IT201900008334A1

IT201900008334A1 - Dispositivo automatizzato per l'estrazione, purificazione e concentrazione degli acidi nucleici finalizzato a migliorare la sensibilità e la automazione della rilevazione di cellule nei campioni biologici

Info

Publication number: IT201900008334A1
Application number: IT102019000008334A
Authority: IT
Inventors: Enrico Turrini; Francesco Michelangelo Turrini; Franca Rita Mannu
Original assignee: Nurex Srl
Priority date: 2019-06-07
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2020-12-07

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo:

Titolo:

Dispositivo automatizzato per l’estrazione, purificazione e concentrazione degli acidi nucleici finalizzato a migliorare la sensibilità e la automazione della rilevazione di cellule nei campioni biologici

RIASSUNTO

Un dispositivo per l’estrazione, purificazione e concentrazione automatizzata per migliorare la sensibilità e l’accuratezza nell’identificare quantità limitanti di cellule contenute in campioni biologici. L’ apparato include una camera di estrazione costituita da: a) un compartimento superiore per contenere il campione, le particelle magnetiche, i reagenti necessari per l’estrazione degli acidi nucleici ed ottenere una rimozione efficiente degli inibitori della PCR; b) un compartimento capillare, situato nella parte inferiore della camera di estrazione, adeguato a controllare la movimentazione ed il posizionamento di particelle magnetiche immerse in ridotti volume di liquido, per consentire la concentrazione degli acidi nucleici ed il loro trasferimento ad una strumentazione analitica. Per parallelizzare il processo e facilitarne l’automazione, la geometria della camera di estrazione è stata replicata in un modello ortogonale per formare una cartuccia che contiene un numero variabile di camere. Il modulo di camere di estrazione è stato accoppiato geometricamente ad un dispositivo costituito da una superficie orizzontale contenente elementi che generano campi magnetici, elementi vibranti, elementi a temperatura controllata e un sistema fluidico per trasferire reagenti e liquidi all’ interno della camera di estrazione. Il dispositivo è stato sperimentato su una amplia gamma di cellule microbiche e di cellule umane contenute in una pluralità di campioni biologici dimostrando un'elevata resa di estrazione degli acidi nucleici e un'eliminazione efficiente degli inibitori indipendentemente dal tipo di cellula e dalla matrice biologica.

STATO DELL’ ARTE

[0001 ] Settore tecnico: La presente invenzione si riferisce all'estrazione e alla purificazione automatica degli acidi nucleici in relazione alla elevata sensibilità e accuratezza richieste per la misura di un numero molto limitato di cellule, inclusi i microrganismi, contenute in campioni biologici.

[0002 ] Per rilevare e caratterizzare geneticamente pochissime cellule come le cellule tumorali e gli agenti patogeni nei fluidi corporei sono necessarie tecnologie estremamente sensibili. Questo tipo di misure sono generalmente applicate a test diagnostici in cui è richiesto un elevato grado di affidabilità. Alcune tecniche di diagnostica molecolare come la PCR e le sue varianti sono estremamente sensibili avvicinandosi alla loro massima sensibilità teorica pari a una singola cellula. Nella pratica, la misura di pochissime cellule contenute in matrici complesse come sangue intero, essudati o campioni respiratori viscosi rappresenta ancora una importante limitazione alla diagnosi rapida di neoplasie metastatiche, per geno-tipizzare cellule tumorali circolanti allo scopo di indirizzare efficaci terapie personalizzate (biopsia liquida) e per la rapida identificazione degli agenti eziologici di patologie infettive gravi come la sepsi e delle farmaco resistenze associate. Metodiche ultrasensibili per rilevare quantità di DNA in traccia presenti in matrici complesse sono, inoltre, di grande interesse nel campo della medicina legale. Attualmente, le soluzioni automatizzate ed ultrasensibili per le suddette applicazioni diagnostiche sono molto scarse.

[0003 ] Pertanto, la disponibilità di dispositivi ultrasensibili, robusti, automatizzati ed economicamente sostenibili in grado di estrarre acidi nucleici da una pluralità di cellule contenute in diverse matrici biologiche sarebbe molto utile per facilitare l’esecuzione delle sopramenzionate applicazioni diagnostiche.

[0004 ] Deve essere notato che i metodi di rilevazione e caratterizzazione degli acidi nucleici (sequenziamento, ibridizzazione, NMR, spettrometria di massa, qPCR, etc.) necessitano di una loro amplificazione enzimatica rendendole, quindi, vulnerabili agli inibitori della PCR frequentemente contenuti nelle matrici biologiche.

[0005 ] La sensibilità e l'accuratezza delle tecniche di diagnostica molecolare sono primariamente influenzate dai seguenti fattori: i) diversi campioni biologici presentano caratteristiche chimico-fisiche variabili che possono interferire con le tecniche di estrazione e purificazione degli acidi nucleici e / o contenere livelli variabili di inibitori della PCR, ii) la variabilità può essere, inoltre, influenzata da differenze individuali e/o malattie concomitanti che possono alterare le caratteristiche chimico-fisiche del campione, quali: fibrosi cistica e malattie infettive che possono aumentarne viscosità e / o il numero di leucociti, etc. iii) alcuni microrganismi sono caratterizzati da pareti cellulari molto resistenti di composizione variabile che richiedono tecniche di estrazione specifiche e complesse.

[0006 ] Considerando i punti di cui sopra, per raggiungere la sensibilità richiesta per rilevare, in maniera riproducibile, un numero limitato i cellule nei campioni biologici, una tecnica per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici dovrebbe soddisfare tutti i seguenti requisiti: i) la resa di estrazione, purificazione dovrebbe avvicinarsi al 100%, ii) la rimozione degli inibitori della PCR contenuti nei campioni biologici dovrebbe essere estremamente efficiente, iii) Per incrementare la sensibilità, gli acidi nucleici purificati dovrebbero essere concentrati.

[0007 ] Un processo in grado di soddisfare tutti i requisiti di cui sopra è necessariamente complesso richiedendo numerosi passaggi necessari per: i) la lisi di membrane cellulari e/o delle pareti cellulari di diversa composizione; ii) la purificazione degli acidi nucleici in presenza di sostanze che possono legarli o degradarli; iii) consentire l’utilizzo di volumi di soluzioni appropriati ad allontanare gli inibitori della PCR; iv) concentrare gli acidi nucleici purificati in un piccolo volume di liquido e consentire il suo completo trasferimento ad un sistema analitico. Un tale processo, per essere riproducibile e rapido richiede soluzioni innovative ed un elevato grado di automazione.

[0008 ] Per soddisfare le esigenze di produttività richieste dalle applicazioni diagnostiche, il dispositivo dovrebbe essere stato progettato per rendere possibile l’automazione, la parallelizzazione e la scalabilità del processo a costi sostenibili.

[0009 ] Elevati livelli di automazione sono anche necessari perché le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici sono estremamente sensibili alle contaminazioni biologiche (microrganismi, cellule umane, etc.), in grado di generare risultati falsi positivi (8).

[0010 ] Manipolazioni preliminari del campione, condotte per incrementare la sensibilità del metodo come: tecniche di arricchimento delle cellule di interesse, tecniche di lisi cellulare selettive, eliminazione degli inibitori mediante filtrazione, separazione in fase solida, separazioni mediante anticorpi o tecniche di centrifugazione in gradienti di densità dovrebbero essere evitati in quanto richiedono tempo, aumentano il rischio di contaminazione accidentale del campione richiedendo personale altamente specializzato e/o soluzioni robotiche complesse e costose.

[0011 ] Allo scopo di evitare la manipolazione del campione, ridurre il rischio di contaminazioni ed automatizzare il processo, i seguenti brevetti: US8722,329B2, US2005 / 0142663A1, US2008 / 0318279A1, US2009 / 0061450A1, US2017 / 0144157A1 e US2016 / 0090588A1, descrivono cartucce micro-fluidiche per l'estrazione degli acidi nucleici, tali dispositivi offrono inoltre il vantaggio di accelerare ed automatizzare l'intero processo. Le cartucce micro-fluidiche monouso sono generalmente formate da più camere comunicanti e usualmente contengono un sistema di misura integrato incrementando il costo della singola analisi. La miniaturizzazione del processo consente di ottenere una elevata sensibilità, ma questa sensibilità appare generalmente insufficiente a rilevare pochissime cellule (microrganismi o cellule cancerose) presenti nelle matrici biologiche come il sangue o nei campioni respiratori molto viscosi.

[0012 ] Nel brevetto US20170144157A1 viene descritta una cella fluidica macro/microfluidica che differisce sostanzialmente dalla presente invenzione poiché: la purificazione dell'acido nucleico estratto viene eseguita mediante filtrazione con un filtro particellare e non usando particelle magnetiche. Inoltre, i campioni vengono spostati tra varie camere già contenenti i diversi reagenti utilizzati per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici; mentre nella presente invenzione viene utilizzata un'unica camera per tutto il processo ed i diversi reagenti vengono inseriti e rimossi da quest’ unica camera.

[0013 ] Nei suddetti dispositivi gli acidi nucleici estratti dalle cartucce micro-fluidiche non possono essere trasferiti automaticamente a rivelatori qPCR ma richiedono sistemi incorporati per la misura degli acidi nucleici.

[0014 ] Pertanto, la presente invenzione riguarda un'invenzione finalizzata a superare alcuni problemi relativi ad applicazioni della diagnostica molecolare che richiedono una notevole sensibilità per identificare un numero limitante di cellule in matrici biologiche complesse, elevata robustezza, una sufficiente produttività e costi sostenibili. Gli inventori hanno scoperto che una elevata sensibilità, in presenza di una qualsiasi matrice biologica, può essere ottenuta mediante una nuova camera di estrazione che può essere replicata all’interno di una cartuccia che facilita l’automazione del processo aumentando la produttività contenendo i costi del test.

RIASSUNTO DELL’ INVENZIONE

[0015 ] La presente invenzione riguarda un dispositivo ed un metodo per l'estrazione, la purificazione e la concentrazione di acidi nucleici da campioni biologici.

[0016 ] In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un'apparecchiatura per l'estrazione e la purificazione di acidi nucleici da campioni biologici che include:

i) Una camera di estrazione costituita da un compartimento superiore e uno inferiore. Il compartimento superiore in cui sono introdotti il campione, le particelle magnetiche ed i reagenti liquidi. Il compartimento orizzontale inferiore è formato da un emicilindro con un raggio sufficientemente piccolo da indurre un comportamento capillare che consente una distribuzione uniforme di piccoli volumi di liquido, in esso contenuti, lungo l'asse del capillare. Una cartuccia può essere formata da più camere di estrazione disposte in matrice bidimensionale consentendo l’esecuzione di più campioni in parallelo e di ottimizzare la produttività del processo.

ii) Una superficie funzionale accoppiata geometricamente alla camera di estrazione. La superficie contiene parti vibranti, aree che generano un campo magnetico e aree a temperatura controllata. Il movimento della cartuccia nelle diverse aree che compongono la superficie multifunzionale, determina cambiamenti fisici del suo contenuto liquido come il controllo della sua temperatura, del campo magnetico e la propagazione di vibrazioni all’interno della camera. Questi cambiamenti fisici sono necessari per eseguire l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici.

iii) Un sistema fluidico accoppiato geometricamente alla cartuccia di estrazione ed alla superficie funzionale, utilizzato per il trasferimento rapido di reagenti liquidi che possono essere introdotti sequenzialmente nella camera di estrazione per automatizzare tutte le fasi di estrazione, purificazione e concentrazione degli acidi nucleici.

[0017 ] In una forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce un dispositivo contenente uno o più moduli di estrazione, posti all'interno di una piattaforma di trasferimento di liquidi per inserire campione e reagenti all'interno delle camere e per trasferire gli acidi nucleici purificati dalla camera a provette di diverso formato, utilizzate per le successive analisi degli acidi nucleici. L'uso parallelo di più cartucce di estrazione e di più di un modulo di estrazione consente di eseguire processi indipendenti aumentando notevolmente la flessibilità della produttività del sistema.

[0018 ] In una forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce un metodo applicato al modulo di estrazione per l'estrazione di acidi nucleici da batteri e funghi o cellule umane.

[0019 ] In un'altra forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce evidenze sperimentali sulla possibilità di ottenere un’elevata sensibilità utilizzando uno stesso metodo per analizzare una pluralità di cellule eucariotiche e procariote contenute in matrici biologiche caratterizzate da una composizione marcatamente diversa come sangue, espettorato, urina, latte ed essudato purulento.

[0020 ] Nel metodo, la dimensione delle particelle magnetiche può essere compresa tra 50 nm e 2,0 µm.

[0021 ] "Campione biologico" è il materiale (o tessuto) in cui sono conservate le cellule.

[0022 ] "Matrice" è il materiale (o tessuto) in cui sono incorporati gli acidi nucleici, solitamente contenuti nelle cellule.

[0023 ] Gli “inibitori " si riferiscono agli inibitori degli enzimi utilizzati nelle reazioni di amplificazione. Esempi di tali inibitori tipicamente includono ioni o sali di ferro (ad esempio, Fe o suoi sali) e altri sali metallici (ad esempio ioni di metalli alcalini, ioni di metalli di transizione). Altri inibitori possono includere proteine, peptidi, lipidi, carboidrati, eme e i suoi prodotti di radicazione, urea, acidi biliari, acidi umici, polisaccaridi, membrane cellulari e componenti citosolici. I principali inibitori nel sangue umano per PCR sono l'emoglobina, la lattoferrina e l'IgG, che sono presenti negli eritrociti, nei leucociti e nel plasma.

[0024 ] "Microfluidico" si riferisce a un dispositivo che effettua diverse fasi del processo mediante camere o condutture di fluido che che contengono pochi microlitri di liquido. Tipicamente, un dispositivo microfluidico include una pluralità di camere (camere di processo, camere di separazione, camere di miscelazione, camere di scarico, camere di reazione di diluizione, camere di reazione di amplificazione, camere di caricamento e simili), ciascuna delle camere è definita da un volume e almeno un canale di distribuzione che collega la pluralità di camere dell'array; una delle camere all'interno della matrice può includere un reagente di lisi (quindi spesso indicato come camera di miscelazione).

DESCRIZIONE DEI DISEGNI

[0025 ] Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione diverranno più evidenti aggiungendo più dettagli e facendo riferimento alle seguenti figure.

[0026 ] DISEGNO 1

La parte 1A è una rappresentazione geometrica della camera monouso utilizzata per l'estrazione e la purificazione di acidi nucleici da un campione biologico. Dove 1Aa è la porzione superiore, 1Ab è la porzione prismatica intermedia, 1Ac è la porzione capillare inferiore, 1Ad è il raggio interno locato alle due estremità della porzione capillare, 1Af è una rappresentazione schematica delle microparticelle magnetiche, 1Ae è il liquido all'interno della camera.

La parte 1B mostra varie camere di estrazione caratterizzate da un raggio interno ridotto (1Ad <0,3 mm) e il comportamento di diversi volumi di particelle magnetiche quando un campo magnetico viene applicato alle camere. Nel disegno, 1Ba rappresenta il magnete, 1Bb rappresenta il puntale in plastica o ago utilizzato per trasferire liquidi all’ interno della camera e 1Bc rappresenta le particelle magnetiche all’interno della camera.

La parte 1C mostra varie camere di estrazione caratterizzate da un raggio interno (1Ad> 0,6 mm) ed il comportamento di diversi volumi particelle magnetiche quando un campo magnetico viene applicato alle camere. Nel disegno 1Ca rappresenta il magnete, 1Cb rappresenta il puntale in plastica o ago utilizzato per trasferire liquidi all’ interno della camera e 1Cc rappresenta le particelle magnetiche all’interno della camera.

[0027 ] DISEGNO 2

La parte 2A è la rappresentazione geometrica di una cartuccia di estrazione formata da una matrice bidimensionale di camere di estrazione replicate lungo due assi ortogonali. Dove 2Ab è la distanza assiale tra le camere nella direzione (y), 2Aa è la distanza assiale tra le camere nella direzione (x) e 2Ac è lo spazio d'aria tra le camere nella direzione (y).

La parte 2B è un diagramma schematico di un sistema composto da diverse superfici progettate per essere accoppiate con la cartuccia di estrazione. Le superfici sono state progettate per controllare alcune proprietà fisiche all'interno delle camere di estrazione come temperatura, campo magnetico e vibrazioni meccaniche. Dove 2Ba è una superficie vibrante, 2Bb è una superficie che applica un campo magnetico su un lato delle camere, 2Bc è una superficie che applica un campo magnetico sull'altro lato delle camere, 2Bd è una superficie a temperatura controllata, 2Bf possono essere magneti permanenti o elettromagneti, 2Be rappresenta la cartuccia di estrazione.

[0028 ] DISEGNO 3

La parte 3A è un diagramma schematico del sistema fluidico utilizzato per trasferire i reagenti all'interno delle camere di estrazione. Dove 3Aa è un magnete o un elettromagnete, 3Ab rappresenta le particelle magnetiche, 3Ad rappresenta la direzione del n flusso di reagenti utilizzati durante il processo di estrazione, 3Ac sono o aghi o puntali monouso.

La parte 3B è un diagramma schematico di un sistema fluidico usato per aspirare i liquidi dalle camere di estrazione. Dove 3Ba è un magnete o un elettromagnete, 3Bb rappresenta le particelle magnetiche, 3Bd rappresenta la direzione del flusso di reagenti utilizzati durante il processo di estrazione, 3Bc sono o aghi o puntali monouso.

[0029 ] DISEGNO 4

La parte 4A è un grafico sperimentale che mostra l'influenza del volume di particelle magnetiche sull'efficienza di estrazione e purificazione degli acidi nucleici.

La parte 4B è un grafico sperimentale che mostra l'influenza del numero di cicli di lavaggio sull'efficienza di estrazione e purificazione degli acidi nucleici.

La parte 4C è un grafico sperimentale che mostra l'influenza del rapporto tra il volume del campione iniziale e il volume di eluizione sull'efficienza di estrazione e purificazione degli acidi nucleici.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Qui di seguito la presente invenzione sarà descritta in maggiori dettagli.

[0030] La presente invenzione, riguardante un apparato per la purificazione di acidi nucleici da cellule o virus, include: i) una camera di estrazione avente un’apertura attraverso la quale vengono introdotti campioni, reagenti e particelle magnetiche o una cartuccia di estrazione formata da una matrice bidimensionale di camere di estrazione; ii) una superficie multifunzionale a contatto con le camere di estrazione che permette di spostare la camera su di essa per mezzo di un attuatore lineare per propagare vibrazioni alla camera, cambiare l'intensità e la direzione del campo magnetico all’interno della camera, cambiare la temperatura della camera; iii) un sistema fluidico usato per trasferire reagenti liquidi nelle camere; iv) un’sistema per il trasferimento dei liquidi utilizzato per trasferire campioni, particelle magnetiche e reagenti all'interno della camera e per prelevare gli acidi nucleici purificati dalla camera di estrazione.

[0031] IL Disegno 1A è una rappresentazione schematica della camera utilizzata durante il processo di estrazione degli acidi nucleici. Il campione, le particelle magnetiche (1Af) e vari reagenti (1Ae) sono inseriti nella cella dall'apertura superiore all’inizio del processo di estrazione. La camera è divisa in 3 volumi principali: la porzione superiore con forma di parallelepipedo (1Aa), la porzione prismatica (1Ab) e la porzione capillare inferiore (1Ac). La porzione superiore (1Aa) ha lo scopo di accogliere un grande volume di campione e reagenti di estrazione; Una sezione rettangolare è stata scelta per consentire il posizionamento di più celle fianco a fianco, riducendo i volumi morti. Il compartimento trapezoidale (1Ab) consente la manipolazione di piccoli volumi di liquido, l'angolo formato dai due piani inclinati è stato ottimizzato per migliorare la discesa del fluido attratto dalla gravità verso la porzione capillare(1Ac). La porzione capillare induce la distribuzione di piccoli volumi lungo l'asse del capillare; il raggio (1Ac) conferisce un comportamento capillare alla porzione inferiore della camera. Non è presente una barriera fisica che divide le diverse pozioni della camera di estrazione, ma, l'effetto delle diverse porzioni e apprezzabile a seconda del volume di liquido contenuto nella camera di estrazione.

[0032] In una rappresentazione della presente invenzione, il volume totale di ogni camera di estrazione può variare da 20µl e 20000µl ed il rapporto tra il volume della porzione capillare e il volume totale della camera di estrazione può variare da 1:2 a 1:1000 e più preferibilmente da 1:20 a 1:100.

[0033] In una rappresentazione della presente invenzione, la dimensione delle particelle magnetiche varia preferibilmente da 50 nm a 1000 µm, e più preferibilmente da 0,1 µm a 10 µm. La porzione capillare nella parte inferiore della cella monouso offre vari vantaggi durante il processo di estrazione degli acidi nucleici. 1) il capillare orizzontale può essere posizionato esternamente a contatto con una superficie orizzontale a temperatura controllata, quindi la temperatura del piccolo volume di liquido all'interno del capillare può essere controllata con precisione.2) Se dei magneti vengono posizionati alternativamente alle estremità del capillare, le particelle magnetiche migrano da un'estremità all'altra del capillare; la migrazione delle particelle magnetiche aumenta l’efficienza della fase di lavaggio ed eluizione degli acidi nucleici.

3) Il capillare orizzontale induce la distribuzione di piccoli volumi di liquido lungo tutta la sua lunghezza; Quando le particelle magnetiche vengono attratte per mezzo di un campo magnetico su un lato del capillare, è possibile prelevare il piccolo volume di liquido rimanente distribuito sul capillare orizzontale senza incontrare il rischio di aspirare le particelle magnetiche.

[0034] In una rappresentazione della presente invenzione la porzione capillare ha un rapporto diametro-lunghezza compreso tra 1:2 e 1:50 e ha preferibilmente un raggio (1Ac) compreso tra 0,1mm e 2mm per assicurare un comportamento capillare alla porzione inferiore.

[0035] I Disegni 1B e 1C evidenziano l'importanza del raggio (1Ad) nella porzione capillare della camera.

[0036] Il Disegno 1B mostra tre camere di estrazione contenenti da sinistra a destra 10,15 e 20 μl di liquido con particelle magnetiche. Le camere visualizzate in figura 1B sono caratterizzate da un raggio (1Ad) di dimensioni ridotte che varia da 0,1 mm a 0,3 mm.

[0037] Il Disegno 1C mostra le stesse condizioni sperimentali del Il Disegno 1B ma con raggio interno di dimensioni maggiori (1Ad). L’incremento del raggio (1Ad) apporta diversi vantaggi alle prestazioni della camera di estrazione.1) I piccoli volumi di liquido (<20ul) sono meglio distribuiti sulla lunghezza del capillare poiché il menisco che il liquido forma alle due porzioni terminali del capillare è meno marcato. La distribuzione più regolare del liquido lungo il capillare mostrato nel disegno 1C consente un più facile campionamento del liquido con un puntale monouso o un ago.

2) L’incremento del raggio (1Ad) diminuisce la possibilità che le particelle magnetiche (1Cc) si blocchino irreversibilmente in la corrispondenza del raggio (1Ad) anche quando la sorgente di campo magnetico (1Ca) viene rimosso. In una rappresentazione della presente invenzione il raggio (1Ad) può variare tra un valore minimo di 0,5 mm fino ad un valore massimo di 10 mm.

[0038] Il Disegno 2A mostra una rappresentazione schematica di una cartuccia di estrazione, formata da una matrice bidimensionale in cui la singola unità che compone la matrice è la camera di estrazione del disegno 1.1) Le camere di estrazione sono disposte lateralmente fianco a fianco nella direzione (x) per ridurre al minimo le dimensioni totali. Nella direzione (x) è stata scelta una distanza assiale (2Aa) tra le camere per rendere la matrice compatibile con tutti i sistemi di trasferimento liquidi standard. La dimensione (2Aa) è preferibilmente un multiplo di 9 mm.2) Nella direzione (y) è stato mantenuto uno spazio (2Ac) tra le camere che compongono la matrice, lo spazio è utile per diversi aspetti durante il processo di estrazione: all'interno dello spazio tra le camere nella direzione (y), può essere posizionato un magnete per indurre la migrazione delle particelle magnetiche da un lato all'altro di ciascuna camera di estrazione nella direzione (y), lungo l'asse della porzione capillare. Nello spazio tra le camere (2Ac) possono essere posizionate alcune alette per aumentare il trasferimento di calore tra la camera ed il supporto dove è alloggiata. Nella direzione (y) è stata scelta una distanza assiale (2Ab) tra le camere, per rendere la matrice compatibile con tutti i sistemi standard per il trasferimento dei liquidi. La dimensione (2Ab) è preferibilmente un multiplo di 9 mm.

[0039] Il Disegno 2B mostra una rappresentazione schematica della superficie multifunzionale, accoppiata geometricamente con una cartuccia o con una singola camera di estrazione. Durante il processo di estrazione la cartuccia viene spostata nella direzione (x) in modo automatico, sulle diverse pozioni componenti la superficie.1) La porzione (2Ba) è stata progettata per trasmettere delle vibrazioni alla cartuccia posizionata su di essa. La vibrazione è utile durante il processo di estrazione per sospendere le particelle magnetiche nel liquido contenuto nella camera e per distaccare le particelle magnetiche dalle pareti delle camere di estrazione, e riportarle in sospensione.2) Le porzioni (2Bb) e (2Bc) contengono dei magneti (2Bf) complementari agli spazi vuoti della cartuccia di estrazione (2Ac). Quando la cartuccia si sposta nella direzione (x) dalla porzione (2Bb) alla porzione (2Bc) o viceversa, il campo magnetico all'interno di ogni camera cambia di direzione, quindi le particelle magnetiche all'interno di ciascuna camera migrano da un lato a l'altro della camera nella direzione (y). Il movimento delle particelle magnetiche, attraverso il liquido da un lato all'altro della camera, aumenta la possibilità che le particelle magnetiche entrino in contatto e catturino le gli acidi nucleici ed allo stesso tempo aumenta l'efficienza di lavaggio delle particelle magnetiche dagli inibitori. Quando le camere di estrazione vengono posizionate in corrispondenza della porzione (2Bb) o (2Bc) le particelle magnetiche contenute in ciascuna camera migrano verso un lato della camera consentendo il prelievo del liquido contenuto nella camera senza incontrare il rischio di aspirare anche le particelle magnetiche.3) La porzione (2Bd) è dotata di un sistema di controllo della temperatura; nella parte superiore della porzione (2Bd) possono essere presenti alcune alette per aumentare la trasmissione del calore dalla porzione (2Bd) alla camera (2Be). Quando alcuni processi devono verificarsi a temperatura controllata, la cartuccia viene posizionata in corrispondenza della porzione (2Bd) per un intervallo di tempo.

[0040] In una rappresentazione della presente invenzione, il sistema utilizzato per spostare la cartuccia nella direzione (x) è scelto dall’insieme comprendente motori accoppiati con un sistema di trasmissione vite-madrevite, con un sistema di trasmissione pignone/cremagliera, con una cinghia di trasmissione o attraverso un motore lineare.

[0041] In una rappresentazione della presente invenzione, il sistema utilizzato per propagare delle vibrazioni alla cartuccia di estrazione è composto da una superficie a contatto con la cartuccia e da un sistema in grado di generare vibrazioni selezionato dall’insieme comprendente vibratori che utilizzano un campo magnetico, vibratori che utilizzano un campo elettrico, vibratori meccanici e materiali piezoelettrici.

[0042] In una rappresentazione della presente invenzione il campo magnetico attraverso la camera di estrazione è generato dal movimento relativo della camera rispetto a magneti permanenti, fissati in diverse posizioni della superficie multifunzionale, o da elettromagneti

[0043] In una forma di realizzazione della presente invenzione il controllo della temperatura in alcune parti della superficie multifunzionale viene eseguito da un sistema selezionato dall’insieme comprendente resistenze elettriche o celle Peltier.

[0044] Le superfici multifunzionali (disegno 2B) possono essere accoppiate con moduli di dispensazione (disegno 3A), i moduli di dispensazione possono essere posizionati sopra la porzione (2Bb) or (2Bc) nel disegno 2B. Il modulo di dispensazione eroga nelle camere di estrazione i reagenti necessari durante il processo di estrazione (3Ad); i reagenti vengono selezionati con un sistema fluidico da una serie di serbatoi e trasferiti nella camera di estrazione per mezzo aghi o puntali monouso (3Ac). Nel caso di una cartuccia formata da una serie di camere di estrazione, una fila di aghi viene posta nella direzione (y), in modo che ciascun ago possa traferire la soluzione di reagente in tutte le camere formanti una fila nella direzione (x) che vengono posizionate sotto di esso. Il disegno 3A mostra che ciascun ago non è centrato rispetto alle camere estrazione ma è posizionato in corrispondenza delle particelle magnetiche (3Ab) che si accumulano sul lato del magnete(3Aa). La dispensazione dei reagenti direttamente sulle particelle magnetiche migliora la sospensione delle particelle magnetiche nella soluzione erogata. I liquidi possono essere trasferiti alle camere mediante aghi fissi o puntali monouso in plastica. I liquidi possono essere dispensati nelle camere da un sistema composto da valvole e siringhe, da un sistema composto da pompe e misuratori di flusso, o da un dispositivo di dispensazione liquidi manuale.

[0045] Le superfici multifunzionali possono essere accoppiate con un modulo di aspirazione (disegno 3B), il modulo di aspirazione può essere posizionato sopra la porzione (2Bb) or (2Bc) nel disegno 2B. Durante l'aspirazione del liquido gli aghi vengono fatti scendere verticalmente (z) fino a raggiungere il fondo della camera di estrazione. Il movimento viene eseguito in modo automatico o manuale. Per evitare la contaminazione tra le diverse camere che compongono la cartuccia, nel caso vengano utilizzati degli aghi permanenti, la velocità di discesa degli aghi nella direzione (z) deve essere controllata in modo che la punta degli aghi non si immerga nel liquido. Nel caso di una cartuccia formata da una serie di camere di estrazione, gli aghi formeranno una fila nella direzione (y), in modo che ciascun ago possa aspirare il liquido nelle camere di estrazione formati una fila nella direzione (x). Il disegno 3B mostra che ciascun ago (3Bc) non è centrato rispetto alle camere di estrazione, ma è posizionato sul lato opposto rispetto alle particelle magnetiche (3Bb) che si accumulano sul lato del magnete (3Ba). Questa disposizione degli aghi di aspirazione riduce il rischio di aspirare le particelle magnetiche insieme al liquido. I liquidi possono essere aspirati dalle camere mediante aghi fissi o puntali monouso in plastica. I liquidi possono essere aspirati dalla camera da un sistema composto da valvole e siringhe, da un sistema composto da una pompa o da un dispositivo di dispensazione liquidi manuale.

[0046] La progettazione delle cartucce di estrazione, delle superfici multifunzionali e del sistema fluidico è altamente modulare. Pertanto, è possibile migliorare la produttività e la flessibilità del sistema aumentando le dimensioni della cartuccia di estrazione e delle superfici multifunzionali o azionando vari sistemi di estrazione in parallelo.

[0047] La progettazione delle cartucce di estrazione, delle superfici multifunzionali e del sistema fluidico è stato pensato per essere facilmente implementabile in una piattaforma robotica di liquidhandling. Pertanto, è possibile automatizzare completamente tutte le fasi del processo incluso l'inserimento del campione all'interno della cartuccia e il trasferimento degli acidi nucleici estratti in provette per PCR.

[0048] La presente invenzione riguarda un metodo per eseguire l'estrazione e la purificazione di acidi nucleici usando l’apparato descritto precedentemente, il metodo include tutte o parte delle seguenti fasi: a) introdurre nelle camere di estrazione (1A) componenti la cartuccia (2A) : il campione biologico, enzimi e/o detergenti noti per distruggere le membrane e/o le pareti cellulari; b) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie a temperatura controllata (2Bd) per consentire l'attività ottimale di enzimi e / o detergenti; c) introdurre nelle camere di estrazione (1A) una soluzione contenente agenti caotropici ad elevata concentrazione e le particelle magnetiche leganti gli acidi nucleici; d) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie vibrante (2Ba) per miscelare il contenuto delle camere di estrazione (1A); e) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie con un campo magnetico fisso per spostare le particelle magnetiche su un lato del compartimento inferiore della camera di estrazione; f) aspirare il liquido contenuto nelle camere di estrazione (1A); g) introdurre nelle camere di estrazione (1A) una soluzione contenente sali, alcoli e detergenti appropriati per solubilizzare eventuali sostanze che possono inibire la PCR, presenti nel campione. h) Trasferire la cartuccia (2A) su una superficie vibrante (2Ba) per risospendere le particelle magnetiche e migliorare il rilascio di sostanze inibitorie dalle particelle magnetiche; j) ripetere il ciclo di lavaggio costituito dalle fasi f, g, h per un numero di volte necessario a rimuovere tutte le sostanze inibenti dalle particelle magnetiche in relazione alle diverse matrici biologiche; k) aspirare completamente il liquido contenuto nella cartuccia di estrazione (2A); l) aggiungere nella camera di estrazione (1A), un volume variabile di una soluzione acquosa a bassa forza ionica; m) trasferire alternativamente la cartuccia (2A) su una superficie a temperatura controllata (2Bd), su una superficie vibrante (2Ba), su superfici con campi magnetici variabili (2Bb e 2Bc) per eluire e solubilizzare gli acidi nucleici legati alle particelle magnetiche nella soluzione acquosa; n) trasferire gli acidi nucleici purificati in una o più provette idonee per l'analisi degli acidi nucleici.

[0049] In una rappresentazione della presente invenzione il rapporto tra il volume del liquido usato per eluire gli acidi nucleici e il volume del campione biologico varia da 1: 1 a 1: 500

[0050] In una rappresentazione della presente invenzione il campione biologico comprende sangue, siero, espettorato, aspirato bronco-alveolare, liquido cerebrospinale, latte, essudati sierosi o purulenti, urina, feci, tampone cutaneo, tampone ferita, tampone nasofaringeo, drenaggi chirurgici.

[0051] La presente invenzione verrà ora descritta in maggior dettaglio con riferimento ai seguenti esempi. I seguenti esempi sono solo a scopo illustrativo e non intendono limitare l'ambito dell'invenzione.

ESEMPI

[0052 ] Negli esempi seguenti, sono presentati i risultati di esperimenti finalizzati a valutare la massima sensibilità ottenibile nel rilevare cellule eucariotiche e procariotiche contenute in diverse matrici biologiche mediante l’ottimizzazione di alcuni elementi critici del metodo, quali: i) la quantità di particelle magnetiche, ii) il numero di cicli di lavaggio per eliminare gli inibitori PCR dalle particelle magnetiche; iii) il rapporto di concentrazione degli acidi nucleici estratti (rapporto tra il volume del campione e il volume degli acidi nucleici purificati). Le cellule contenute nel campione sono state misurate utilizzando la qPCR (vedi materiali e metodi). L'efficienza di rivelazione (% di test positivi su 100 test replicati) è stata valutata in due matrici: a) soluzione salina tamponata con fosfati (PBS). b) in sangue trattato con EDTA. La prima matrice (PBS) non contiene inibitori mentre la seconda matrice (sangue) contiene inibitori in concentrazioni molto elevate. Negli esempi 1 e 2, l’efficienza di rivelazione è stata misurata con un numero nonlimitante di cellule (50 cellule) allo scopo di ottimizzare il volume di particelle magnetiche ed il numero di cicli di lavaggio per eliminare gli inibitori della PCR presenti nel sangue. Utilizzando i risultati ottenuti negli esempi 1 e 2, è stato eseguito un esperimento (esempio 3) a concentrazioni limite di cellule (20 cellule) per verificare l’efficacia del sistema di concentrazione degli acidi nucleici purificati. La metodica ottimizzata in base ai risultati degli esperimenti 1, 2 e 3 è stata quindi utilizzata per verificare la quantità minima di cellule del sangue che può essere rilevata (Esempio 4). In un quinto esperimento (esempio 5) è stata misurata la produttività dell’ apparato riferito a diversi tipi cellulari. .

[0053 ] ESEMPIO 1- Effetto della quantità di particelle magnetiche sull’ efficienza del metodo. Il volume totale di particelle magnetiche è critico per consentire un legame completo degli acidi nucleici contenuti nel campione ma, un eccesso di particelle magnetiche, potrebbe interferire con la loro movimentazione ed il loro posizionamento all'interno della camera di estrazione. L’ esperimento è stato eseguito con particelle paramagnetiche ricoperte di silicio con un diametro medio di 700 nm. Il Disegno 4A mostra l'effetto dell'aumento del volume di particelle aggiunte alla camera di estrazione sull' efficienza di rivelazione. L'efficienza è stata stimata come percentuale di risultati positivi ottenuti con 50 cellule di E. Coli sospese in PBS. L'esperimento indica un volume ottimale di particelle magnetiche compreso tra 1.25 e 3.0�l.

[0054 ] ESEMPIO 2 – Effetto del numero di cicli di lavaggio sull’ eliminazione degli inibitori della PCR. Il sangue è considerato una delle matrici biologiche più problematiche a causa dell’elevata concentrazione di inibitori della PCR, tra cui l’emoglobina, determinando una marcata diminuzione della sensibilità rispetto ai risultati ottenibili in soluzioni acquose. Inoltre, l'eliminazione degli inibitori della PCR è fondamentale per consentire la successiva concentrazione gli acidi nucleici estratti. Per questo motivo, l’emoglobina deve essere allontanata mediante cicli successivi di lavaggio delle particelle magnetiche che comprendono una fase di diluizione, ed una fase di rimozione dell’emoglobina diluita. Il disegno 4B mostra l’aumento di efficienza relativa (sensibilità in acqua / sensibilità in sangue) al variare dei cicli di lavaggio. Utilizzando cellule di E. Coli (50 cellule/ml) sospese in sangue (presenza di inibitori) o in acqua (assenza di inibitori) abbiamo osservato che, per ottenere la stessa efficienza tra cellule sospese in sangue ed in acqua sono necessari almeno 10 cicli di lavaggio. Questo esperimento dimostra, inoltre, che gli inibitori presenti nel campione di sangue possono essere rimossi totalmente dagli acidi nucleici estratti incrementando il numero di cicli di lavaggio.

[0055 ] ESEMPIO 3 – Effetto della concentrazione degli acidi nucleici estratti sull’ efficienza di rivelazione di un numero critico di cellule. In questo esperimento, l'estrazione è stata eseguita a partire da 300 μl di campione (acqua o sangue) contenente 10 cellule batteriche. Gli acidi nucleici purificati sono stati eluiti dalle particelle magnetiche con volumi variabili di acqua (da 300 μl a 14 μl) determinando un rapporto di concentrazione degli acidi nucleici, rispetto alla loro concentrazione nel campione iniziale, variabile da 1:1 a 1:21. Per questo esperimento è’ stato utilizzato un protocollo ottimizzato derivato dai risultati degli esperimenti precedenti (2.0 μl di particelle magnetiche, 14 cicli di lavaggio). Il disegno 4C mostra che la massima sensibilità relativa equivalente al 100% di replicati positivi (6 replicati) sia in acqua che in sangue viene raggiunta con un rapporto di concentrazione degli acidi nucleici superiore a 15.

[0056 ] ESEMPIO 4 – Sensibilità del metodo con diversi tipi cellulari inclusi in diverse matrici biologiche. In questo esempio il limite di detezione (LOD) è stato misurato con un intervallo di confidenza del 95% analizzando i dati ottenuti alle diverse concentrazioni di cellule mediante il software PROBIT (probitsoftware.com). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di estrazione/purificazione degli acidi nucleici: 2.0 μl di particelle magnetiche, 14 cicli di lavaggio e rapporto di concentrazione 18. Il LOD è stato misurato utilizzando una serie di patogeni umani rappresentativi tra cui Gram-positivi (S.pneumoniae S. aureus E. faecium) e Gram-negativi (E.coli P.aeruginosa A.baumannii, K.pneumoniae), lieviti (C. albicans) e cellule tumorali (cellule HeLa e cellule TPH-1). Le cellule sono state diluite in acqua come matrice di riferimento ed in una serie di matrici biologiche rappresentative di fluidi biologici di prevalente interesse clinico: sangue, siero, latte, urine, essudati purulenti e lavaggio bronco-alveolare (BAL). I valori LOD sono presentati nella Tabella 1. Deve essere notato che le metodiche di amplificazione genetica più sensibili raggiungono un LOD compreso tra 5 e 10 cellule / ml, ma che questa sensibilità non è usualmente raggiungibile utilizzando matrici complesse come il sangue. Nel presente esempio, con tutti i tipi di cellule, il LOD misurato era inferiore a 10 cellule / ml indipendentemente dalla matrice, indicando che la metodica consente di raggiungere la massima sensibilità teorica per le tecniche di amplificazione genica e che gli inibitori presenti in una pluralità di campioni biologici non influenzano la sensibilità del metodo.

Tabella 1

[0057 ] ESEMPIO 5 – Misura della Produttività. La produttività, misurata come numero di campioni analizzati / 24 ore, è stata valutata utilizzando un prototipo robotico che include una cartuccia con 24 camere di estrazione, la superfice funzionalizzata accoppiata alla cartuccia e il sistema fluidico descritti nei disegni 2 e 3. I metodi utilizzati per l’estrazione, purificazione e concentrazione degli acidi nucleici da cellule eucariotiche (cellule tumorali in coltura) e cellule procariotiche (batteri e funghi) sono stati descritti nel paragrafo successivo (Materiali e Metodi). La Tabella 2 mostra i livelli di produttività misurati utilizzando differenti tipi cellulari risospesi in sangue utilizzando due metodi: il “Metodo universale” per batteri e funghi (E.coli e C.albicans), questi microrganismi sono caratterizzati da una parete cellulare molto resistente che necessita di una lisi enzimatica e il “Metodo semplificato” per le cellule umane (cellule HeLa) che non richiedono una lisi enzimatica. Gli esperimenti sono stati condotti a una concentrazione costante di 100 cellule/ml di sangue anticoagulato con EDTA. Utilizzando il prototipo robotico di cui sopra, è stata osservata una efficienza di detezione del 100%. Come mostrato nella Tabella 2, richiedendo dei passaggi supplementari per la digestione della parete cellulare, la produttività osservata con i microrganismi è inferiore a quella osservata con le cellule umane.

Tabella 2

[0058 ] - MATERIALI E METODI. Il metodo per l'estrazione, la purificazione e la concentrazione di acidi nucleici utilizzati negli esempi 1-4 è stato progettato per estrarre gli acidi nucleici da ogni tipo cellulare: batteri, funghi e cellule di mammifero contenute in campioni biologici di diversa origine e composizione ( sangue, siero, latte, urine, essudati purulenti e lavaggio broncoalveolare). Questo “Metodo universale” richiede i seguenti passaggi: a) introdurre nella camera di estrazione un volume di campione biologico compreso tra 0,1 e 0,5 ml., b) aggiungere, sequenzialmente, gli enzimi (lisozima, liticasi, chitinasi e proteinasi K) e detergenti noti per disgregare le membrane e le pareti cellulari di specifici tipi di cellule; c) trasferire la cartuccia su una superficie a temperatura controllata per ottenere l'attività ottimale di enzimi e / o di detergenti, d) aggiungere una soluzione caotropica e particelle magnetiche; e) trasferire la cartuccia su una superficie vibrante per migliorare il legame degli acidi nucleici alle particelle magnetiche; f) trasferire la cartuccia su una superficie con un campo magnetico fisso per spostare le particelle magnetiche nel compartimento inferiore della camera; g) rimuovere il liquido contenuto nel compartimento superiore della camera; h) riempire il compartimento superiore della camera con una soluzione contenente etanolo al 70% i) trasferire la cartuccia su una superficie vibrante e su superfici con campi magnetici variabili per risospendere le particelle magnetiche e migliorare il rilascio di sostanze ciò potrebbe inibire la PCR; j) ripetere il ciclo di lavaggio costituito dalle fasi d, e, f e g per il numero di volte necessario a rimuovere tutte le sostanze inibenti in relazione alle diverse matrici biologiche; k) aspirare il liquido contenuto nella camera inferiore; l) aggiungere alla camera inferiore un volume variabile di una soluzione acquosa in relazione al rapporto di concentrazione richiesto; m) trasferire alternativamente la cartuccia su una superficie a temperatura controllata, su una superficie vibrante, su superfici con campi magnetici variabili per eluire e solubilizzare gli acidi nucleici legati alle particelle magnetiche nella soluzione acquosa; n) trasferire gli acidi nucleici purificati e concentrati in una o più provette idonee per l'analisi degli acidi nucleici.

Per estrarre gli acidi nucleici da cellule eucariotiche è stato utilizzato un “Metodo semplificato”. Questo metodo non comprende i passaggi “b” e “c” di cui sopra perché, per ottenere la massima efficienza di estrazione degli acidi nucleici da cellule eucariotiche, non sono richiesti gli enzimi litici necessari per lisare le cellule procariotiche.

L'analisi qPCR utilizzata negli esempi 1-4 è stata eseguita utilizzando 5-10 μl μl di acidi nucleici eluiti e un termociclatore BioRad CFX (BioRad, Hercules, CA, USA). Le coppie di primer per ciascun microrganismo, le sonde Taqman sono state selezionate da regioni conservate di sequenze specifiche, utilizzando il software Beacon DesignerTM (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Per le cellule HeLa, le sequenze HPV integrate in questa linea di cellule umane sono state utilizzate come regioni bersaglio. La miscela qPCR conteneva deossinucleoside trifosfati, 300 nM per tutte le coppie di primer e 200 nM per tutte le sonde. Abbiamo definito il LOD come la concentrazione più bassa (CFU / ml) di ciascuna specie microbica in un campione che è stato rilevato con misura positiva ≥95% per ≥20 replicati

[0059 ] In conclusione, gli esempi presentati dimostrano che la presente invenzione consente elevati livelli di automazione, produttività ed efficienza per la detezione di acidi nucleici estratti da cellule eucariote o procariote contenute in una amplia varietà di matrici biologiche.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un dispositivo per l’estrazione, purificazione e concentrazione automatizzata di acidi nucleici contenuti in campioni biologici, che comprende: - Almeno una cartuccia (2A) composta da una o più camere di estrazione (1A) aventi un’apertura superiore attraverso la quale vengono introdotti campioni, reagenti e particelle magnetiche. La camera di estrazione è caratterizzata da una porzione superiore (1Aa) di forma cilindrica o di parallelepipedo, una porzione di transizione intermedia (1Ab) ed una porzione capillare inferiore (1Ac). Non è presente una barriera fisica che divide le diverse porzioni della camera di estrazione, ma, l'effetto delle diverse porzioni e apprezzabile a seconda del volume di liquido contenuto nella camera di estrazione. - Almeno una superficie multifunzionale (2B) accoppiata geometricamente alla cartuccia di estrazione. Detta superficie contiene aree vibranti, aree generanti un campo magnetico variabile ed aree a temperatura controllata. Il movimento della cartuccia nelle diverse aree che compongono la superficie multifunzionale, determina rapidi cambiamenti fisici del contenuto di ciascuna camera di estrazione (1A): variazioni del campo magnetico all’ interno delle camere di estrazione, variazioni della temperatura del liquido all’ interno della camera e la propagazione di vibrazioni all’interno delle camere di estrazione.
2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui la cartuccia (2A) è una matrice bidimensionale formata da singole camere di estrazione (1A); in una direzione, le camere componenti la matrice sono adiacenti per ridurre al minimo le dimensioni della cartuccia; mentre nella direzione ortogonale, tra le camere di estrazione è presente uno spazio atto a posizionare magneti o alette di scambio termico tra le camere. Le distanze tra le camere lungo le due direzioni ortogonali componenti la matrice è preferibilmente un multiplo di 9 mm.
3. Dispositivo secondo la rivendicazione 1 e 2 in cui, detta porzione capillare inferiore (1Ac) ha un raggio compreso tra 0,1mm e 2mm.
4. Dispositivo secondo la rivendicazione 1,2 e 3 in cui, il volume totale di ciascuna camera di estrazione (1A) è compreso tra 20µl e 20000µl.
5. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, 2, 3, 4 in cui, il campo magnetico variabile è ottenuto attraverso il movimento relativo tra la cartuccia di estrazione e dei magneti permanenti (2Bf) posizionati nella superficie multifunzionale (2B).
6. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, 2, 3, 4 and 5 in cui, le aree vibranti (2Ba) sono attuate da dispositivi selezionati dal gruppo costituito da vibratori che utilizzano un campo magnetico, vibratori che utilizzano un campo elettrico, vibratori meccanici e materiali piezoelettrici.
7. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, 2, 3, 4, 5 e 6 comprendente inoltre un sistema fluidico (3A e 3B), accoppiato geometricamente alla cartuccia di estrazione (2A) ed alla superfice multifunzionale (2B), In modo che tutti i trasferimenti dei reagenti verso le camere (3A) vengano effettuati sul lato in cui sono situate le particelle magnetiche (3Ab) e tutti i trasferimenti di liquido dalle camere (3B) vengano effettuati sul lato opposto rispetto alla posizione delle particelle magnetiche (3Bb).
8. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 comprendente, inoltre, un sistema per l’analisi degli acidi nucleici estratti.
9. Un metodo, utilizzante il dispositivo delle rivendicazioni 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, in cui l'estrazione, la purificazione e la concentrazione di acidi nucleici da campioni biologici, sono effettuate in una sequenza che include tutte o parte delle seguenti fasi: a) introdurre nelle camere di estrazione (1A) componenti la cartuccia (2A) : il campione biologico, enzimi e/o detergenti noti per distruggere le membrane e/o le pareti cellulari; b) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie a temperatura controllata (2Bd) per consentire l'attività ottimale di enzimi e / o detergenti; c) introdurre nelle camere di estrazione (1A) una soluzione contenente agenti caotropici ad elevata concentrazione e le particelle magnetiche leganti gli acidi nucleici; d) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie vibrante (2Ba) per miscelare il contenuto delle camere di estrazione (1A); e) trasferire la cartuccia (2A) su una superficie con un campo magnetico fisso per spostare le particelle magnetiche su un lato del compartimento inferiore della camera di estrazione; f) aspirare il liquido contenuto nelle camere di estrazione (1A); g) introdurre nelle camere di estrazione (1A) una soluzione contenente sali, alcoli e detergenti appropriati per solubilizzare eventuali sostanze che possono inibire la PCR, presenti nel campione. h) Trasferire la cartuccia (2A) su una superficie vibrante (2Ba) per risospendere le particelle magnetiche e migliorare il rilascio di sostanze inibitorie dalle particelle magnetiche; j) ripetere il ciclo di lavaggio costituito dalle fasi f, g, h per un numero di volte necessario a rimuovere tutte le sostanze inibenti dalle particelle magnetiche in relazione alle diverse matrici biologiche; k) aspirare completamente il liquido contenuto nella cartuccia di estrazione (2A); l) aggiungere nella camera di estrazione (1A), un volume variabile di una soluzione acquosa a bassa forza ionica; m) trasferire alternativamente la cartuccia (2A) su una superficie a temperatura controllata (2Bd), su una superficie vibrante (2Ba), su superfici con campi magnetici variabili (2Bb e 2Bc) per eluire e solubilizzare gli acidi nucleici legati alle particelle magnetiche nella soluzione acquosa; n) trasferire gli acidi nucleici purificati in una o più provette idonee per l'analisi degli acidi nucleici.
10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui il rapporto tra il volume del liquido usato per eluire e concentrare gli acidi nucleici e il volume del campione originale varia da 1: 1 a 1: 500
11. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui il campione biologico può essere selezionato dal gruppo che comprende: sangue, siero, espettorato, aspirato bronco-alveolare, liquido cerebrospinale, latte, essudati sierosi o purulenti, urina, feci, tampone cutaneo, tampone ferita, tampone nasofaringeo, drenaggi chirurgici.