JP2008167722A - 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】サンプルに含まれる細胞を磁性支持体に結合させ、次いで該磁性支持体をそのサンプル液から固液分離し、該磁性支持体に結合した細胞の細胞膜を80〜120℃で20〜300秒間、加熱して破壊し、これにより遊離した核酸を回収する工程を含む、細胞含有サンプルからの核酸単離方法である。本方法を実施するための核酸単離キット、そのキットに含まれる核酸単離用の器具および装置も提案する。
【選択図】図2
Description
AN(Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Nucleic acids)
、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、TMA(Transcription-Mediated Amplification)、QβReplicase Amplification、TAS(Transcription Amplification System)、3SR(Self-Sustained Sequence Replication System)、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)などのDNA増幅法の鋳型として使用
するか、あるいは制限酵素で消化する場合、核酸溶液に残存するそうした薬剤が障害となり、それらの除去処理は煩雑を極める。特に微量のサンプルにあってはそうした抽出方法では対応できない。
胞を接触させるステップと、該作用物質から該細胞を遠心分離により分離するステップとを含む方法である。
細胞含有サンプルから核酸を単離する方法であって、
着脱可能なカバーを付けた磁石と、
1つのテーブルに配置された以下の容器;
(1)細胞含有サンプルと、細胞を付着させ得る磁気ビーズとを混合するための容器1、(2)細胞が付着した磁気ビーズを洗浄するための洗浄槽、および
(3)洗浄後の磁気ビーズを加熱処理するための容器2、
を用いることにより、細胞含有サンプル中の細胞の磁気ビーズへの付着、洗浄、細胞からの核酸の単離までのプロセスが、
細胞含有サンプルの液と磁気ビーズとを容器1内で混合する工程、
容器1から該磁気ビーズを取り出して洗浄する工程、
次いで該磁気ビーズを容器2内で再懸濁バッファー中に懸濁させ、該容器2を80〜120
℃で20〜300秒間、加熱する工程、
を含み、プロセス全体が600秒以内で完了することを特徴としている。
前記のいずれかに記載の単離方法により得られた核酸を、核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法は本発明に含まれる。
磁気ビーズを移す際に、着脱可能なカバーを付けた磁石を出し入れすることにより該磁気ビーズを操作するため、固液分離操作が簡便であり、しかも核酸の分離過程における試料のロスが少ない。
本発明の方法は、細胞含有サンプルから核酸を単離する方法であって、
着脱可能なカバーを付けた磁石と、
1つのテーブルに配置された以下の容器;
(1)細胞含有サンプルと、細胞を付着させ得る磁気ビーズとを混合するための容器1、(2)細胞が付着した磁気ビーズを洗浄するための洗浄槽、および
(3)洗浄後の磁気ビーズを加熱処理するための容器2、
を用いることにより、細胞含有サンプル中の細胞の磁気ビーズへの付着、洗浄、細胞からの核酸の単離までのプロセスが、
細胞含有サンプルの液と磁気ビーズとを容器1内で混合する工程、
容器1から該磁気ビーズを取り出して洗浄する工程、
次いで該磁気ビーズを容器2内で再懸濁バッファー中に懸濁させ、該容器2を80〜120
℃で20〜300秒間、加熱する工程、
を含み、プロセス全体が600秒以内で完了することを特徴としている。
もある)させ、該細胞をサンプル液、不純物から分離した後、磁性支持体に結合させた状態で、加熱によりその細胞膜を破壊して核酸を細胞外に放出させ、これを回収するものである。その操作手順について、図1にその骨子を示している。
次いで、該磁性支持体を洗浄バッファーとともに撹拌し、洗浄する操作、引続いて再び固液分離操作をすることにより、磁性支持体に付着する不純物をさらに除去する。このように本発明の方法において固液分離の過程が含まれるが、その固液分離は、磁気または遠心分力の作用により行われる。好ましくは、その磁性支持体を含む容器に外部磁石による磁気を作用させることにより、固液分離が実施される。より好ましい態様は、磁気ビーズの移動に際して、着脱可能なカバーを付けた磁石を出し入れすることにより磁気ビーズを操作するものであり、この点に本方法の特徴がある。
次いで上記手段によって固液分離することにより、磁性支持体と、細胞から遊離した核酸を含んでいる再懸濁バッファーとを分離し、そのバッファーを回収し、バッファーから所望する核酸を単離することができる。この方法ではろ過、減圧処置といった操作を含まないために、簡便かつ迅速に核酸を単離することができる。また、前記磁気ビーズをサンプル液と混合する前、混合した後、磁気ビーズの洗浄時のうち、少なくともいずれかの段階において懸濁させることを特徴としている。このように懸濁させる意義は、次のとおりである。混合する前においては、磁気ビーズは、保存中に磁気ビーズ同士の磁力作用で凝集してしまう。そこで懸濁によって磁気ビーズを分散させると、サンプル液と混合する際に磁気ビーズと細胞との接触表面積、接触回数が増大する。サンプルと混合した後にも懸濁状態を保つと、懸濁によってサンプル液中で磁気ビーズが分散し、磁気ビーズと細胞との接触表面積、接触回数が増える。また洗浄時にあっては、懸濁によって洗浄バッファー中で磁気ビーズが分散し、洗浄バッファーの洗浄有効物質と磁気ビーズ(その表面に細胞が付着している)との接触表面積、接触回数が増える。これらの効果によって、それぞれの段階でサンプル液から細胞、核酸を分離し、回収できる量と純度の向上が期待される。
本発明が対象とする細胞は、微生物(細菌、カビ、酵母など)、植物、動物の細胞または細胞培養物のいずれであってもよく、特に限定されない。好ましくは、微生物の細胞であり、特にクラミジア菌(Chlamydia属)、淋菌(Neisseria属)、マイコバクテリア(Mycobacterium属)に属する微生物が望ましい。
料であり、通常は溶液もしくは懸濁液の液体である。サンプルは溶解できる固体であるか、または液体の中に浮遊している固体であってもよい。
担う核酸、すなわちDNAまたはRNAをいうが、単に化学的実体であるDNA、RNAの形でいうこともある。また「塩基」とは、ヌクレオチドの核酸塩基のことを言う。
・磁性支持体
本発明において、目的とする細胞を付着させるために使用される磁性支持体は、水不溶性の担体である。水不溶性の磁性支持体を形成する材料は、水に不溶であればよい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、他のいかなる水可溶性組成を含む水溶液に溶解しない固相を意味する。固体支持体は、固定、分離等用に現在広く使用され、提案されている公知の支持体またはマトリックスのいずれであってもよい。
大きいために一般に好ましく、特にポリマーのビーズが好ましい。
ノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、N-ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応
性に富む官能基、あるいは標的の細胞に特異的に親和性を示す糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」などを結合させるか、その表面構造の改変、結合を促進する適当なコーティングなどを施してもよい。
キット
本発明にかかるキットは、上記の核酸単離方法を実施するためのキットである。すなわち該キットは、本発明の方法を実施するために必要とされる器材一式、具体的には、各種の試薬、磁性支持体(ビーズ)、核酸単離器具を含むものである。これらの試薬の中には、サンプルを溶解(または希釈)するための溶解(または希釈)液、洗浄液、各種緩衝液なども含まれる。本発明の方法を実施するための磁気ビーズ、結合バッファー、洗浄バッファー(洗浄液)、再懸濁バッファー(再懸濁液)がそれぞれ容器にあらかじめ封入されている態様のキットが望ましい。必要な器材一式の中には、さらに細胞を磁性支持体に付着もしくは結合させ、その細胞膜を破壊して内部に含まれる核酸を抽出する専用の器具(すなわち核酸単離器具)が、キット要素として含まれる。これらの核酸単離器具を用いて、上記の本発明の核酸単離方法を実施することができる。
ファーを4〜5倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類のバッファーを別途に用意してもよい。再懸濁バッファーとしては、水が好適である。上記のように、本キットには、従来技術において核酸抽出に用いられてきたクロロホルム、フェノールなどの有機溶媒、カオトロープ試薬、界面活性剤、溶菌剤などは含まれない。
・核酸単離器具
細胞含有サンプルから核酸を単離する本発明方法においては、
着脱可能なカバーを付けた磁石と、
1つのテーブルに配置された以下の容器;
(1)細胞含有サンプルと、細胞を付着させ得る磁気ビーズとを混合するための容器1、(2)細胞が付着した磁気ビーズを洗浄するための洗浄槽、および
(3)洗浄後の磁気ビーズを加熱処理するための容器2、
を用いることにより、細胞含有サンプル中の細胞の磁気ビーズへの付着、洗浄、細胞からの核酸の単離までのプロセスが行なわれる。
のところに段部(φ11.5および11.7に対応)を設け、磁石および磁石カバーを挿入する際のその位置決めとしている。その際、容器2の丸底中央にある核酸を抽出する再懸濁バッファー(図3の容器2の場合、50μL)は、壁面付近に都合よく移動するために熱伝導率
が高くなる。
上記の容器1、容器2および洗浄槽は、一つのテーブル、好ましくは1つの長方形もしくは円形のテーブルに処理される順序に配置されていることが望ましい。
挙げられる。
カバー内面壁に僅かな段部を設けてある。さらにカバーの外面壁にも、位置決めと固定する際に好都合となるように僅かな段部を設けることが好ましい。図3の容器1、容器2、図4の磁石カバーは、磁石を直径8mmの円柱形、サンプル液の量を1mL、洗浄バッファーの量を1mL、再懸濁バッファーの量を50μLとして設計したものである。各液の量にしたがって、すなわち容器1と磁石カバーとの容積差がサンプル液および洗浄バッファーの量と同程度、容器2と磁石カバーとの容積差が再懸濁バッファーの量と同じ程度になるように容器1、容器2、磁石カバーを設計している。容器1に100μL〜2mLのサンプル液または洗浄バッファーを入れた状態で、磁石カバーを容器1に挿入することが可能である。同様に容器2に50〜100μLの再懸濁バッファーを入れた状態で、磁石カバーを容器2に挿入することが可能である。
これらの器具一式と上記試薬類を一つのセットとして、本発明の核酸単離方法専用のキットを構成する。いずれの用具も通常は1回分析用の消耗品として構成される。バッファーなどを含む容器は予め滅菌処理され、雑菌の汚染を防止することが望ましい。
サンプル液の量は、100μL〜5mL、洗浄バッファーの量はサンプル液の量と同程度で250μL〜1mL程度、再懸濁バッファーの量は5〜100μLが好ましい。
該磁気ビーズを容器2内で再懸濁バッファー中に懸濁させ、該容器2を80〜120℃で20
〜300秒間、加熱する
ことによって核酸を分離する。
(1) 細胞含有サンプル(例えば尿)をサンプル容器(上記の容器1)に適当な量入れ、
予め容器に入れられている磁気ビーズと、ミキサーを使用して撹拌しながら混合する。サンプル中の細胞(例えば細菌)が磁気ビーズに付着する。
(2) カバー付き磁石を上記サンプル容器に挿入し、容器内のサンプル液に浸して磁気ビ
ーズをこの磁石の作用により当該カバーの外周表面上に集積させる。これにより磁気ビーズがそのカバーに付着し、該サンプルから固液分離が可能となる。
(3) 磁気ビーズが付着したカバー付き磁石をサンプル容器から抜いて、それを洗浄槽(
すなわち洗浄バッファー入り容器)に移す。
(4) カバーから磁石を外して洗浄槽から引き上げる。該カバーに付いていた磁気ビーズ
はカバーから離れ、洗浄バッファーに再分散させ、該カバーを上下動させるなどして磁気ビーズを洗浄する。
(5) 洗浄槽内にある磁石カバーに再び磁石を挿入し、磁気ビーズを再び磁石カバーの外
表面上に集積させる。
2)に移す。
(4)と同様にして、カバーを外して磁石を核酸回収容器から引き上げ、磁気ビーズを再
懸濁バッファー中に再分散させる。この懸濁液を加熱して磁気ビーズに付着した細胞の細胞膜を破壊する(または溶菌する)。
(6) 核酸回収容器内の磁石カバーに磁石を挿入し、磁気ビーズを集積させる。
カバー付き磁石を抜いて、磁石カバーと磁気ビーズを破棄する。
(7) バッファーを回収し、核酸を入手する。図2の(7)には、核酸を含む液を吸引して回収するためのキャピラリー様の管が容器内に挿入されている。
核酸単離装置
上記器具を使用する核酸単離装置における操作が、図5に模式的に表されている。図5(a)における水平移動装置では、磁石および磁石カバーが水平方向に移動して所定の容
器内に出入りするように昇降すると、サンプル内の細胞の処理が順次行われる。磁石および磁石カバーが移動する水平方向には、一つのテーブル(好ましくは長方形テーブル)上に
(1)細胞含有サンプルと、細胞を付着させ得る磁気ビーズとを混合するための容器1、(2)細胞が付着した磁気ビーズを洗浄するための洗浄槽、および
(3)洗浄後の磁気ビーズを加熱処理するための容器2、
が処理される順序に配置されている。
には示されていない。また、磁石および磁石カバーを同時に移動させ、あるいは必要に応じて磁石のみを移動させる機構を含めてもよい。特に細胞の加熱時には、少なくとも磁石は、熱による磁気損失を回避するために、細胞を保持する容器から抜いておく必要がある。
である。真中の回転軸の回転により、これに接続された磁石および磁石カバーも周回して所定の容器内に出入りするように昇降する。磁石および磁石カバーが移動する回転方向には、一つのテーブル(好ましくは円形テーブル)上に上記の容器1、洗浄槽および容器2が処理される順序に配置されている。
本発明の方法を実施するための核酸単離装置は、容器などの核酸単離器具、磁石およびその磁石カバーを水平および上下の方向に移動させる駆動部、それらの移動を制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置などから構成され、必要であればそれらが一体化された装置である。好ましい態様の一例として、予め磁気ビーズおよび結合バッファーが封入されたサンプル容器(容器1)に、細胞含有サンプル液が注入されると、磁石およびその磁石カバーを移動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされて、本装置は作動状態となる。引き続きサンプルおよびバッファー類の混合撹拌、加熱処理、遊離した核酸の分離などの工程が、一連の連続的工程として自動的に実施される。そうした核酸単離装置では、各工程の実施順序、タイミングなどについて予め設定された条件が、磁石およびその磁石カバーの移動機構および温度の制御とともにプログラムとして核酸単離装置に搭載されたソフトウェアに組みこまれ、各工程が円滑に進み、目的とするサンプル処理が実行されるようにコンピュータによる制御がなされることが望ましい。
遺伝子検査方法
本発明の遺伝子検査方法は、上記の方法によって核酸を単離し、マイクロチップを有する装置で核酸(遺伝子)を増幅し、検出する段階を含む方法である。
・核酸分析装置
本発明の遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置は、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置などが一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な核酸増幅検出用マイクロチップとからなる。予め試薬が封入されたマイクロチップの検体受容部に検体液を注入して、そのマイクロチップを核酸分析装置の本体に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされる。本体とこのマイクロチップとを接合させると、マイクロチップの流路も作動状態となる。したがって好ましい態様の一例では、操作が開始されると検体および試薬類の送液、混合、核酸の増幅、検出などが、一連の連続的工程として自動的に実施される。
・核酸増幅検出用のマイクロチップ、マイクロポンプおよびポンプ接続部
核酸増幅検出用マイクロチップの好ましい態様の一例として、図7に掲げる実施形態を説明する。検体受容部20、試薬収容部18について、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、ポンプ接続部12を介して試薬収容部18の上流側に接続され、マイクロポンプにより駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニットは、核酸増幅検出用マイクロチップとは別途の核酸分析装置本体に組み込まれており、マイクロチップを核酸分析装置本体に装着することによって、ポンプ接続部12からマイクロチップに接続されるようになっている。
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと
を備えたピエゾポンプである。その詳細は、特開2001-322099号公報、特開2004-108285号公報に記載されている。
御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。
・核酸の増幅および検出
単離された核酸は、核酸増幅検出用マイクロチップの核酸増幅部位で増幅され、次いで増幅された核酸が該マイクロチップの検出部位に送られて核酸(遺伝子)の検出が行われる。核酸の増幅は、PCR、SDA、LCR、ICAN、LAMP、TMA、TAS、3SR、NASBAなどのDNA増幅法により増幅する。増幅された核酸の分析を常法、例えばハイブリダイゼーション法、金コロイド吸着法などにより行なう。
[実施例]
以下の実施例中で用いる装置名及び、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、処理方法等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
図3に示すサンプル容器に入れた。そのサンプル容器には、予めGenpoint AS社BUGS'n BEADS Version Uの磁気ビーズ(chlamCAP Beads)10mg/mL分散液30μLと、結合バッファー(Binding buffer) 200μLとを入れておいた。該サンプル容器に磁石カバーを挿入し、該カバーを横回転して撹拌し、サンプル液を混合した。サンプル容器内にあるカバーに磁石を挿入し、サンプル容器内のサンプル液に浸して磁気ビーズを磁石の作用により該カバーの外周表面上に集積させた。磁気ビーズが付着したカバー付き磁石をサンプル容器から抜いて、洗浄バッファー入り容器に移した。カバーから磁石を外してその磁石を洗浄槽から引き上げ、磁気ビーズを洗浄バッファーに再分散させ、カバーを横回転して磁気ビーズを洗浄した。洗浄槽内にあるカバーに磁石を挿入し、磁気ビーズをカバーの外周表面上に集積させた。カバー付き磁石を洗浄槽から抜いて、再懸濁バッファー(水50μL)入り核酸回
収容器に移した。カバーから磁石を外してその磁石を核酸回収容器から引き上げ、磁気ビーズを再懸濁バッファーに再分散させた。核酸回収容器を100℃で3〜5分間加熱した。核
酸回収容器内のカバーに再び磁石を挿入して、磁気ビーズをカバーの外周表面上に集積させ、カバー付き磁石を抜いて磁石カバーと磁気ビーズを破棄した。核酸回収容器の上清をタカラバイオ社LA Taqを用いて95℃ 5分(95℃ 30秒、60℃ 50秒、72℃ 35秒)40サイク
ル、72℃ 5分の条件で、PCR増幅反応を行った。PCRのプライマーは、GenBank accession
number X06707記載の塩基配列をもとに作製して使用した。その塩基配列は、配列表の
配列番号1および2に示すとおりである。
ン磁気ビーズ(BioMag Streptavidin Particles)5mg/mL分散液30μL、結合バッファー(イソプロパノール、0.75M酢酸アンモニウムNH4Ac)200μLを撹拌して混ぜた。常温で1〜5分間のインキュベーションを行った後、2000G、1分間の遠心または磁石により磁気ビーズを分離して上清を廃液した。4.5倍希釈結合バッファー(すなわち結合バッファーを滅菌
水で4.5倍希釈した溶液)250μLを洗浄バッファーとして添加、撹拌して洗浄した。2000G、1分間の遠心または磁石により磁気ビーズを分離して上清を廃液した。滅菌水100μLを
添加し、94℃で1分間、加熱した。上清を58℃、60分の条件で、ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification、登録商標)増幅反応、固層プレート
発光法による検出を行った。ICANのキメラオリゴヌクレオチドプライマー、発光検出のプローブは、再公表特許「再表02/052043(WO2002/052043)」実施例6に従って作製した。以上のプロトコルによって、陽性反応を確認した。
の磁気ビーズ(chlamCAP Beads)10mg/mL分散液30μL、結合バッファー(Binding buffer)
200μLを撹拌して混ぜた。以後は増幅および検出まで、実施例2と同様に行った。すな
わち常温でのインキュベーション、遠心または磁石による分離、上清廃液、4.5倍希釈結
合バッファーによる撹拌洗浄、遠心または磁石による分離、上清廃液、滅菌水の添加、加熱、ICAN、検出を順に行い、陽性反応を確認した。
幅ターゲット部分と同一の塩基配列を持つコントロールプラスミド25コピーを添加し、サンプルとして使用した。実施例3と同じプロトコルでサンプル処理、増幅および検出を行い、陽性反応を確認した。
6 LED
Claims (8)
- 細胞含有サンプルから核酸を単離する方法であって、
着脱可能なカバーを付けた磁石と、
1つのテーブルに配置された以下の容器;
(1)細胞含有サンプルと、細胞を付着させ得る磁気ビーズとを混合するための容器1、(2)細胞が付着した磁気ビーズを洗浄するための洗浄槽、および
(3)洗浄後の磁気ビーズを加熱処理するための容器2、
を用いることにより、細胞含有サンプル中の細胞の磁気ビーズへの付着、洗浄、細胞からの核酸の単離までのプロセスが、
細胞含有サンプルの液と磁気ビーズとを容器1内で混合する工程、
容器1から該磁気ビーズを取り出して洗浄する工程、
次いで該磁気ビーズを容器2内で再懸濁バッファー中に懸濁させ、該容器2を80〜120
℃で20〜300秒間、加熱する工程、
を含み、プロセス全体が600秒以内で完了することを特徴とする、細胞含有サンプルから
の核酸単離方法。 - 前記磁気ビーズをサンプル液と混合する前、混合した後、磁気ビーズの洗浄時のうち、少なくともいずれかの段階において懸濁させることを特徴とする請求項1に記載の核酸単離方法。
- 前記細胞がクラミジア菌(Chlamydia属)、淋菌(Neisseria属)、マイコバクテリア(Mycobacterium属)に属する微生物である、請求項1または2に記載の核酸単離方法。
- 前記の容器および洗浄槽が長方形または円形のテーブルに処理される順序に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載の核酸単離方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の単離方法により得られた核酸を核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
- 請求項1〜5のいずれかの方法を実施するための磁気ビーズ、洗浄バッファー、再懸濁バッファーがそれぞれ容器にあらかじめ封入されていることを特徴とするキット。
- 請求項1〜5のいずれかの方法を実施するための核酸単離装置。
- 請求項1〜4のいずれかの方法により、遺伝子を単離し、マイクロチップを有する装置で核酸を増幅し、検出する段階を含む遺伝子検査方法。
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