CN109136406B - 一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒 - Google Patents

一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；微孔板包括多个微孔；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。本发明的试剂盒重复性和灵敏度均高，特异性较好，且操作方便，快捷，无需电泳进行检测RT‑PCR结果。

Description

一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，尤其涉及一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒。
背景技术
甲型流感病毒为常见流感病毒，非常容易发生变异，因此有很多甲型流感病毒亚型。这些亚型则被人们称为“禽流感”。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。因此非常有必要对甲型流感病毒亚型H1N1、H5N1、H7N9进行检测。目前对于这几种亚型上没有很好的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能快速、高效检测甲型流感病毒亚型中的H1N1、H5N1、H7N9的试剂盒。
具体方案是：一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；
所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为-NH2-(CH2)n-，n＝4-8；所述核心引物的序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.6所示；其中，SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQ ID NO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQ ID NO.2所示的序列和SEQ ID NO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQ ID NO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQ ID NO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。
进一步地，所述微孔的孔壁突出于所述微孔与相邻所述微孔之间的第一连接区域以及所述微孔与所述微孔板侧壁之间的第二连接区域。该结构增加了微孔壁的弹性，使得微孔的孔径能在本领域技术人员知悉的范围内发生微小的变化，从而有利于盖紧。即有利于微孔与微孔板盖上的环形凸起伸入微孔板的微孔时，微孔的孔径适应性地撑大，以便盖紧；当环形凸起离开微孔时，微孔的孔径又能适应性地回原。
进步一地，还包括辅助引物；所述辅助引物的序列如SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.9所示，其中SEQ ID NO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQ ID NO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQ ID NO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。辅助引物可在扩增初期与荧光标记的反向引物先预扩增出一些DNA片段，以便于连接在磁珠上的正向引物更容易与预扩增的DNA片段退火结合，提高磁珠参与的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的效率，提高检测的灵敏度。
进一步地，所述5’端带荧光标记的反向引物与所述辅助引物的物质的量的比例为10～20:1。由于5’端带荧光标记的反向引物的量是辅助引物的10到20倍，因此没有与辅助引物搭配进行RT-PCR扩增的5’端带荧光标记的反向引物可以与羧基磁珠上连接的正向引物匹配进行RT-PCR扩增，从而将目的基因连接到羧基磁珠上，避免RT-PCR扩增只发生在反向引物与辅助引物之间。对应地，序列如SEQ ID NO.4所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQ ID NO.7所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1；序列如SEQ ID NO.5所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQ ID NO.8所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1；序列如SEQ ID NO.6所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQ ID NO.9所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1。
进一步地，还包括H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板和H7N9亚型阳性对照模板；所述H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.10所示的质粒；所述H5N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.11所示的质粒；所述H7N9亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.12所示的质粒。
进一步地，还包括RT-PCR试剂，所述RT-PCR试剂来自天根一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN One step RT-PCR Kit)。
进一步地，所述微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。
进一步地，还包括盒体和与所述盒体的内壁贴合的支架；所述支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽和若干试剂瓶槽。
可选地，所述试剂瓶槽的数量是6个，对应地用于放置装盛连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶、辅助引物的试剂瓶、5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶、H1N1亚型阳性对照模板的试剂瓶、H5N1亚型阳性对照模板的试剂瓶和H7N9亚型阳性对照模板的试剂瓶。其中，连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶内为等比例(m/m)混合的核心序列如SEQ ID NO.1所示的磁珠、核心序列如SEQ ID NO.2所示的磁珠和核心序列如SEQ IDNO.3所示的磁珠。辅助引物的试剂瓶内为等比例(物质的量之比)混合的3种基因序列，其序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶内为等比例(物质的量之比)混合的5’端分别标记了CY5、VIC和FAM的3种基因序列，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述支架上还设置有RT-PCR试剂槽，用于放置RT-PCR试剂。
进一步地，微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区；下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地，微孔板的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口，用于机器手握持。
可选地，下分选区的纵剖面呈梯形或扇形。
可选地，下分选区呈顶面小底面大的圆台状。
可选地，微孔的孔壁内侧设置有侧壁凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地，微孔的底部内侧设置有底部凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地，底部凸起呈T字形、倒L字型或倒梯形。
进一步地，每个微孔中包括多个下分选区。
本发明的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，能够高通量、快速、灵敏、特异性检测甲型流感病毒样品，对病原性高的甲型流感病毒H1N1、H5N1和H7N9亚型进行核酸分型，具有很重要的应用价值。
引物连接在磁珠上比固定在容器底部更有利于提高RT-PCR效率，因为相对于固定引物，磁珠仅在主电磁吸盘通电时产生的磁场作用下处于容器底部，一旦断开主电磁吸盘的电源，磁场消失，磁珠又可以很容易的离开容器底部，因此，磁珠上的引物可以更好的与其他试剂混合。
由于不同亚型的病毒对应不同的荧光标记，且生成的RT-PCR产物是结合在磁珠上的，因此可以通过磁性吸附作用将结合在磁珠上的RT-PCR产物与没有发生RT-PCR反应的荧光标记引物分离开，避免其他荧光信号的影响，从而可以采用酶标仪读出检测结果。无需实验室配备实时定量RT-PCR相关设备，以及设计相关探针。
主电磁吸盘和下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积，这两个技术特征的设定使得磁珠在重力和磁场作用下进入下分选区，且不易从下分选区出来，从而有利于磁珠的固定吸附，将结合在磁珠上的物质与未结合上磁珠的物质进行分离，达到将PCR产物与其他物质有效分离的目的。
此外，主电磁吸盘还有利于微孔板中的物质混合。即可以采用能被主电磁吸盘吸住的机器手臂来混匀微孔内的反应物。
辅电磁吸盘和主电磁吸盘可互相吸引，使得微孔板盖盖的更紧。
使用时还可通过变换辅电磁吸盘和主电磁吸盘的电流方向，使得磁珠在微孔底部和微孔顶部之间来回运动，从而达到混匀的目的。下分选区较小的上表面面积有利于延长磁珠在微孔底部和顶部来回运动的时间，使得磁珠在微孔底部、微孔顶部和顶部底部之间的时间更加均衡，从而有利于混匀，提高了分选得率和检测灵敏度。
本发明的微孔构造有利于分离比重不同的物质，尤其是溶液中沉淀的分离，为改良生物医学检验领域的技术方法提供了新的基础。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明所涉及的支架的一个具体实施例的结构示意图；
图2是微孔板阵列模式图；
图3是实施例2的荧光检测结果示意图；
图4是本发明所涉及的微孔板、微孔板盖、主电磁吸盘、辅电磁吸盘的结构示意图；
图5是图4中的A-A剖视图用于展示一个具体实施例的微孔结构；
图6是图4中的A-A剖视图用于展示另一个具体实施例的微孔结构；
图7是本发明所涉及的微孔板盖的侧面结构示意图。
具体实施方式
下面具体实施例结合附图对本发明做进一步阐述，但应理解为这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。羧基磁珠为市售的羧基磁珠，比如在下述实施例中羧基磁珠购自中科雷鸣(北京)科技有限公司。RT-PCR试剂为市售的RT-PCR试剂，在下述实施例中RT-PCR试剂来自天根一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN One step RT-PCR Kit)。下述实施例中所用到的试剂除特别说明外，均可以从市场上购买到。主要仪器：Bio-Rad_Mycycler PCR仪、Bio-Rad iMark酶标仪。
实施例1
本实施例的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒由微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、可拆卸地设置在微孔板盖顶面的辅电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠、5’端带荧光标记的反向引物、辅助引物、H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板、H7N9亚型阳性对照模板、RT-PCR试剂、盒体和与盒体的内壁贴合的支架。
磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成，其中连接分子为-NH2-(CH2)n-，n＝4-8；核心引物的序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.3所示。带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.6所示；SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQ ID NO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQ ID NO.2所示的序列和SEQ ID NO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQID NO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQ ID NO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。
辅助引物的序列如SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.9所示，其中SEQ ID NO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQ ID NO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQID NO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。
所有连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠都等比例(m/m)地装在一个试剂瓶内(将该试剂瓶命名为连接有正向引物的磁珠试剂瓶)。在本实施例中有3种连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠，即：连接分子均为-NH2-(CH2)6-，但存在3种不同序列的核心引物，3条序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3种5’端带荧光标记的反向引物均等比例地装在另一个试剂瓶内(将该试剂瓶命名为带荧光标记引物的试剂瓶)。
3种辅助引物也均等比例地装在另一个试剂瓶内(将该试剂瓶命名为辅助引物试剂瓶)。
如图1所示，支架上设置有微孔板槽32、微孔板盖槽33、主电磁吸盘槽34、辅电磁吸盘槽35、RT-PCR试剂槽36和若干试剂瓶槽37。试剂瓶槽37的数量是6个，对应地用于放置装盛连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠、5’端带荧光标记的反向引物、辅助引物、H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板、H7N9亚型阳性对照模板的试剂瓶。
如图2所示，微孔板包括多个微孔。
如图5和3所示，微孔11的孔壁14突出于与相邻微孔11之间的第一连接区域13，也突出于与微孔板侧壁16之间的第二连接区域15。微孔板侧壁16突出于第二连接区域15。微孔板盖2上设置有与微孔11的内径匹配的环形凸起21(如图7所示)。微孔板1与微孔板盖2被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。
5’端带荧光标记的反向引物与辅助引物的物质的量的比例为10～20:1。由于5’端带荧光标记的反向引物的量是辅助引物的10到20倍，因此没有与辅助引物搭配进行RT-PCR扩增的5’端带荧光标记的反向引物可以与羧基磁珠上连接的正向引物匹配进行RT-PCR扩增，从而将目的基因连接到羧基磁珠上，避免RT-PCR扩增只发生在反向引物与辅助引物之间。
H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.10所示的序列的质粒；H5N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.11所示的序列的质粒；H7N9亚型阳性对照模板为带有如SEQID NO.12所示的序列的质粒。
实施例2
1、引物序列与质粒中的插入基因序列
根据Genebank数据库中甲型流感病毒H1N1、H5N1和H7N9的HA基因序列，设计相应地核心引物、5’端带荧光标记的反向引物(表1中简称反向引物)和辅助引物，序列如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0001794349340000061
Figure BDA0001794349340000071
在H1N1反向引物5’端连上荧光标记CY5，形成荧光标记为CY5的H1N1反向引物；在H5N1反向引物5’端连上荧光标记VIC，形成荧光标记为VIC的H5N1反向引物；在H7N9反向引物5’端连上荧光标记FAM，形成荧光标记为FAM的H7N9反向引物。
在本实施例中5’端的连接分子为-NH2-(CH2)6-。因此H1N1、H5N1和H7N9各自对应的磁珠连接正向引物分别为5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTCCACAACGGAAAACTATGT-3’，5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTCATGTCCATACCATGGGAG-3’和5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGAT-3’。以上引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将表1中3种亚型的HA基因的辅助引物和反向引物所扩增的基因序列加上特定的接头序列后，碱基数为80-160bp(如表2所示)，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成并连接到pGEM-T载体质粒上，且将各亚型的质粒定量为1μg/ml。
表2各亚型的质粒插入的基因序列
Figure BDA0001794349340000072
2、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠
配置连接液：0.1M 2-吗啉乙磺酸，0.25％(v/v)吐温-20，10mM碳二亚胺盐酸盐，用盐酸和/或氢氧化钠调pH值至5。
配置纯化缓冲液：10mM pH7.4的PBS，0.25％(v/v)吐温-20。
配置磁珠保存液：20nmol/μl的Tris碱，20mmol/μl氯化镁，50mmol/μl氯化钾，0.25％(v/v)吐温-20，0.5％(m/m)的BSA。
以制备连接有H1N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠为例：取1mg粒径200nm的表面修饰有羧基的磁珠，用200μl、0.01M的氢氧化钠溶液以及去离子水分别清洗磁珠；然后向磁珠中加入1nmol H1N1的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQ ID NO.1所示)和100μl的连接液，室温孵育5h，用混匀器轻微摇动；然后用磁分离器将连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠分离出来，用纯化缓冲液清洗2次；最后将清洗后的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠4℃保存在100μl的磁珠保存液中备用。
同理制备连接有H5N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠，只是将H1N1的磁珠连接正向引物替换为H5N1的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQID NO.2所示)。
同理制备连接有H7N9的磁珠连接正向引物的羧基磁珠，只是将H1N1的磁珠连接正向引物替换为H7N9的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQID NO.3所示)。
3、病毒RNA的提取
取甲型流感病毒采样液200μl，加入500μl裂解液，按RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，货号#74104)说明书提取病毒RNA 50μl。
4、RT-PCR反应
(1)体系配置：使用QIAGEN One step RT-PCR Kit(货号#210212)反应液。体系配置具体如表3所示。
表3 RT-PCR反应体系配置
组分 体积(μl)
5×QIAGEN One step RT-PCR缓冲液 10
10mM dNTP 2
QIAGEN One step RT-PCR酶混合液 2
RNase抑制剂 0.2
连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠# 10(μg)
5’端带荧光标记的反向引物* 1
辅助引物** 1
模板## 10
无RNase的水 至50
#连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠为连接有H1N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠、连接有H5N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠和连接有H7N9的磁珠连接正向引物的羧基磁珠等比例(m/m)混合物。
*5’端带荧光标记的反向引物为荧光标记为CY5的H1N1反向引物、荧光标记为VIC的H5N1反向引物和荧光标记为FAM的H7N9反向引物等比例(物质的量之比)混合液。
**辅助引物为H1N1辅助引物、H5N1辅助引物和H7N9辅助引物等比例(物质的量之)混合液。
##模板根据上样到不同的微孔中而分别为：病毒RNA提取物、p-H1N1、p-H5N1、p-H7N9、无RNase的水(作为阴性对照)、p-H1N1的10倍稀释液、p-H1N1的100倍稀释液、p-H5N1的10倍稀释液、p-H5N1的100倍稀释液、p-H7N9的10倍稀释液和p-H7N9的100倍稀释液。在本实施例中各模板在微孔板(本实施例中该微孔板为8×12的96孔板)上的上样位置如图2所示为：
p-H1N1：A1、B12、G11、H2和E7；
p-H5N1：A2、B11、G12、H1和D7；
p-H7N9：B2、A11、H12、G1和D6；
阴性对照：B1、A12、H11、G2和E6；
p-H1N1的10倍稀释液：B3、B4和B5；
p-H1N1的100倍稀释液：C3、C4和C5；
p-H5N1的10倍稀释液：D3、D4和D5；
p-H5N1的100倍稀释液：E3、E4和E5；
p-H7N9的10倍稀释液：F3、F4和F5；
p-H7N9的100倍稀释液：G3、G4和G5；
病毒RNA提取物：其余的微孔。
(2)反应程序
60℃作用1分钟；
Figure BDA0001794349340000091
回到第5步，40个循环；
72℃10分钟；
4℃保存。
按照表3所列的体系加入本发明所涉及的微孔板中。然后盖紧微孔板盖，放入PCR仪，按照上述反应程序开始RT-PCR反应。
5、后处理
反应结束后，将微孔板从PCR仪中取出，打开微孔板盖；然后将主电磁吸盘装设在微孔板底部并接通主电磁吸盘的电源，将磁珠吸附在微孔底部；然后用移液器小心吸走微孔中的液体，勿吸走磁珠。
加入无RNase的水到微孔中清洗去除残留的未与磁珠结合的5’端带荧光标记的反向引物。具体方式是：
盖上并盖紧微孔板盖，注意确保微孔板盖以与RT-PCR反应时相同的对应方式盖在微孔板上，即原先是微孔板盖的A1与微孔板的A1对应的，那么再次盖上时也要保证微孔板盖的A1与微孔板的A1对应，从而避免不同微孔之间反应产物的交叉污染。
将辅电磁吸盘安装到微孔板盖的上表面，接通辅电磁吸盘的电源的同时关闭主电磁吸盘的电源，使得位于微孔底部的磁珠向微孔盖方向移动。然后关闭辅电磁吸盘的电源的同时开启主电磁吸盘的电源，使得磁珠又从微孔的顶部向底部移动。如此往复数次后，停留在关闭辅电磁吸盘的电源的同时开启主电磁吸盘的电源的状态，使得磁珠吸附在微孔底部。然后用移液器将吸走微孔中的液体，保留磁珠。
6、荧光检测
将微孔板放入酶标仪或流式细胞仪中，采用CY5、VIC和FAM对应的激发波长及检测波长进行检测。CY5的激发波长620-650nm，检测波长675-730nm；VIC的激发波长500-535nm，检测波长560-580nm；FAM的激发波长450-490nm，检测波长515-530nm。
图3给出了检测结果示意图。对于3组阳性对照(p-H1N1、p-H5N1和p-H7N9)的5个重复，均能检测出相应的荧光标记，这说明检测的重复性好和特异性强；对于阴性对照的5个重复均没有检测出荧光标记，证明试验结果可采用；对于稀释100倍的3组阳性对照依然能检测出相应的荧光标记，说明灵敏度高和特异性强。B7、C9检测到CY5荧光标记，证明B7和C9位置的甲型流感病毒亚型为H1N1；F8、F9和H10检测到VIC荧光标记，证明F8、F9和H10位置的甲型流感病毒亚型为H5N1；D9和E10检测到FAM荧光标记，证明D9和E10位置的甲型流感病毒亚型为H7N9。其余的加入了病毒RNA提取物的微孔没有检测到荧光标记，则说明它们的亚型不在H1N1、H5N1和H7N9之中。
因此，本发明的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒能够快速、简便的区分出甲型流感病毒的3种亚型，而且重复性好，灵敏度高，特异性强。对于特异性来说，还可以进一步的采用更多的病毒类型来进行验证，本发明仅验证了H1N1、H5N1和H7N9之间的特异性。故本发明中的特异性高仅指在H1N1、H5N1和H7N9之中的特异性高。
本发明另外做的些小改进可以是：在一些实施例中，微孔板1的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口12，用于机器手握持。
在一些实施例中，微孔板1包括多个微孔11。微孔11包括彼此连通的上混合区和下分选区。如图5和图6所示，微孔11中，虚线以上为上混合区，虚线以下为下分选区。下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
在一些实施例中，下分选区的纵剖面呈梯形(如图5所示)或扇形。
在一些实施例中，如图5所示，微孔11的孔壁14内侧(即内侧壁141)设置有侧壁凸起17使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
在一些实施例中，如图6所示，微孔11的底部内侧设置有底部凸起18使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积，且底部凸起18呈T字形。
在图6所示的实施例中，每个微孔11中包括2个下分选区，1个上混合区。下分选区的数目不限于2个，可以是1个或3个及以上。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 宁波怡和医药科技有限公司
<120> 一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒
<130> 01003-18001PIX
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tttttttttt ttttttccac aacggaaaac tatgt 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tttttttttt ttttttcatg tccataccat gggag 35
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tttttttttt ttttttgagg caatgcaaaa tagaatacag at 42
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tgtttctaca atgtaggacc atg 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gtgaatcccc cacagtact 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ccgaagctaa accaaagtat caca 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccacaacgga aaactatgt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
catgtccata ccatgggag 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gaggcaatgc aaaatagaat acagat 26
<210> 10
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gaagacagcc acaacggaaa actatgtaga ttaaaaggaa tagccccact acaattggga 60
aatgtaacat cgccggatgg ctcttgggaa acccagaatg cgacccactg cttccagtga 120
gatcatggtc ctacattgta gaaaacacca aactctgaga 160
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
gagctcagca tgtccatacc atgggaggtc ctcctttttc agaaatgtgg tatggcttat 60
caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac aataatacca accaagaaga 120
tcttttagta ctgtggggga ttcaccatcc 150
<210> 12
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cacagcaaat acagggaaga ggcaatgcaa aatagaatac agattgaccc agtcaaacta 60
agcagcggct acaaagatgt gatactttgg tttagcttcg gggcatcatg tttcatact 119

Claims (7)

1.一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区；所述微孔的底部内侧设置有底部凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；
所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为-NH2-(CH2)n-，n=4-8；所述核心引物的序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.6所示；其中，SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQ ID NO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQ ID NO.2所示的序列和SEQ ID NO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQ ID NO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQ ID NO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM；
还包括辅助引物；所述辅助引物的序列如SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.9所示，其中SEQID NO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQ ID NO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQ ID NO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型；
所述5’端带荧光标记的反向引物与所述辅助引物的物质的量的比例为10~20: 1；
所述微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。
2.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，还包括H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板和H7N9亚型阳性对照模板；所述H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.10所示的DNA序列的质粒；所述H5N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.11所示的DNA序列的质粒；所述H7N9亚型阳性对照模板为带有如SEQID NO.12所示的DNA序列的质粒。
3.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，还包括RT-PCR试剂，所述RT-PCR试剂来自天根一步RT-PCR试剂盒。
4.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，所述微孔的孔壁突出于所述微孔与相邻所述微孔之间的第一连接区域以及所述微孔与所述微孔板侧壁之间的第二连接区域。
5.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，还包括盒体和与所述盒体的内壁贴合的支架；所述支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽和若干试剂瓶槽。
6.如权利要求5所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶槽的数量是6个，对应地用于放置装盛连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶、辅助引物的试剂瓶、5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶、H1N1亚型阳性对照模板的试剂瓶、H5N1亚型阳性对照模板的试剂瓶和H7N9亚型阳性对照模板的试剂瓶；连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶内为等质量比混合的核心序列如SEQ ID NO.1所示的磁珠、核心序列如SEQ ID NO.2所示的磁珠和核心序列如SEQ ID NO.3所示的磁珠；辅助引物的试剂瓶内为等物质的量比混合的3种基因序列，其序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶内为等物质的量比混合的5’端分别标记了CY5、VIC和FAM的3种基因序列，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
7.如权利要求5所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，所述支架上还设置有RT-PCR试剂槽。
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