JP4704196B2 - 核酸の精製装置及び精製方法 - Google Patents

核酸の精製装置及び精製方法 Download PDF

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Description

本発明は、レーザ吸収度の異なるビーズを用いる核酸の精製装置、及び前記装置を用いる核酸の精製方法に関する。
細胞からのＤＮＡの効率的な抽出は、多くの適用で必要であり、分子学的な診断、特に、病原菌の同定及び定量化に必須である。分子学的な診断は、一般的にＤＮＡ抽出工程後のＤＮＡ増幅によって行われる。ＤＮＡ増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸増幅、修復連鎖反応、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢ複製酵素増幅、及び転写活性化連結が含まれる。
細胞からのＤＮＡの分離方法は、ＤＮＡを結合する傾向を有する物質を利用して行われた。ＤＮＡの分離のための物質の例は、シリカ、ガラスファイバ、陰イオン交換樹脂、及び磁性ビーズである（非特許文献１及び２参照）。手作業工程を避け、作業者の誤りを取り除くために、いくつかの自動化機械が大量ＤＮＡ抽出のために開発されている。
細胞溶解は、一般的に、機械的、化学的、熱的、電気的、超音波、及びマイクロウェーブ方法で行われる（非特許文献３参照）。
レーザは、細胞の破壊に多くの長所を有し、ＬＯＣ（Ｌａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）によく適用されうる（非特許文献４参照）。
特許文献１には、レーザ誘導された細胞溶解システムが記載されている。レーザのみを用いたとき、効果的な細胞溶解が起こらない。透明度の高い溶液内に入れた大腸菌を用いて実験した結果、レーザのみを照射した場合に、細胞溶解効率が低いということが確認されている。１５０秒間レーザを照射した後のＤＮＡ濃度は、３．７７ｎｇ／μｌであったが、これは、レーザエネルギーが効果的に細胞に伝達されなかったためである。一般的な加熱方法によって９５℃で５分間沸騰させた後のＤＮＡ濃度は、６．１５ｎｇ／μｌである。
特許文献２には、増加した組織修復のための、光を吸収するナノ粒子が記載されている。この特許は、一つ以上の波長で光を吸収する、直径が１ないし１０００ｎｍであるナノ粒子を、組織に運んで連結させ、前記ナノ粒子を、ナノ粒子によって吸収された一つ以上の波長の光に露出させることを含む、組織を連結する方法に関するものである。この方法は、レーザ及びナノ粒子を用いて細胞の機能のみを失わせる方法であり、細胞及び粒子を含む溶液を振動させて細胞を破壊する方法については記載されていない。
従来から、固相を用いた核酸の精製方法が知られている。例えば、特許文献３には、固相に結合した核酸を用いた核酸の精製方法が開示されている。具体的には、前記方法は、出発物質、カオトロピック物質、及び固相に結合した核酸を混合する工程、前記核酸を有する固相を液体から分離する工程、及び前記固相核酸複合体を洗浄する工程を含む。
米国特許公開２００３／９６４２９Ａ１号明細書 米国特許第６，６８５，７３０号明細書 米国特許第５，２３４，８０９号明細書 Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２、５０６〜５１１（１９９７） Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２、５５４〜５５７（１９９７） Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、４９２〜４９６（２００１） Ｈｕａｉｎａ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、７３、４６２５〜４６３１（２００１）
しかし、特許文献３に開示されている方法は、時間が長くかかり、複雑であり、それゆえＬＯＣに適さない。また、この方法は、カオトロピック物質の使用の問題を有する。すなわち、カオトロピック物質を使用しない場合には、固相に核酸が結合しない。また、カオトロピック物質は、人体に有害な物質であるので注意して扱わなければならない。さらにカオトロピック物質は、ＰＣＲなどの後続の工程を妨害する物質として作用するので、核酸の精製中または精製後に、精製された核酸から除去しなければならない。
ＬＯＣの実施のためには、細胞溶解後の核酸の精製工程が、効率的なＰＣＲ増幅のために必要とされる。しかし、従来の核酸の精製工程は、時間が長くかかり、別途の化学物質の使用の問題を有する。したがって、別途の化学物質を用いずに、迅速かつ効率的に核酸を精製する方法が求められている。
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、レーザ吸収度の高い磁性ビーズを細胞溶解に用い、レーザ吸収度の低いシリコンビーズまたはシリコン基板を核酸精製に用いた場合、ビーズ間の異なるレーザ吸収度を利用することによって、核酸が効率的に精製されうることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、レーザ吸収度の異なるビーズを用いた核酸の精製装置及び前記装置を用いた核酸の精製方法を提供することにある。
本発明の目的を達成するために、本発明の第一は、試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を通じて試料、磁性ビーズ、及び固状支持体を収容する細胞溶解毛細管と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管内で前記試料、磁性ビーズ、及び固状支持体を含む混合物を混合する振動器と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管にレーザを供給するレーザ発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶解液を排出する排水チャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させる溶出バッファーチャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記溶出された核酸溶液を中和させる中和バッファーを供給する中和バッファーチャンバとを備える、細胞またはウイルスの核酸精製装置を提供する。
本発明の第二は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、振動器を作動させて前記溶液、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を混合する工程と、前記磁性ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を固状支持体に結合させる工程と、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、前記固状支持体から核酸を溶出させ、中和する工程を含む、前記核酸精製装置を用いた核酸の精製方法である。
本発明の第三は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、振動器を作動させて前記溶液、磁性ビーズ、及び固状支持体を混合する工程と、前記磁性ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を固状支持体に結合させる工程と、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、前記溶解液中の核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させ中和する工程と、前記磁性ビーズ及び前記固状支持体が除去された溶液を得、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通して増幅チャンバに移送して増幅を行う工程を含む、前記核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法である。
本発明の方法によれば、ＰＣＲ阻害剤が除去されてＰＣＲ収率を高めることができ、シリコン基板またはシリカビーズを用いて核酸精製が可能である。それゆえ、本発明の方法はＬＯＣの製作に応用できる。
以下、添付された図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の細胞またはウイルスの核酸精製装置は、試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を通じて試料、磁性ビーズ及び固状支持体を収容する細胞溶解毛細管と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管内で前記試料、磁性ビーズ、及び固状支持体を含む混合物を混合する振動器と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管にレーザを供給するレーザ発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶解液を排出する排水チャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させる溶出バッファーチャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記溶出した核酸溶液を中和させる中和バッファーを供給する中和バッファーチャンバとを備える。
ビーズの種類によってレーザを吸収する能力が異なる。磁性ビーズはレーザを吸収するが、シリカビーズまたはシリコン基板などの固状支持体は、近赤外線波長のレーザを吸収せずに通過させる。したがって、二つのビーズ間にレーザ吸収度の差異が生じ、これにより、熱吸収度の差異が生じる。よって、磁性ビーズは細胞溶解に使用され、シリカビーズまたはシリコン基板などの固状支持体は、核酸精製に使用される。
本発明の装置において、試料導入口を通じて投入された試料、磁性ビーズ、及び核酸の捕捉のための固状支持体が細胞溶解毛細管内で混合され、ここにレーザを照射すれば、細胞が溶解する。細胞溶解毛細管は、レーザビームを通過させうる材質で形成されうるか、またはそのような材質で形成されたウィンドウを有しうる。前記細胞溶解毛細管は、直径と長さの比率が１：２〜１：５０であり、直径が１ｍｍ〜５ｍｍでありうる。前記細胞溶解毛細管は、磁性ビーズが効果的に固定される材質でなければならない。そのような材質の例は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属を含む。
振動器は、細胞溶解毛細管内で試料、磁性ビーズ、及び固状支持体を混合する装置であって、振動できるものであれば、いかなる装置でも適用可能である。
レーザ発生部は、前記細胞溶解毛細管にレーザビームを照射する装置であって、特定の波長の光を放出しうる。レーザ出力が低すぎる場合、効率的にレーザアブレーション現象を起こすことができない。レーザ出力は、連続波動（ＣＷ：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｗａｖｅ）レーザの場合１０ｍＷ〜３００Ｗであり、パルスレーザの場合１ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスである。望ましくは、前記パルスレーザの出力が３２ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスであり、ＣＷレーザの出力が１０Ｗ〜３００Ｗである。ＣＷの出力が１０ｍＷ未満であり、パルスレーザの出力が１ｍＪ／パルス未満の場合、細胞を破壊するための十分なエネルギーが伝達されない。ＣＷの出力が３００Ｗを超え、パルスレーザの出力が１Ｊ／パルスを超える場合、ＤＮＡが損傷する。
ＰＣＲ阻害剤が結合した磁性ビーズは自然に毛細管の壁に付着するが、一部の磁性ビーズは、付着し難い。それゆえ、磁気力発生部は、このような磁性ビーズを確実に毛細管の壁に固定させるために磁気力を供給する装置である。
排水チャンバは、ＰＣＲ阻害剤が磁性ビーズに結合し、核酸が固相に結合した後、細胞溶解毛細管内に存在する細胞溶解液を排出するチャンバである。前記細胞溶解液中には、ＰＣＲ阻害剤が多く存在するため、これを除去するために前記排水チャンバを通じて排出する。
排水チャンバを通じて細胞溶解液が排出された後、毛細管の下部には、核酸が結合した固状支持体が残る。溶出バッファーチャンバは、前記核酸が結合した固状支持体から核酸を分離するために、溶出バッファーを供給するチャンバである。溶出バッファーとしては、例えば、ＮａＯＨ溶液を含む。
前記溶出された核酸は、溶出バッファーの高いｐＨによって変性されて不安定であるため、中和バッファーチャンバは、前記核酸を安定化させるために中和バッファーを供給するチャンバである。中和バッファーとしては、例えば、トリスバッファーを含む。
図１は、レーザ及び磁性ビーズを用いた細胞溶解の後、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズの層、及び核酸が結合した固状支持体の層が分離するシステムの一実施形態を示す模式図である。図１に示したように、細胞が溶解した後、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズは、レーザ吸収によって沸き上がって毛細管の上部に付着する。シリカビーズまたはシリコン基板のようなレーザを通過させる固状支持体は、細胞溶解物から分離した核酸を捕捉し、毛細管の下部に位置する。結果として、層分離が起こる。
本発明の一実施形態において、前記振動器は、超音波発生器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械式振動器、または圧電物質を含みうる。振動器は、細胞溶解毛細管に装着されており、細胞またはウイルス、磁性ビーズ、及び固状支持体の混合物を振動させうるものならば、いかなる装置でも可能である。
本発明の一実施形態において、前記磁気力発生部は、レーザの通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることが望ましい。図１に示したように、前記電磁石は、レーザの通路の上部に位置しなければならないが、これは、レーザの通路内に位置すると、磁性ビーズがＰＣＲ阻害剤を吸着する前に電磁石に付着して、ＰＣＲ阻害剤の吸着の効果が減少するためである。電磁石は、細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するとき、電源が入ることが望ましい。磁性ビーズが沸騰する前に、電磁石の電源が入っていても、磁性ビーズ及び電磁石は空間的に分離されているため、磁性ビーズに磁気力の影響が及ばず、磁性ビーズが電磁石に付着できない。加えて、電磁石で除去するためには、ビーズは磁性を有さなければならない。
本発明の一実施形態において、前記細胞溶解毛細管と、弁によって開閉される流路を通して連結されているＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えうる。ＬＯＣの実施のためには、精製されたＤＮＡを増幅するシステムが必要である。精製されたＤＮＡは、分光光度計を利用する方法、マイクロ磁性ビーズを利用する方法、電気化学的な方法、電気化学発光法、放射線及び蛍光標識を利用する方法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いて検出されうる。所望のＤＮＡを十分に増幅するためには、ＰＣＲ法が最も適している。他のＤＮＡの増幅方法が適用されてもよく、リアルタイムＰＣＲ法による直接検出も可能である。
本発明の一実施形態において、前記細胞溶解毛細管と前記ＤＮＡ増幅チャンバとの間の流路内に位置し、前記固状支持体を濾過する膜をさらに含みうる。核酸を捕捉するために使われる固状支持体が、溶出バッファーによって核酸を溶出した後には、核酸のみがＤＮＡ増幅チャンバに移動し、固状支持体は除去されなければならない。したがって、核酸が溶出した固状支持体を取り除き、溶出した核酸のみをＤＮＡ増幅チャンバに移動させるためには、固状支持体を濾過する膜が必要である。前記膜は、核酸は通過させ、固状支持体を濾過できるものであれば、特に制限されない。
本発明の一実施形態において、前記毛細管に装着され、核酸が結合した固状支持体を洗浄する洗浄バッファーチャンバをさらに備えうる。細胞またはウイルスが溶解した後、ＰＣＲ阻害剤の一部は、磁性ビーズに結合し、磁性ビーズは磁気力発生部に付着して除去され、核酸は固状支持体に付着する。次いで、排水チャンバを通して細胞溶解液を排出した後、核酸が結合している残留した固状支持体を洗浄して、固状支持体に残っている不純物を除去する工程が必要である。前記工程を経れば、核酸はさらに精製され、ＤＮＡ増幅効率が改良される。洗浄バッファーの例としては、固状支持体から核酸を溶出させずに、不純物を除去できるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を含むが、これに制限されない。
また本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、振動器を作動させて前記溶液、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を混合する工程と、前記磁性ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を固状支持体に結合させる工程と、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、前記固状支持体から核酸を溶出させ、中和する工程を含む、前記核酸精製装置を用いて核酸を精製する方法に関する。
本発明の方法において、ビーズの異なる種類の、レーザを吸収する能力の差異が利用される。磁性ビーズは、レーザを吸収するが、シリカビーズまたはシリコン基板などの固状支持体は、近赤外線波長のレーザを吸収せずに通過させる。したがって、二つのビーズ間のレーザ吸収度の差異が生じる。そのため磁性ビーズは細胞溶解に利用され、シリカビーズまたはシリコン基板などの固状支持体は核酸精製に利用される。
この方法において、前記試料、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体は細胞溶解毛細管に注入され、振動器を用いてこれらを混合する間、レーザが照射される。磁性ビーズはレーザを吸収して、細胞またはウイルスを破壊する。レーザによって沸き上がった磁性ビーズは、ＰＣＲ阻害剤を捕捉し、自然に毛細管の壁に付着するか、または磁気力発生部によって毛細管の壁に付着する。細胞溶解液中の核酸は、シリカビーズまたはシリコン基板などの固状支持体に結合し、毛細管の下部に位置する。次いで、核酸が結合した固状支持体のみが細胞溶解毛細管内に残るが、溶解液は排水チャンバを通して排出される。核酸が結合した固状支持体は、洗浄バッファーを用いて洗浄され、ＰＣＲ阻害剤をさらに除去する。固状支持体に結合した核酸は、溶出バッファーを用いて溶出され、さらに核酸を精製するために、変性された核酸は中和バッファーを用いて中和される。得られた核酸溶液を、核酸を増幅するために増幅チャンバに移動させる。
磁性ビーズを含む溶液にレーザを照射すれば、磁性ビーズがレーザアブレーションが起こり、衝撃波、蒸気圧、及び熱が細胞の表面に伝達される。このとき、物理的衝撃も細胞表面に加えられる。レーザアブレーションとは、レーザビームが照射された物質に発生する一般的な現象を総称する。レーザアブレーションによって、素材の表面の温度は、数百から数千度まで急速に上昇する。物質表面の温度が蒸発点以上に上昇すれば、液層の物質の蒸発と共に、表面での飽和蒸気圧が急速に上昇する。
レーザによって加熱された磁性ビーズは、溶液の温度を上げ、細胞を直接破壊する。溶液中の磁性ビーズは、単純な熱伝導体として存在するものではなく、熱的、機械的、及び物理的影響を細胞の表面に与え、それにより細胞の表面を効果的に破壊する。破壊された細胞またはウイルスの溶解液は、ＰＣＲを妨害する化合物を含む。したがって、ＰＣＲを効率的に行うためには、前記溶解液からＰＣＲ阻害剤を除去する工程が必要であるが、これは、ＬＯＣを効率的に実施することに適していない。本発明の方法において、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて細胞溶解毛細管の壁に固定させ、核酸は、固状支持体に結合させることによってさらに効率的に精製され、ＰＣＲを容易にする。
具体的には、変性された蛋白質及ぶ細胞の残骸などのＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズは、レーザによって沸き上がって容器の壁の上部に付着し、容器の下部には、磁性ビーズのない核酸が結合した固状支持体層が存在するので、ＰＣＲ阻害剤が容易に除去される。この層分離は制限的な直径を有する毛細管でさらに効率的に起こる。固定された電磁石または永久磁石は、分離された層をさらに確実に固定すると共に、固定化領域を指定するために使われうる。
また本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、振動器を作動させて前記溶液、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を混合する工程と、前記磁性ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を固状支持体に結合させる工程と、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、前記溶解液中の核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させ中和する工程と、前記磁性ビーズ及び前記固状支持体が除去された溶液を得、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通して増幅チャンバに移送して増幅を行う工程を含む、前記核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法に関する。
ＬＯＣを実施するためには、核酸の分離、精製、及び増幅を連続して行う必要がある。したがって、精製されたＤＮＡ溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通して増幅チャンバに直ちに移送して核酸を増幅することにより、前記目的は達成される。核酸の増幅チャンバへの移送は、機械的な力を用いたポンプなどによって行われうる。
本発明の一実施形態において、前記レーザは、パルスレーザまたはＣＷレーザを含みうる。
低すぎるレーザ出力では、効率的にレーザアブレーション現象は起こらない。レーザ出力は、ＣＷの場合１０ｍＷ〜３００Ｗであり、パルスレーザの場合１ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスである。望ましくは、前記パルスレーザが３２ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスの出力を有し、ＣＷレーザが１０Ｗ〜３００Ｗの出力を有する。ＣＷの出力が１０ｍＷ未満であり、パルスレーザの出力が１ｍＪ／パルス未満の場合、細胞を破壊するための十分なエネルギーが伝達されない。ＣＷの出力が３００Ｗを超え、パルスレーザの出力が１Ｊ／パルスを超える場合、ＤＮＡが損傷する。
本発明の一実施形態において、前記レーザは、磁性ビーズがレーザを吸収する特定の波長帯で発生するものでなければならない。前記レーザは、７５０ｎｍ以上の波長帯で発生することが望ましく、さらに望ましくは、７５０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長帯で発生することが望ましい。７５０ｎｍ未満の波長では、シリカビーズによるレーザアブレーションが増加し、５０００ｎｍを超す波長では、溶液によるレーザアブレーションが増加する。それゆえ、レーザアブレーションでの明確な差異が得られない。また、前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生しうる。すなわち、レーザは、前記波長範囲内の一つの波長、または相異なる２つ以上の波長であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ〜１,０００μｍであることが望ましく、さらに望ましくは、前記磁性ビーズの大きさは、１〜５０μｍである。磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満であれば、物理的及び機械的衝撃が細胞溶解を引き起こすのに不十分である。１，０００μｍを超えれば、ＬＯＣに適さない。また、前記磁性ビーズは、２つ以上の大きさを有する磁性ビーズの混合物であってもよい。すなわち、前記磁性ビーズは、互いに同じ大きさでもよく、相異なる大きさの磁性ビーズの混合物であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記毛細管状の容器は、直径と長さの比率が１：２〜１：５０であり、直径は１ｍｍ〜５ｍｍでありうる。磁性ビーズを含む層は、ガラス壁の表面に非特異的に結合するが、これは、制限的な直径を有する毛細管で効率的に起こる。したがって、直径が前記範囲を外れた容器の場合には、層分離が難しくなって精製効果が低下する。
本発明の一実施形態において、前記容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されうる。前記容器は、ビーズが固定されうるいかなる材質でも適用可能である。
なお、前記毛細管状の容器として、前記細胞溶解毛細管を用いることもできる。
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは磁性を帯びるいかなるものでも適用可能である。特に、強磁性を帯びる金属であるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びその酸化物からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含むことが望ましい。
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは、強磁性を帯びる金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスでありうる。
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの表面は、ＤＮＡが付着しない負電荷を帯びている構造になっていることが望ましい。前記負電荷は、例えば、ＣＯＯ−でありうる。ＤＮＡは負電荷を帯びているため、反発力によって、負電荷を帯びていた磁性ビーズの表面にＤＮＡは付着しない。磁性ビーズの表面にＤＮＡが付着すれば、細胞が破壊された後で磁性ビーズからＤＮＡを分離することが難しくなり、ＤＮＡの精製がより難しくなる。
本発明の一実施形態において、前記細胞またはウイルスを含む溶液は唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されうる。前記細胞またはウイルスを含む溶液は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、ウイルス、ファージなど、核酸を有するいかなるものでも適用可能である。
本発明の一実施形態において、前記固状支持体は、シリカビーズ、シリコン基板、ゲルマニウム、ダイヤモンド、水晶、シリコンなどを含みうる。前記固状支持体は、近赤外線波長のレーザを全く吸収しないか、またはほんの少し吸収するものでなければならず、核酸を結合できるものであれば、いかなるものでも適用可能である。望ましくは、シリカビーズまたはシリコン基板が使われる。前記シリカビーズの大きさは、５０ｎｍ〜１，０００μｍであり、望ましくは、１〜５０μｍである。シリカビーズの大きさが５０ｎｍ未満であれば、製造コストが増加する。１，０００μｍを超えれば、ＬＯＣに適さない。
本発明の一実施形態において、前記シリカビーズが２つ以上の大きさを有するシリカビーズの混合物でありうる。すなわち、前記シリカビーズは、同じ大きさであってもよく、相異なる大きさのシリカビーズの混合物であってもよい。核酸が負電荷を帯びていることから、静電的な相互作用によって核酸を固状支持体に結合させるために、シリカビーズの表面は、正電荷を帯びた物質でコーティングされうる。正電荷を帯びる物質は、例えば、ベタイン、アミノ基などである。図２Ａは、核酸を捕捉している、ベタインでコーティングされたシリカビーズの模式図である。
本発明の一実施形態において、前記シリコン基板は、例えば、柱状またはシリカビーズが固定されている構造でありうる。これらの構造は、通常のシリコン基板より表面積が増大するので、より多くの核酸がシリコン基板に結合しうる。図２Ｂは、核酸を捕捉している、ベタインでコーティングされた柱状のシリコン基板の模式図である。シリコン基板の小片を、シリカビーズの代用にするか、またはシリコン基板を用いて毛細管の壁が製造されうる。
以下、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれら実施例によって制限されるものではない。
実施例１：本発明の装置及び方法を用いた核酸の精製
本発明の核酸の精製装置及び精製方法を用いて、組み換えＢ型肝炎ウイルス（ｒＨＢＶ）から核酸を精製した。具体的には、図１に示したように、組み換えＢ型肝炎ウイルス（ｒＨＢＶ）（３０μｌ）、血清（５μｌ）、ＰＢＳ（２５μｌ）、ベタインでコーティングされたシラン化シリカビーズ（３０μｌ）、及びマイクロ磁性ビーズ（３０μｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ、ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）をＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ毛細管（内径：２．４２ｍｍ、高さ：３５．４０ｍｍ、内径：高さの比率＝１：１４．６３）内で混合した。毛細管をボルテキシングで攪拌しつつ、ウイルスを破壊するために、１５秒間８０８ｎｍ、２１．１Ｗ（ＨＬＵ２５Ｆ１００−８０８、ドイツ、ＬＩＭＯ社製）の高出力レーザビームを照射した。ウイルス溶解後に、ウイルス溶解液を、排水ポンプを通して排出し、核酸を捕捉したシリカビーズを０．１ＭＰＢＳバッファー１２０μｌで洗浄した。次いで、０．１ＮＮａＯＨ溶液３０μｌを用いてシリカビーズから核酸を溶出させ、１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ７）１μｌで溶出された核酸を中和させ、ＰＣＲ増幅に使用した。
ＰＣＲを以下のプライマーを用いて実施した：プライマーＴＭＰ５−Ｆ（配列番号１）、及びプライマーＴＭＰ５−Ｒ（配列番号２）。このプライマー対は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムの２，２６９〜２，３８７ヌクレオチドに該当する部位であった。ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑ重合酵素（韓国、Ｔａｋａｒａ社製）を用いて４０サイクル（５０℃で１０分及び９５℃で１分間予備変性、９５℃で５秒間変性、６２℃で１５秒間アニーリング及び伸張）行った。増幅されたＤＮＡは、市販のＤＮＡ５００アッセイサイジングの試薬セットを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００（カリフォルニア州パロアルト、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で分析した。
図３は、ＤＮＡ精製方法を変えたときの、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。上部の矢印は、所望のＰＣＲ産物に該当するバンドを示し、下部の矢印は、ＰＣＲ副産物として生成する、ＰＣＲプライマーのダイマーを示す。レーン１及び２は、本発明の方法によって核酸を精製した後にＰＣＲを実施したものであり、レーン３ないし５は、ＰＣＲ陽性コントロールとして、Ｑｉａｇｅｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いて核酸を精製した後にＰＣＲを実施したものである。レーン６は、ＰＣＲ陰性コントロールとして、蒸溜水のみを用いてＰＣＲを行ったものである。各試料の組成は、下記の表の通りである。
図３から分かるように、陰性コントロール（レーン６）には、予想したようにＰＣＲ産物が観察されなかったが、本発明の方法によって核酸を精製した後にＰＣＲを実施した場合（レーン１及び２）には、所望の位置（１００ｂｐ）にＰＣＲ産物が観察された。Ｑｉａｇｅｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いて核酸を精製した後にＰＣＲを実施した場合（レーン３ないし５）にも、ＰＣＲ産物が観察された。このことから、精製に長い時間及び多くの工程が必要とされる、陽性コントロールであるＱｉａｇｅｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いてＤＮＡを精製した場合、及び本発明の方法は、同様のＰＣＲ増幅効率を示すということが分かる。本発明の方法は、ＤＮＡ精製に通常利用されるＱｉａｇｅｎ法に比べて、短時間及び少ない工程で、ＰＣＲの阻害なしにＰＣＲが効果的に行われるので、ＬＯＣに有効に適用されうる。
図４は、ＤＮＡ精製方法を変えたときの、増幅されたＰＣＲ産物の濃度を示すグラフである。縦軸は増幅されたＤＮＡ濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ産物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。試料１及び２は、本発明の方法によって核酸を精製した後にＰＣＲを実施したものであり、試料３ないし５は、ＰＣＲ陽性コントロールとして、Ｑｉａｇｅｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いて核酸を精製した後にＰＣＲを実施したものであり、試料６は、ＰＣＲ陰性コントロールとして、蒸溜水のみを用いてＰＣＲを行ったものである。各試料の組成は、前記表の通りである。図４に示したように、本発明の方法を用いたＰＣＲの結果は、Ｑｉａｇｅｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いた結果と同様であるか、または優れている。
図５は、ＰＣＲにより生成したダイマーの濃度を示すグラフである。縦軸は、ダイマーの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ダイマーの量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。各試料番号は、前記図４のものと同一である。ダイマーは、ＰＣＲ副産物である。一般的に、ＰＣＲの結果が良ければ、所望のＰＣＲ産物の濃度は増加し、ダイマーの濃度は減少する。ＰＣＲの結果が悪ければ、所望のＰＣＲ産物の濃度は減少し、ダイマーの濃度は増加する。したがって、鋳型ＤＮＡが精製されるほど所望のＰＣＲ産物の濃度は増加し、ダイマーの濃度は減少する。図５に示したように、本発明の方法（試料１及び２）は、Ｑｉａｇｅｎ法（試料３ないし５）に比べてダイマーの量が少なく、これは、本発明の方法がＱｉａｇｅｎ法に比べて、より効果的に精製されたＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡを生成させるということを示している。したがって、本発明の方法を最適化することにより、さらに良好なＰＣＲ収率が期待できる。
本発明は、核酸の精製装置及び精製方法に関連した技術分野に適用可能である。
レーザ及び磁性ビーズを用いた細胞溶解の後、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズ層及び核酸が結合した固状支持体層が分離されているシステムの、一実施形態を示す模式図である。 ベタインでコーティングされているシリカビーズに、核酸が捕捉されていることを示す模式図である。 ベタインでコーティングされている柱状のシリコン基板に、核酸が捕捉されていることを示す模式図である。 ＤＮＡの精製方法を変えたときの、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。 ＤＮＡの精製方法を変えたときの、増幅されたＰＣＲ産物の濃度を示すグラフである。 ＰＣＲによって生成したダイマーの濃度を示すグラフである。

Claims (26)

  1. 試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を通じて試料、磁性ビーズ、並びにシリカビーズ、シリコン基板、ゲルマニウム、ダイヤモンド、水晶及びシリコンからなる群より選択される固状支持体が収容された細胞溶解毛細管と、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管内で前記試料、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を含む混合物を混合する振動器と、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管にレーザを供給するレーザ発生部と、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶解液を排出する排水チャンバと、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させる溶出バッファーチャンバと、
    前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶出された核酸溶液を中和させる中和バッファーを供給する中和バッファーチャンバと、
    を備える細胞またはウイルスの核酸精製装置：
    ここで、前記磁性ビーズは前記レーザを吸収し、前記固状支持体は前記磁性ビーズよりもレーザ吸収度が低く、前記レーザは、７５０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長帯で発生する。
  2. 前記磁性ビーズの大きさは、５０ｎｍ〜１，０００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
  3. 前記磁性ビーズは、２つ以上の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置。
  4. 前記毛細管状の容器は、直径と長さの比率が１：２〜１：５０であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
  5. 前記毛細管状の容器は、直径が１ｍｍ〜５ｍｍであることを特徴とする請求項４に記載の装置。
  6. 前記毛細管状の容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
  7. 前記磁性ビーズは、強磁性を帯びる金属であるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びその酸化物からなる群より選択される１つ以上の物質を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
  8. 前記磁性ビーズは、強磁性を帯びる金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
  9. 前記磁性ビーズの表面が、負電荷を帯びることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
  10. 前記シリカビーズの大きさは、５０ｎｍ〜１，０００μｍであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
  11. 前記シリカビーズは、２つ以上の大きさを有するシリカビーズの混合物であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
  12. 前記シリカビーズの表面が、正電荷を帯びる物質でコーティングされていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
  13. 前記シリコン基板は、柱状またはシリカビーズが固定されている構造であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置。
  14. 前記振動器は、超音波発生器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、機械式振動器、及び圧電物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
  15. 前記磁気力発生部は、レーザ通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するとき、電源が入る電磁石であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
  16. 前記細胞溶解毛細管と弁によって開閉される流路を通して連結されているＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
  17. 前記細胞溶解毛細管と前記ＤＮＡ増幅チャンバとの間の流路内に位置し、前記固状支持体を濾過する膜をさらに備えることを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
  18. 前記毛細管に装着されて、核酸が結合した固状支持体を洗浄する洗浄バッファーチャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
  19. 細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、
    振動器を作動させて前記溶液、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を混合する工程と、
    前記磁性ビーズに７５０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長帯で発生するレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を固状支持体に結合させる工程と、
    前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、
    磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、
    前記固状支持体から核酸を溶出させ、中和する工程と、
    を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸精製装置を用いた核酸の精製方法。
  20. 細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズ及び固状支持体を含む毛細管状の容器に注入する工程と、
    振動器を作動させて前記溶液、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を混合する工程と、
    前記磁性ビーズに７５０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長帯で発生するレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させ、溶解液中の核酸を前記固状支持体に結合させる工程と、
    前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて前記毛細管状の容器の壁に固定させる工程と、
    磁性ビーズが除去された前記溶解液を排出する工程と、
    前記溶解液中の核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させ、中和する工程と、
    前記磁性ビーズ及び前記固状支持体が除去された溶液を得、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通して増幅チャンバに移送して増幅を行う工程と、
    を含む、請求項１６または１７に記載の核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法。
  21. 前記溶解液の排出工程後に、前記核酸が結合した固状支持体を洗浄し、洗浄液を排出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記レーザは、１ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスの出力を有するパルスレーザからなることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記レーザが、１０ｍＷ〜３００Ｗの出力を有する前記連続波動レーザからなることを特徴とする、請求項１９〜２１に記載の方法。
  24. 前記レーザは、７５０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長帯で発生することを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  26. 前記細胞またはウイルスを含む溶液は、唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
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