CN103255232B - 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特异性引物和探针如下：H7引物和探针：5’-GAAGAGGCAA TGCAAAATAGAATACA-3’，5’-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCAC A-3’，FAM-ACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGC TACAA-BHQ1；N9引物和探针：5’-CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT-3’，5’-CGTTGTGG CATACACATTCAGA-3’，HEX-AACACATGGGCCCGAAACATACTA AGAACA-BHQ1。本发明试剂盒灵敏、快速，能同时对病毒的HA基因和NA基因进行检测，在实际工作中发挥了很好的作用。

Description

禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法
（一）技术领域
本发明涉及一种禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。
（二）背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的禽类急性传染病，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一,被国际兽疫局定为A类传染病。近年来研究发现，禽流感病毒可突破种族屏障，感染人类致病甚至死亡。2013年，中国在全世界范围内首次出现禽流感H7N9亚型病毒感染人类的传染病疫情，已致多人死亡。
因此对于疾病的治疗和疫情的有效控制，建立快速、敏感、准确的禽流感H7N9病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用，它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性，克服了常规血清学和普通PCR方法的不足，是一种很有应用价值的诊断方法。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，所述特异性引物和探针如下：
H7上游引物：5’-GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA-3’；
H7下游引物：5’-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACA-3’；
H7荧光探针：FAM-ACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAA-BHQ1；
N9上游引物：5’-CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT-3’；
N9下游引物：5’-CGTTGTGGCATACACATTCAGA-3’；
N9荧光探针：HEX-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1；
其中，FAM、HEX为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。
本发明关键在于特异性引物和探针的设计，试剂盒内的其他组分，为本领域常规用于RT-PCR的反应试剂，如dNTP mix、MgCl2、buffer、酶等，本领域普通技术人员可根据常识进行选择，可自行配制，也可选用市购商品，如Roche公司的RT-PCR system1938823试剂盒等。
本发明还涉及一种利用所述检测试剂盒检测禽流感H7N9病毒的方法，所述方法包括：
（1）提取待测样品RNA；所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
（2）以待测样品RNA为模板，加入特异性引物和探针，以及RT-PCR反应试剂，配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应；
所述特异性引物和探针如下：
H7上游引物：5’-GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA-3’
H7下游引物：5’-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACA-3’
H7荧光探针：FAM-ACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAA-BHQ1；
N9上游引物：5’-CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT-3’
N9下游引物：5’-CGTTGTGGCATACACATTCAGA-3’
N9荧光探针：HEX-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1；
（3）荧光RT-PCR检测以Ct值﹤37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性；Ct值在35～37之间需重复实验，两次实验均能得到良好S型扩增曲线方则判定为阳性。
优选的，步骤（2）扩增反应条件为：42℃15min进行逆转录，95℃2min变性，然后94℃10s，55℃35s，在55℃进行双色FAM、HEX荧光检测，共进行40个循环。
为了预防与应对人感染禽流感的发生，并进一步及时进行早期鉴别确诊，达到早诊断、早隔离、早治疗的目的，本发明建立了禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒，可用于H7N9禽流感病毒核酸的实验室检测。该试剂盒灵敏、快速，检出限可达10拷贝/反应，由于设置了双色荧光探针，增加了检测的特异性和简便性，能同时对病毒的HA基因和NA基因进行检测，有利于疾病预防控制中对禽流感H7N9疑似疫情的快速诊断与对类似症状其他患者的排除，在实际工作中发挥了很好的作用。
（四）附图说明
图1为双重荧光RT-PCR法检测禽流感H7N9病毒的灵敏度结果；A～E分别代表不同的病毒基因拷贝浓度，从A至D依次为10000、1000、100、10个基因拷贝；
图2为双重荧光RT-PCR法检测对禽流感H7N9患者临床样本的检测结果。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1材料与方法
1.1病毒株与临床标本：
流感病毒株甲1/北京/56/97、甲3/悉尼/5/97、乙型/深圳/12/97等流感毒株由中国疾病预防控制中心提供。
疑似患者的咽拭子标本由浙江省各地市疾病预防控制中心采集送检。
样品RNA提取采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
1.2引物与探针
从美国GenBank下载不同年代与地区的20余株H7N9基因序列，用生物学软件进行同源性比较，选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为：
H7上游引物：5’-GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA-3’
H7下游引物：5’-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACA-3’
H7荧光探针：FAM-ACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAA-BHQ1；
N9上游引物：5’-CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT-3’
N9下游引物：5’-CGTTGTGGCATACACATTCAGA-3’
N9荧光探针：HEX-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1；
引物和探针委托宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.3荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：
选用Roche公司的RT-PCR system1938823试剂盒，按说明书操作，反应。各反应物的终浓度为：dNTP mix0.2mM、MgCl27.5mM、Taq酶和逆转录酶混合物0.5μl（各5U/μl）、模板RNA10μl、引物和探针浓度分别为0.8μM与0.4μM，最后用DEPC水补至25μl。
用ABI7500Real Time PCR System按下列参数进行：42℃15min进行逆转录，95℃2min变性，然后94℃10s，55℃35s，在55℃进行双色FAM、HEX荧光检测，共进行40个循环。
结果判断：荧光RT-PCR检测以Ct值﹤37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则。其中Ct值<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性；Ct值在35～37之间需重复实验，两次实验均能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性。
体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，选用不同浓度的引物和探针，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度与比例，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。Mg2+的浓度高低对Taq酶的活性与扩增的特异性密切相关，在同一反应体系条件下改变Mg2+浓度，对Mg2+浓度进行优化。采用MJ ResearchOpticonTM2荧光定量PCR仪上的温度梯度功能，在Tm值（48℃～62℃）下进行检测，选择最佳Tm温度。
1.5荧光RT-PCR特异性、敏感性试验
选择流感病毒株甲1/北京/56/97、甲3/悉尼/5/97、乙型/深圳/12/97流感病毒株及副流感等常见呼吸道病毒株，对上述病毒株提取核酸，用双重荧光RT-PCR检测方法进行检测，验证方法的特异性；
分别将H7和N9的荧光RT-PCR目的片段与pGEM-T载体连接，转化宿主菌DH5α，提取质粒，经鉴定后用分光光度计测定吸光度，计算其拷贝值作为病毒核酸定量标准品。质粒DNA的提取采用Promega超纯质粒DNA提取Kit，按试剂盒说明书提取。对已标定拷贝数的H7及N9基因质粒进行梯度稀释，检测验证方法的最低检出限。
2结果
2.1荧光RT-PCR反应体系及条件
采用Roche公司的RT-PCR system1938823试剂盒，反应体系为25μl。优化后的反应体系Mg2+浓度为7.5mM，Tm温度55℃，矩阵法优选后引物探针的最佳浓度分别为0.8μM和0.4μM。
各反应物的终浓度为：dNTP mix0.2mM、MgCl27.5mM、Taq酶和逆转录酶混合物0.5μl（5U/μl）、模板RNA10μl、引物和探针浓度分别为0.8μM与0.4μM，最后用DEPC水补至25μl。
用ABI7500Real Time PCR System按下列参数进行：42℃15min进行逆转录，95℃2min变性，然后94℃10s，55℃35s，在55℃进行双色FAM、HEX荧光检测，共进行40个循环。
2.2特异性试验
本发明建立的双重荧光RT-PCR方法对禽流感H7N9病毒具有较好的特异性，与其他亚型流感病毒及呼吸道病毒均无交叉反应。
2.3敏感性试验
对已标定拷贝数的H7及N9基因质粒进行梯度稀释，检测验证方法的最低检出限。结果H7以及N9的检测下限均为10个基因拷贝（图1）。2.4临床样本的检测
对疑似患者的标本进行检测，检出一例阳性样本（与临床诊断结果相符），结果能得到良好的扩增曲线（图2）。

Claims (1)

1.一种禽流感H7N9病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，其特征在于所述特异性引物和探针如下：
H7上游引物：5’-GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA-3’；
H7下游引物：5’-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACA-3’；
H7荧光探针：FAM-ACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAA-BHQ1；
N9上游引物：5’-CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT-3’；
N9下游引物：5’-CGTTGTGGCATACACATTCAGA-3’；
N9荧光探针：HEX-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1；
其中,FAM、HEX为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。
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