为模板的RT-PCR法结果相近。
实施例2测试实施例1的检测方法的灵敏度
采用步骤2的最优反应体系，步骤3的最优反应条件对咽拭子液样本和尿囊液样本进行直接扩增RT-PCR，从荧光定量PCR上获取各反应管的扩增曲线和Ct值，计算每种样本的Ct平均值。从图1可以看出，针对咽拭子液样本，使用1μL纯化的AIV RNA为模板，荧光定量PCR的Ct值A型核酸样本是19.42，B型核酸样本是19.53，而采用实施例1的直接扩增RT-PCR从1μL AIV PBS洗脱液中检测到的Ct值A型核酸样本是18.93，B型核酸样本是21.23(如图1)。
针对尿囊液样本，使用1μL纯化的AIV RNA为模板，荧光定量PCR的Ct值A型核酸样本是20.11，B型核酸样本是19.64，而采用实施例1的直接扩增RT-PCR从1μL AIV尿囊液中检测到的Ct值A型核酸样本是19.29，B型核酸样本是21.68(如图2)，该结果说明本发明的直接扩增RT-PCR方法检测AIV的灵敏性能够跟传统的以纯化RNA为模板的RT-PCR法相媲美。
实施例3测试实施例1的检测方法的咽拭子液耐受能力
按照实施例1步骤2的最优反应体系来配制除咽拭子液外的反应液；将1μLAIV阳性咽拭子液，用不含AIV的阴性咽拭子液分别稀释至2.5,5,7.5,10μL，然后分别加入反应管中，使各管中的AIV病毒拷贝数保持一致，而咽拭子液占总体积的百分比分别为10％,20％,30％,40％。将各反应管放入荧光定量PCR仪，按实施例1步骤3的最优反应条件进行反应。
结果如图3所示，直接扩增RT-PCR在高达40％的咽拭子液中仍有较高活性，与10％浓度相比Ct值变化小于2个值，具有很高的耐受性。
实施例4测试实施例1的检测方法的检测动态范围及线性度
按照实施例1步骤2的最优反应体系来配制除样本外的反应液；取一份AIV咽拭子液阳性样本，用不含AIV的阴性咽拭子液进行稀释，得到10倍梯度的阳性咽拭子液样本100,10-1,10-2,10-3，所有反应管维持5％的咽拭子液终浓度。分别取各种稀释度的咽拭子液10μL加入反应管，置于荧光定量PCR仪，按实施例1步骤3的最优反应条件进行反应。
结果表明，1000倍稀释的咽拭子液仍得到阳性检测信号(图4为各浓度荧光PCR曲线图，图5为线性范围图)；稀释倍数和Ct值之间的相关系数为0.9992，表明线性关系较好。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1. 一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
2. 一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。
3. 根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX荧光报告基团。
4. 一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX荧光报告基团。
6. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶和Taq DNA聚合酶。
7. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR增强剂；
优选地，所述PCR增强剂选自肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP-40中的一种或多种。
8. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭子液、组织渗出液或尿囊液。
9. 权利要求1所述的引物在制备流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
10. 权利要求2所述的探针在制备流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
CN201510019605.XA 2015-01-15 2015-01-15 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用 Pending CN104561383A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510019605.XA CN104561383A (zh) 2015-01-15 2015-01-15 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510019605.XA CN104561383A (zh) 2015-01-15 2015-01-15 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104561383A true CN104561383A (zh) 2015-04-29

Family

ID=53078457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510019605.XA Pending CN104561383A (zh) 2015-01-15 2015-01-15 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104561383A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755170A (zh) * 2016-04-05 2016-07-13 深圳澳东检验检测科技有限公司 一种用于禽流感病毒通用型直接rt-pcr检测的引物和探针及试剂盒
CN107034310A (zh) * 2017-01-24 2017-08-11 南方医科大学 一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组及其试剂盒
CN107267667A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 成都海之元生物科技有限公司 Dna/rna病毒pcr实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法
CN111363793A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种免提取全血pcr扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181579B (zh) * 2011-04-11 2013-06-12 深圳国际旅行卫生保健中心 呼吸道病毒检测试剂盒及检测方法
CN104059997A (zh) * 2014-06-06 2014-09-24 深圳市疾病预防控制中心 检测a型和b型流感病毒、人偏肺病毒，nl63型、hku1型和oc43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181579B (zh) * 2011-04-11 2013-06-12 深圳国际旅行卫生保健中心 呼吸道病毒检测试剂盒及检测方法
CN104059997A (zh) * 2014-06-06 2014-09-24 深圳市疾病预防控制中心 检测a型和b型流感病毒、人偏肺病毒，nl63型、hku1型和oc43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
程小雯等: "荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究", 《中国热带医学》, vol. 5, no. 9, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 1782 - 1785 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755170A (zh) * 2016-04-05 2016-07-13 深圳澳东检验检测科技有限公司 一种用于禽流感病毒通用型直接rt-pcr检测的引物和探针及试剂盒
CN107034310A (zh) * 2017-01-24 2017-08-11 南方医科大学 一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组及其试剂盒
CN107267667A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 成都海之元生物科技有限公司 Dna/rna病毒pcr实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法
CN111363793A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种免提取全血pcr扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103397107B (zh) 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103160615B (zh) 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN105039586A (zh) 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒
CN104099428B (zh) 一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光pcr引物、探针和试剂盒
CN103725796A (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备
CN106435039A (zh) 一种检测猪繁殖与呼吸综合征类nadc‑30毒株的引物、探针、试剂盒及方法
CN104561383A (zh) 流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用
CN102559935A (zh) 一种基于m基因的尼帕病毒荧光rt-pcr检测方法
CN105112558B (zh) 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒
CN108018378A (zh) 一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
CN103255232B (zh) 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN101363063B (zh) 三重荧光定量rt-pcr检测a、b和h5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法
CN103045754A (zh) 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt-pcr方法及其试剂盒
CN104498627A (zh) H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103789455B (zh) 一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光qrt-pcr引物、探针及其使用方法
CN102071263B (zh) 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒
CN101921870A (zh) 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒
CN105238880A (zh) 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒
CN106119421B (zh) 猪蓝耳病qyyz株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒
CN102676697A (zh) 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒
CN103397108A (zh) 猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN102329889B (zh) 用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法
CN107227380A (zh) 一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150429