TW201903147A - 核酸萃取方法及裝置 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種核酸萃取方法，其藉由使用一兼具裂解和萃取功能的通用萃取液，以及使用奈米級磁珠被使用做為吸附核酸的固相擔體，使得細胞的裂解和核酸的萃取可以併合在單一步驟中同時進行。本發明又關於一種核酸萃取裝置，其包含一電磁鐵元件適於朝向水平方向對於反應施加外部磁場，致使奈米級磁珠固著於反應容器的內部側壁，而非固著於反應容器的底部，藉此容易地分離所述反應的固-液相。

Description

核酸萃取方法及裝置

本發明關於核酸萃取方法和裝置，特別是磁珠式核酸萃取方法和裝置。本案方法藉由使用一兼具裂解和萃取功能的通用萃取液，並且使用奈米級磁珠被使用做為吸附核酸的固相擔體，使得細胞的裂解和核酸的萃取可以併合在單一步驟中同時進行。本案核酸萃取裝置包含一電磁鐵元件適於朝向水平方向對於反應施加外部磁場，致使奈米級磁珠固著於反應容器的內部側壁，而非固著於反應容器的底部，藉此容易地分離所述反應的固-液相。

從來自於生物來源的樣品中萃取出核酸，乃是分子生物學研究和分子檢測的基礎工作。早期的核酸萃取技術涉及眾多的化學試劑處理和繁複的操作步驟。舉例來說，樣品通常必須先接受化學性或物理性的破胞工序，以破壞細胞或病毒外鞘以釋出內容物，接著利用酚和氯仿等有機溶劑進行萃取，以去除脂質、蛋白質雜質和細胞碎片，再以酒精或異丙醇處理水相而析出核酸。這個過程需要耗費半日至一整日，不僅產生有毒廢棄物，殘留於樣品中的有機溶劑更有干擾後續核酸反應的疑慮。繁複的作業流程尤其不利於處理大量樣品。

為了簡化核酸萃取工序，業界近年來已發展出磁珠萃取法，在磁珠表面建構官能基來吸附核酸。該方法依序涉及(1)裂解：運用裂解緩衝液（lysis buffer）破壞細胞或病毒外鞘以釋出核酸；(2)萃取：加入磁珠和高鹽度的結合緩衝液（binding buffer），促使核酸吸附於磁珠表面，利用電磁鐵吸引磁珠以去除脂質、蛋白質雜質和細胞碎片；(3)清洗；運用清洗緩衝液（wash buffer）洗滌磁珠以去除非專一性吸附物；以及(4)沖提：以低鹽度的沖提緩衝液（elution buffer） 使核酸脫離磁珠，再進行固液相分離，即可在液相獲得核酸。此種磁珠萃取法適合搭配自動化裝置，不僅節省人力，更可以同時處理大量樣品。

然而，上述方法仍有必須在裂解、萃取、清洗和沖提等步驟中持續藉由更換緩衝液來改變反應組成的缺點，致使處理效率不高。因此，相關技術領域中亟需一種在不會犧牲靈敏度和準確度的前提下操作更為簡便且處理效率更高的核酸萃取方法和裝置。

本案發明人已進行廣泛的研究，希望能滿足上述產業需求。現在，本案發明人意外地發現，使用兼具裂解細胞/病毒外鞘和核酸萃取功能的商品化通用萃取液來取代習用的裂解緩衝液和結合緩衝液，並且在裂解步驟就將磁珠加入反應，即可以在單一步驟中達成同時裂解細胞和萃取核酸之目的。這個新的方法可以在例如20分鐘的極短時間內取得高純度的核酸，供後續核酸反應之用，非常適用於需要處理大量生物樣品的高通量檢驗流程。

依據本案所揭第一態樣，本發明關於一種核酸萃取方法，其包含下列步驟： A.將一兼具裂解和萃取功能的通用萃取液和奈米級磁珠同時與一含有核酸的生物樣品相混合，使得該核酸被該奈米級磁珠所吸附，形成核酸-奈米級磁珠複合物； B.施加一外部磁場來固著該核酸-奈米級磁珠複合物，藉此由該生物樣品分離出該核酸-奈米級磁珠複合物；以及 C.從該奈米級磁珠洗提出該核酸。

依據本案所揭第二態樣，本發明關於一種核酸萃取裝置，其包含： 一載台，設有至少一個適用於承載一反應的槽孔，其被配置成能夠沿著一水平方向往復移動； 一電子式移液管，其被配置成能夠朝向一大致上垂直於該水平方向的垂直方向往復移動，並且適於將一液體供應至被承載於該至少一個槽孔的反應中，或者將一液體由該反應移出； 一溫控元件，設置於該載台下方，適用於調控該反應的溫度；以及 一電磁鐵元件，適於可操作地朝向該水平方向對於該反應施加一磁場。

除非另行說明，否則本案專利說明書和各請求項中所使用的下列用語具有下文給予的定義。請注意，本案說明書和各請求項中所使用的單數形用語「一」意欲涵蓋在一個以及一個以上的所載事項，例如至少一個、至少二個或至少三個，而非意味著僅僅具有單一個所載事項。此外，本案各請求項中使用的「包含」、「具有」等開放式連接詞是表示請求項中所記載的元件或成分之組合中，不排除請求項未載明的其他元件或成分。「基本上由…所組成」意指所記載的成分組合中不排除另外含有實質上不會影響所請發明之構成和性質的其他未記載元件或成分。

本案說明書中所使用的術語「核酸」意欲涵蓋由核苷酸鹼基所構成之聚合物，其包括但不限於去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、微RNA（miRNA）和彼等之組合，其中DNA可以是基因體DNA、粒線體DNA、染色體片段、DNA片段、質體DNA等。本案說明書中所使用的「核酸萃取」此術語包括但不限於裂解細胞或病毒外鞘，隨後捕集核酸，再由生物樣品分離出核酸的純化工序。本案說明書中所使用的術語「生物樣品」意欲涵蓋由生物體採得以供萃取作業的樣品，其包括但不限於植物組織、動物組織或人體組織；細胞群；真核或原核單胞；以及病毒。在一具體例中，所稱「生物樣品」可以來自人或動物的血液、血漿、血清、尿液、唾液、痰、精液、淚液、腹水、羊水或腦脊髓液等體液，甚至可以是刑事犯罪現場所採得的生物組織、體液、血漬等。當生物樣品的體積過大或質地過於堅韌時，可以事先進行均質化或粉碎化的預處理，以利於本發明的施行。

本案說明書中所使用的術語「兼具裂解和萃取功能的通用萃取液」是指由實驗室調配或經商品化的萃取液，生物樣品僅需接受該萃取液處理一段時間，較佳為在處理期間加熱以促進反應，即可獲得可供後續核酸反應的足量核酸，不需接受額外的物理性破胞作業、有機溶劑萃取工序和核酸沈澱工序。較佳為該萃取液可以促進核酸吸附於磁珠，及/或降低蛋白質非專一性吸附於磁珠。適用於本發明的通用萃取液包括但不限於UniversAll^TM 組織萃取緩衝液（商業上可得自於益生生技開發股份有限公司，台灣新北市）、REDExtract-N-Amp組織萃取緩衝液（商業上可得自於Sigma-Aldrich公司）和Lyse and Go^TM 試劑（商業上可得自於美國賽默飛世爾科技公司），尤以UniversAll^TM 組織萃取緩衝液為佳。

本案說明書中所使用的「奈米級磁珠」此用語是指直徑在10奈米至1,000奈米之間的超順磁氧化矽磁珠，較佳為直徑位在300奈米至1,000奈米的範圍內，其具有由鐵磁性（ferromagnetic）材料所製成的超順磁核心和氧化矽外層，任擇地經過額外的表面修飾，使得核酸（例如DNA）能夠在上述兼具裂解和萃取功能的通用萃取液所建立的環境下吸附於磁珠表面，而在低鹽度環境下由磁珠脫離。在一具體例中，奈米級磁珠的核心是由Fe₃O₄所製成，因此磁珠具有永磁性。施加外部磁場時，奈米級磁珠在磁場的驅動下會朝定向移動並且集中固著，當外部磁場被移除時，磁珠的磁矩則消失，亦即所稱的超順磁性。適用於本發明的奈米級磁珠包括但不限於經商品化的奈米級磁珠。在較佳的具體例中，所述奈米級磁珠是MagSure^TM 磁珠（商業上可得自於益生生技開發股份有限公司，台灣新北市）。

依據本發明，可以將上述兼具裂解和萃取功能的通用萃取液以及上述奈米級磁珠，同時與含有核酸的生物樣品相混合，使得在細胞/病毒外鞘被通用萃取液所裂解而釋出核酸的同時，奈米級磁珠能夠專一性地吸附核酸，以形成核酸-奈米級磁珠複合物。所述「混合」是指使生物樣品與通用萃取液和奈米級磁珠充分接觸，使生物樣品能夠被通用萃取液充分裂解，而且核酸能夠被充分地吸附於奈米級磁珠表面。所述「混合」可以透過包括但不限於機械性攪拌、物理性擾動、超音波振盪、施加渦流等手段來達成。較佳為在此一步驟中將反應予以加熱，以促進裂解和萃取的效果，例如在95^o C下加熱10分鐘以萃取出DNA，或是在85^o C下加熱10分鐘以萃取出RNA。

在本案所揭露的方法中，細胞的裂解和核酸的萃取是併合在單一步驟中進行，後續步驟則大致上相同於習用流程。簡言之，奈米級磁珠做為吸附核酸的固相擔體，透過施加一外部磁場來固著該核酸-奈米級磁珠複合物，就可以經由簡單的固-液相分離手段，由生物樣品分離出核酸-奈米級磁珠複合物。適合於進行上述固-液相分離的手段為相關技術領域中具有通常知識者所熟悉，其包括但不限於離心、移液、傾析等。在較佳的具體例中，外部磁場將核酸-奈米級磁珠複合物固著於反應容器的內部側壁，再利用移液管（pipette）移去液相。任擇地，可以使核酸-奈米級磁珠複合物接受一或數個清洗工序，以去除非專一性結合於磁珠表面的雜質。在清洗過程中，也是透過施加一外部磁場來固著核酸-奈米級磁珠複合物，再經由簡單的固-液相分離手段，由生物樣品分離出核酸-奈米級磁珠複合物。任擇地，可以使核酸-奈米級磁珠複合物接受一個乾燥工序，以減少殘液。隨後，從奈米級磁珠洗提出核酸，例如利用一低鹽度的沖提緩衝液來處理核酸-奈米級磁珠複合物，以破壞核酸和奈米級磁珠之間的專一性結合，使核酸脫離磁珠，再施加外部磁場來固著奈米級磁珠，即可在液相獲得核酸。在較佳的具體例中，外部磁場將奈米級磁珠固著於反應容器的內部側壁，使核酸留存於位在反應容器底部的液相中。

在實際施執行時，本案所揭方法僅耗時約20分鐘，即可獲得高純度的核酸。所獲得的核酸可以冷涷保存備用，也可以立即使用於後續核酸反應。本案說明書中所使用的「核酸反應」此用語意欲涵蓋所有的核酸之化學、物理和酵素反應，特別是指核酸擴增反應。此處所稱「核酸擴增反應」意指使少量核酸經歷生化反應而複製出可測得數量的核酸複本，其包括但不限於以聚合酶連鎖反應（PCR）為基礎的擴增反應，例如PCR、定量PCR（qPCR）、巢式PCR（nested PCR）、反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR）、線性擴增等；以非PCR為基礎的擴增反應，例如多重置換擴增反應（MDA）、轉錄介導式擴增反應（TMA）、核酸序列依賴式擴增反應（NASBA）、股置換式擴增反應（SDA）、即時SDA、滾圈式擴增反應（RCA）、環圈至環圈擴增反應（C2CA）等；以及彼等之組合。在生物樣品中僅含有極少量目標核酸的情形下，核酸擴增反應乃是完成檢測的必要手段。

相較於習用磁珠萃取法，本案所揭露的方法在單一步驟中同時進行細胞的裂解和核酸的萃取，因而在操作步驟上更為簡單，更有利於高通量處理樣品。據此，本發明又關於一種用於實現所揭方法的自動化執行的核酸萃取裝置。圖1是依據本發明一具體例之核酸萃取裝置的示意圖，其主要包括載台10、電子式移液管20、溫控元件30和電磁鐵元件40，較佳為這些機構件都被裝設在基座50上。

載台10設有至少一個適用於承載一反應60的槽孔。較佳為所述槽孔適於承載一反應容器，例如容積為1.0至1.5毫升的聚丙烯微量離心管（Eppendorf tube），以容許反應60在反應容器中進行。在一較佳具體例中，載台10是一個開設有96個槽孔的平板載台，所述槽孔的例示性排列方式為8行12列，供96個微量離心管以開口朝上且底部朝下的方式承載於載台10上。載台10被配置成可接受一例如步進馬達（圖未示）的驅動元件所驅動，而能夠沿著一水平方向(A)往復移動。

電子式移液管20被配置成接受另一驅動元件（圖未示）所驅動，而能夠朝向一大致上垂直於水平方向(A)的垂直方向(B)往復移動，使得電子式移液管20適於對準位於槽孔內的反應60，從而將一液體供應至反應60中，或者將一液體由反應60移出。在載台10所開設的槽孔排列成8行12列的具體例中，電子式移液管20可以被構形成能夠同時針對位於同一行的8個反應供應或移出等量液體。另外，電子式移液管20還可以經由排吸液體而對於反應60造成物理性擾動，促使反應60的內容物充分混合，以加快反應速率。

溫控元件30，設置於載台10下方，較佳為與載台10緊密接觸，適用於調控反應60的溫度。溫控元件30通常為一個能夠快速變換溫度的金屬板，且載台10是由高導熱金屬板材所製成，使得位於槽孔內的反應60迅速受熱或致冷。較佳為溫控元件30是一個可以藉由改變電壓來變換溫度的珀爾帖型（Peltier-type）溫度控制板。在較佳的具體例中，溫控元件30可以將反應60予以加熱，以促進裂解和萃取的效果，例如在95^o C下加熱10分鐘以萃取出DNA，或是在85^o C下加熱10分鐘以萃取出RNA。

電磁鐵元件40，適於可操作地朝向水平方向(A)對於反應60施加一磁場。在圖2所顯示的較佳具體例中，電磁鐵元件40和載台10併排座落在基座50上，使得電磁鐵元件40可以在導通電流時於反應容器外面產生磁場，致使反應60中的磁珠65被磁場所驅動而沿著水平方向(A)朝電磁鐵元件40運動，藉此使奈米級磁珠65暫時性地固著於反應容器的內部側壁。反之，電磁鐵元件40在未導通電流時則不會吸引奈米級磁珠65，此時奈米級磁珠65自由地懸浮於反應60中。

值得注意的是，依據本發明，電磁鐵元件40的設置方式是可以使得奈米級磁珠65固著於反應容器的內部側壁，而非固著於反應容器的底部，藉此容易地分離反應60的固-液相。因此，當奈米級磁珠65吸附核酸而形成核酸-奈米級磁珠複合物時，核酸可以伴隨著奈米級磁珠65被固著於反應容器的內部側壁，容許電子式移液管20移除液相，而不會干擾到位於固相的核酸。當核酸經過沖提而脫離奈米級磁珠65時，奈米級磁珠65可以被固著於反應容器的內部側壁，不會干擾到位於液相的核酸。憑藉此一技術特徵，本案所揭方法的完整流程可以在單一個反應容器中完成，甚至可以在同一個反應容器中接著進行後續的核酸反應。相對於習用磁珠萃取方法和裝置使用電磁棒吸取磁珠，並且於每一步驟都將磁珠置入新的反應容器中，本發明顯然有操作更加快速而且結構更為簡單的優勢。本案所揭核酸萃取裝置中各構成元件的運作可以經由程式化而成為能夠被預先寫好的軟體程式所控制。

據此，本案所揭核酸萃取裝置可以任擇地耦接至任何能夠執行核酸反應的檢驗儀器，以建構成一個直接饋入檢體即可在短時間內獲得檢驗結果的高通量自動化檢驗系統。舉例而言，本案所揭核酸萃取裝置的下游可以與一個PCR擴增儀相耦接，藉由電子式移液管20供應試劑，並且藉由溫控元件30調控PCR所需要的溫度條件，從而在無需更換反應容器之下，達成PCR擴增之目的。當然，本發明除了容許核酸直接在原位進行後續核酸反應並且進行偵測以外，也容許使用者將位於液相的核酸移出反應容器備用或者轉移至其他儀器另外進行核酸反應。

下列實例僅供用於例示本發明，而非意欲限制本發明之範圍。

實例 1 將1微升疑似含有H6N5型禽流感病毒的檢體置入一個1.0毫升的聚丙烯微量離心管中，再將微量離心管放置於本案所揭核酸萃取裝置的載台10的槽孔內。藉由電子式移液管20將40微升UniversAll^TM 組織萃取緩衝液（益生生技開發股份有限公司，台灣新北市）和20微升MagSure^TM 磁珠（益生生技開發股份有限公司，台灣新北市）同時加入微量離心管中，再以電子式移液管20排吸數次來混合反應60，並且在溫控元件30將反應60加熱至85^o C，歷時10分鐘。隨後，將電磁鐵元件40加以激磁，使得 MagSure^TM 磁珠集中固著於微量離心管的內部側壁，再以電子式移液管20吸出液相。 接著，使電磁鐵元件40不激磁，以電子式移液管20加入清洗液，並且排吸數次。再次將電磁鐵元件40加以激磁，使得 MagSure^TM 磁珠集中固著於微量離心管的內部側壁，再以電子式移液管20吸出液相。溫控元件30加熱吸咐有核酸的MagSure^TM 磁珠，使之乾燥。以電子式移液管20加入沖提液，並且排吸數次，接將電磁鐵元件40加以激磁，即可在液相獲得病毒RNA。

雖然本發明已被詳細描述於說明書中，但在本發明精義和範圍內的各種修改和變化對於本領域具有通常知識者而言屬於明顯。基於前述的揭露內容，相關技術中的知識以及在發明背景和發明的詳細敘述中所討論到的參考文獻的揭露內容完全地被納入於此作為參考。

10‧‧‧載台

20‧‧‧電子式移液管

30‧‧‧溫控元件

40‧‧‧電磁鐵元件

50‧‧‧基座

60‧‧‧反應

65‧‧‧奈米級磁珠

A‧‧‧水平方向

B‧‧‧垂直方向

圖1是依據本發明一具體例之核酸萃取裝置的示意圖； 以及

圖2為圖1所示核酸萃取裝置的局部放大示意圖。

無

Claims (5)

1. 一種核酸萃取方法，其包含下列步驟： A.將一兼具裂解和萃取功能的通用萃取液和奈米級磁珠同時與一含有核酸的生物樣品相混合，使得該核酸被該奈米級磁珠所吸附，形成核酸-奈米級磁珠複合物； B.施加一外部磁場來固著該核酸-奈米級磁珠複合物，藉此由該生物樣品分離出該核酸-奈米級磁珠複合物；以及 C.從該奈米級磁珠洗提出該核酸。
2. 如請求項1之核酸萃取方法，其中該兼具裂解和萃取功能的通用萃取液是UniversAll^TM 組織萃取緩衝液。
3. 如請求項1之核酸萃取方法，其中該奈米級磁珠是MagSure^TM 磁珠。
4. 一種核酸萃取裝置，其包含： 一載台，設有至少一個適用於承載一反應的槽孔，其被配置成能夠沿著一水平方向往復移動； 一電子式移液管，其被配置成能夠朝向一大致上垂直於該水平方向的垂直方向往復移動，並且適於將一液體供應至被承載於該至少一個槽孔的反應中，或者將一液體由該反應移出； 一溫控元件，設置於該載台下方，適用於調控該反應的溫度；以及 一電磁鐵元件，適於可操作地朝向該水平方向對於該反應施加一磁場。
5. 如請求項4之核酸萃取裝置，其中該反應是位在一反應容器中，以及其中該電磁鐵元件和該載台是併排設置，使得該電磁鐵元件適於使得加入該反應的奈米級磁珠被驅動沿著該水平方向朝該電磁鐵元件運動，藉此使該奈米級磁珠固著於該反應容器的內部側壁。