JP2006129869A - 核酸精製装置及び核酸精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料導入口が形成されており、試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部、及び前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部を備える細胞またはウイルスの核酸精製装置、並びに前記核酸精製装置を用いる核酸精製方法である。
【選択図】図1
Description
図1に示すように、下記のように調製されたB型肝炎ウイルス(HBV)(60μl)、血清(30μl)、及びマイクロ磁性ビーズ(30μl、Dynabeads(登録商標)M−270カルボン酸、ノルウェー、DYNAL社製)を毛細管内で混合した。毛細管をボルテキシングにより攪拌しながら、各実験で指定された時間内に細胞を破壊するために808nm、21.1W(HLU25F100−808、ドイツ、LIMO社製)の高出力レーザービームを照射した(図1参照)。
細胞から放出されたDNAは、下記の対のPCRプライマーを使用して検出された:プライマーTMP5−F(配列番号1)、及びプライマーTMP5−R(配列番号2)。このプライマー対は、HBVゲノムの2,269〜2,387ヌクレオチドに該当する部位であった。PCR増幅を、Taq重合酵素(韓国、Takara社製)を用いて40サイクル(50℃で10分、95℃で1分間予備変性、95℃で5秒間変性、62℃で15秒間アニーリング及び伸長)行った。増幅されたDNAを、市販のDNA500アッセイサイジングの試薬セットを用いて、Agilent BioAnalyzer 2100(カリフォルニア州パロアルト、Agilent Technologies社製)で分析した。
容器の形態による磁性ビーズ層及びDNAを含む溶液層の層分離の程度を調べるために、多様な種類の容器を用いて層分離の程度を観察した。図2は、内径が9.95mmであり、レーザー照射後の磁性ビーズ層及びDNA溶液層が混合されている容器の写真である。図2に示すように、容器の内径が9.95mmである場合には、変性された蛋白質及び細胞の残骸などのPCR阻害剤が付着した磁性ビーズがガラス壁に付着せず、DNAを含む溶液に混合されて、磁性ビーズ層及びDNAを含む溶液層が分離されないということが分かる。
磁性ビーズにPCR阻害剤が結合されるか否かを確認するために、走査電子顕微鏡(SEM)観察を実施した。図4は、Pure Dynabeads(登録商標)M−270カルボン酸のSEM写真である。Pure Dynabeads(登録商標)M−270カルボン酸は、直径が2.8±0.2μmであり、溶液内のビーズの濃度は6×107ビーズ/30μlであった。図4に示すように、純粋な磁性ビーズは、何も付着していなかった。また、DNAは負電荷を帯びているので、磁性ビーズに付着していなかった。図5は、レーザー処理による細胞溶解後、ガラス壁に付着したDynabeads(登録商標)M−270カルボン酸のSEM写真である。図5から明らかなように、多くの粒子が磁性ビーズに付着していた。前記粒子は、主に変性された蛋白質及び細胞の残骸であり、それらは、PCRを妨害する主要なPCR阻害剤であった。図6は、レーザー処理による細胞溶解後、ガラス容器の中央部から採取したDynabeads(登録商標)M−270カルボン酸のSEM写真である。図6から明らかなように、多くの粒子が磁性ビーズに付着していた。このことから、PCR阻害剤として作用する変性された蛋白質及び細胞の残骸は、磁性ビーズを用いて容易に除去できる。
DNA精製方法を変えたときのPCR増幅効果を研究するために、Lightcycler毛細管(内径:2.42mm、高さ:35.40mm、内径:高さ=1:14.63)内で細胞を溶解させ、得られた溶解液を用いてPCRを行った。図7は、DNA精製方法を変えたときのPCR産物の、電気泳動の結果を示す図である。矢印で表示されたバンドは、所望のPCR産物に該当する。レーン1、2は、磁性ビーズの不在下でレーザーをそれぞれ60秒、及び90秒照射した後PCRを行った結果であり、レーン3、4は、磁性ビーズの存在下でレーザーをそれぞれ5秒、及び10秒照射した後PCRを行った結果であり、レーン5は、組み替えHBV(rHBV)の直接PCRの結果であり、レーン6は、PCR陽性コントロールであって、Qiagen Ultrasenseキットを用いてDNAを精製した後でPCRを行った結果であり、レーン7は、PCR陰性コントロールであって、蒸留水のみを用いてPCRを行った結果である。各試料の組成は、下記の表の通りであった。
細胞溶解後、磁性ビーズにより吸収された蛋白質の量がどれほどかを研究するために、レーザー照射時間を変えたときの細胞溶解物中に存在する蛋白質の量を調べた。細胞溶解後に溶解物中に存在する蛋白質の量は、CBQCA蛋白質定量キット(C−6667、Molecular Probes社製、調製マニュアルを参考にした)を用いて測定した。図9は、レーザー照射時間を変えたときの細胞溶解物中に存在する蛋白質の量を示すグラフである。図9に示すように、レーザー照射時間が10秒、及び15秒であるとき、溶解物中の蛋白質の量が顕著に減少した。レーザー照射時間が10秒であるとき、溶解物中の蛋白質量の顕著な減少は、PCR増幅が十分に行われるということを示しており、これは、前記図7及び図8の結果とも一致する。
Claims (22)
- 試料導入口が形成されており、前記試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、
を備えることを特徴とする、細胞またはウイルスの核酸精製装置。 - 前記振動器は、超音波振動器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、機械式振動器、及び圧電物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1に記載の装置。
- 前記磁気力発生部が、レーザーの通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることを特徴とする、請求項1に記載の装置。
- 前記細胞溶解毛細管と、弁により開閉される流路を通じて連結されているDNA増幅チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項1に記載の装置。
- 細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、
前記磁性ビーズを振動させるステップと、
前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、
前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、
前記磁性ビーズが除去された溶液を得るステップと、
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸精製装置を用いて核酸を精製する方法。 - 細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、
前記磁性ビーズを振動させるステップと、
前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、
前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、
前記磁性ビーズが除去された溶液を得た後、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通じて増幅チャンバに移送して増幅を行うステップと、
を含むことを特徴とする、請求項4に記載の核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法。 - 前記レーザーが、パルスレーザーまたは連続波動レーザーを含むことを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記パルスレーザーが1mJ/パルス以上の出力を有するか、または連続波動レーザーが10mW以上の出力を有することを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記パルスレーザーが10mJ/パルス以上の出力を有するか、または連続波動レーザーが100mW以上の出力を有することを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記レーザーが、400nm以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記レーザーが、750nm〜1300nmの波長帯で発生することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記レーザーが、一つ以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記磁性ビーズの大きさは、50nm〜1,000μmであることを特徴とする請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記磁性ビーズの大きさは、1μm〜50μmであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記磁性ビーズは、二つ以上の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記毛細管状の容器は、直径と長さとの比率が1:2〜1:50(直径:長さ)であることを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記毛細管状の容器は、直径が1nm〜5mmであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記毛細管状の容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されることを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属であるFe、Ni、Cr、及びそれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含むことを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属でコーティングされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記磁性ビーズの表面は、負電荷を帯びていることを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記溶解液は、唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されることを特徴とする、請求項5または請求項6に記載の方法。
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