JP2007306914A - 単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法、ならびに該方法を行う装置 - Google Patents

単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法、ならびに該方法を行う装置 Download PDF

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Abstract

【課題】単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法、ならびに該方法を行う装置を提供する。
【解決手段】親水性内表面を有するマイクロチャンバに、核酸含有試料とコスモトロピック塩とを含む溶液を導入し、前記マイクロチャンバの内表面に核酸を結合させることにより、前記核酸を濃縮する段階と、前記マイクロチャンバにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を添加してＰＣＲを行う段階と、を含むことを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を単一のマイクロチャンバで連続的に行う方法、ならびに該方法を行う装置である。
【選択図】図１

Description

本発明は、単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法、ならびに該方法を行う装置に関する。
高純度の二重鎖プラスミドＤＮＡ、単一鎖ファージＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、およびアガロースゲルから精製されたＤＮＡ断片の製造は、分子生物学において非常に重要である。ＤＮＡを精製する理想的な方法は、簡単であり、迅速であり、存在したとてしても、付加的な試料の操作をほとんど含まない。前記のような方法により得られたＤＮＡは、直接、形質転換、制限酵素分析、ライゲーション、またはシークエンシングに用いられうる。前記のような方法は、研究および診断実験室で好まれるＤＮＡ試料製造の自動化において、非常に魅力的である。
従来、固相物質を用いた核酸の精製方法が知られている。例えば、特許文献１には、核酸に結合する固相物質を用いた核酸の精製方法が開示されている。具体的には、前記方法は、出発物質、カオトロピック（すなわち、水の構造を壊す）物質、および核酸が結合した固相物質を混合する段階；前記核酸が結合した前記固相物質を液体から分離する段階；ならびに固相物質−核酸複合体を洗浄する段階を含む。しかし、この方法は、長時間かかり、複雑であり、ラボ・オン・チップ（Ｌａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）の装置および応用には不適である。また、この方法は、必ずカオトロピック物質を使用しなければならないという問題点を有する。
また、特許文献２には、固相マトリックスを用いた核酸の保存方法が開示されている。この方法は、核酸が固相マトリックスに非可逆的に結合するため、保管後の核酸−固相マトリックス複合体の後分析または繰り返し分析が可能であるという点において好都合である。しかしながら、この方法によれば、アルミナのような表面に正電荷を帯びる物質は、ＮａＯＨなどの塩基性物質の添加によって親水性化されなければならない。核酸は、親水性化されたアルミナに、非可逆的に結合するために、アルミナから分離することができない。したがって、ＤＮＡが非可逆的に結合した固相マトリックスでは、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）の収率が低いという問題がある。
特許文献３は、固相物質に標的核酸を付着させるために疎水性の有機ポリマーの固相上に標的核酸を含む試料を導入する段階と、固相に非イオン性界面活性剤を添加し付着された標的核酸を除去する段階とを含む、試料から核酸を分離する方法を開示している。しかし、前記の特許は、疎水性の固相を用いて核酸を分離しているという点で、親水性表面の固体相、およびコスモトロピック塩を利用し、同じマイクロチャンバで核酸の濃縮及び増幅を連続的に行った本発明とは異なる。
米国特許第５，２３４，８０９号明細書 米国特許第６，２９１，１６６号明細書 米国特許第６，３８３，７８３号明細書
本発明は、前記の従来技術の問題点を解決するためのものであり、その目的は、核酸の濃縮および増幅を効率良く行う手段を提供することにある。
本発明者らは、前記のような従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた結果、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバに、コスモトロピック塩を添加して核酸をマイクロチャンバにおいて濃縮し、濃縮された核酸を利用して同じマイクロチャンバでＰＣＲを行えば、単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を連続的に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、親水性内表面を有するマイクロチャンバに、核酸含有試料とコスモトロピック塩とを含む溶液を導入し、前記マイクロチャンバの内表面に前記核酸を結合させることにより、前記核酸を濃縮する段階と、前記マイクロチャンバにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を添加してＰＣＲを行う段階と、を含むことを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を単一のマイクロチャンバで連続的に行う方法である。
また、本発明は、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバと、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバに核酸含有試料を供給する核酸含有試料保管部と、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにコスモトロピック塩を供給するコスモトロピック塩溶液保管部と、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにＰＣＲ混合物を供給するＰＣＲ混合物保管部と、前記マイクロチャンバを加熱および冷却する加熱部および冷却部と、を備えることを特徴とする、核酸含有試料中の核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置である。
さらに、本発明は、内表面に親水性基を有するマイクロチャンバを備えるチップと、前記チップを収容する核酸増幅部と、を備えることを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置である。
さらに、本発明は、前記の装置を備えることを特徴とする、ラボ・オン・チップである。
本発明によれば、核酸の濃縮および増幅を効率良く行う手段が提供されうる。
本発明の第１は、親水性内表面を有するマイクロチャンバに、核酸含有試料とコスモトロピック塩とを含む溶液を導入し、前記マイクロチャンバの内表面に前記核酸を結合させることにより、前記核酸を濃縮する段階と、前記マイクロチャンバにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を添加してＰＣＲを行う段階と、を含むことを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を１つのマイクロチャンバで連続的に行う方法である。
本発明は、核酸分析のための試料の調製とリアルタイムＰＣＲとを単一マイクロチャンバで行う方法に関する。標的遺伝子の増幅および検出のためには、ＤＮＡは生物学的試料から単離および精製されなければならない。細胞溶解物に存在し、ＰＣＲ反応を阻害する多様な不純物は、精製段階により除去される。従来のプロセスでは、特定遺伝子の精製、増幅、および検出が別々のマイクロチャンバで行われ、遺伝子分析の間、時間およびコストが余計にかかり、また、試料の交差汚染の可能性を著しく高くさせる。本発明では、核酸の精製および濃縮と核酸増幅とが統合されているため、分析のプロセスが単純化され、かつ、交差汚染の危険性が低減されている。
図１は、核酸の濃縮および増幅を単一のマイクロチャンバでどのように行うかを示す模式図である。標的遺伝子は、単一のマイクロチャンバ２０の内部で核酸を含む生物学的試料１０から精製および濃縮され、精製および濃縮された標的遺伝子は、同じマイクロチャンバ２０の内部で増幅され、リアルタイムで検出される（図１中の３０参照）。しかしながら、これを行うためには、いくつかの条件が満足されなければならない。第一に、ＤＮＡ精製および濃縮に用いられる試薬は、リアルタイムＰＣＲに影響を与えてはならないため、カオトロピック塩およびエタノールなどのＰＣＲ阻害剤は使用できない。第二に、大きい表面積を有するＳｉＯ２チップでＰＣＲが行われなければならないが、ＳｉＯ２の表面は、ＰＣＲ阻害剤として作用するため、ＰＣＲ阻害を減少させるための添加剤が添加される必要がある。第三に、ＳｉＯ２チップは、高いＤＮＡ結合効率を有さなければならない。
これらの問題点を解決するために、核酸の精製に従来用いられているカオトロピック塩の代わりに、コスモトロピック塩が用いられる。カオトロピック塩が用いられる場合、マイクロチャンバの表面が脱水され、核酸が水素結合によりマイクロチャンバに直接結合するため、核酸の結合はｐＨに影響され、カオトロピック塩はＰＣＲ阻害剤として作用する。しかし、コスモトロピック塩が用いられる場合、コスモトロピック塩に曝されているマイクロチャンバの表面は水和され、マイクロチャンバの表面に安定化された水層が形成される。核酸は、水層に結合している水素によってマイクロチャンバの表面に吸着され、これは、親水性相互作用による塩析効果に起因する。図２は、コスモトロピック塩の存在下で、マイクロチャンバの親水性表面に核酸が結合する様子を表す模式図である。図２から分かるように、コスモトロピック塩の塩析効果により、シリカ基板２１０（図２の左側部分）は水素結合により水と結合し、形成された水層２２０（図２の中央部分）は、核酸２３０（図２の右側部分）とさらに水素結合を形成するので、核酸が安定化された水層を媒介として、マイクロチャンバに結合することとなる。したがって、マイクロチャンバと結合している核酸は、従来核酸結合に必要な酸性条件を必要とせず、マイクロチャンバの内表面がシリカに限定される必要もない。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、核酸含有試料およびコスモトロピック塩を含む溶液が、マイクロチャンバの内部に導入されると、コスモトロピック塩の塩析効果により、親水性官能基を有するマイクロチャンバの内表面に水が水素結合を形成し、形成された水層は、核酸とさらに水素結合を形成し、結果として核酸は前記マイクロチャンバの内表面に結合される。核酸を前記マイクロチャンバの内表面に結合させた後、前記マイクロチャンバの内表面に結合されていない、核酸含有試料の核酸以外の他の成分を洗浄することにより、結合された核酸は、さらに純粋な形態で濃縮されうる（すなわち、精製される）。それゆえ、洗浄液は、結合されていない核酸含有試料のいかなるものでも除去するために、核酸を有するマイクロチャンバの内表面を通りながら、マイクロチャンバを通過する。前記洗浄液は、核酸が前記マイクロチャンバの内表面に結合する際に用いられたコスモトロピック塩溶液よりも低い、コスモトロピック塩の濃度を有する。
本発明の一実施形態による核酸の増幅方法において、核酸が濃縮されたマイクロチャンバにＰＣＲ混合物が添加され、前記マイクロチャンバの内表面に結合しているか、または前記マイクロチャンバの内表面から分離された標的核酸を用いてＰＣＲが行われる。前記ＰＣＲ混合物の組成および濃度は、導入されるポリメラーゼによって変わりうるということは、当業者に理解されるであろう。また、ＰＣＲの条件は、増幅しようとするＰＣＲ産物の長さ、テンプレートとプライマーとの配列相同性、プライマー長などによって適切に選択されうる。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、ＰＣＲの実施段階で添加されうる。大きい表面積を有するマイクロチャンバで、マイクロチャンバのＳｉＯ２内表面は、ＰＣＲ阻害剤として作用するため、阻害作用を減らすために適当な添加剤が添加されうる。よって、本発明では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することによって、ＰＣＲ増幅効率が向上される。前記ポリエチレングリコールの濃度は、ＰＣＲ混合物の全質量に対して１〜１０質量％であることが好ましい。前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度は、ＰＣＲ混合物の全量に対して０．１〜１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。前記の濃度範囲を外れると、ＰＣＲ増幅効率が低下する場合がある。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記マイクロチャンバの内表面は、複数個のピラーを有することが好ましい。核酸含有試料とマイクロチャンバとの接触機会を増加させるために、前記マイクロチャンバの内表面は、平面構造よりも広い表面積を有するピラー構造を有することがより好ましい。前記ピラーは、正方形、長方形、菱形、円筒形、円錘形、六角形、八角形などの多様な形を有することができる。前記ピラー間の間隔は８〜５０μｍであることが好ましい。前記ピラー間の間隔が前記範囲を外れると、核酸の結合効率および増幅効率が低下する場合がある。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記マイクロチャンバは内表面に親水性官能基を有する。前記親水性官能基は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ポリカルボキシル基、およびシラノール基からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましいが、これらに限定されず、いかなる親水性基であってもよい。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記コスモトロピック塩の具体的な例としては、例えば、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ化物、ギ酸塩、酢酸塩などが好ましく挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記コスモトロピック塩は、ホフマイスターシリーズ（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ）により、蛋白質の結晶化を誘発し、疎水性粒子に対する塩析イオンとしての役割を果たし、水構造を形成する。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記核酸含有試料および前記コスモトロピック塩を含む溶液のｐＨは、３〜１０であることが好ましい。前記核酸含有試料および前記コスモトロピック塩を含む溶液のｐＨが前記範囲を外れれば、ＤＮＡが物理的および化学的に変性され、次の段階に悪影響を与える場合がある。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記コスモトロピック塩の濃度は、前記核酸含有試料および前記コスモトロピック塩を含む溶液の全量に対して１００〜２，０００ｍＭであることが好ましい。前記コスモトロピック塩の濃度が１００ｍＭ未満の場合、マイクロチャンバに結合する核酸の結合効率が低下する場合がある。前記コスモトロピック塩の濃度が２，０００ｍＭを超える場合、緩衝液の溶解性の制限および過剰な緩衝液の濃度により、有用な溶液を調製することが困難となる場合がある。
本発明の一実施形態による核酸を濃縮および増幅する方法において、前記核酸含有試料は、血液、血清、小便、唾液、または細胞培養液に存在するバクテリアもしくはウイルスの細胞溶解物であることが好ましいが、これらに制限されるものではない。本発明に用いられる核酸含有試料は、哺乳動物、植物、バクテリア、または酵母由来であることが好ましい。前記核酸含有試料は、単一細胞形態であってもまたは組織形態であってもよく、細胞または組織は、試験管内培養物由来でありうる。
本発明の第２は、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバと、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバに核酸含有試料を供給する核酸含有試料保管部と、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにコスモトロピック塩を供給するコスモトロピック塩溶液保管部と、前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにＰＣＲ混合物を供給するＰＣＲ混合物保管部と、前記マイクロチャンバを加熱および冷却する加熱部および冷却部と、を備えることを特徴とする、拡散含有試料中の核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置である。
本発明の一実施形態による核酸の濃縮および増幅を行う装置は、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバ、核酸含有試料保管部、コスモトロピック塩溶液保管部、ＰＣＲ混合物保管部、加熱部、および冷却部を含む。本発明の一実施形態による核酸の濃縮および増幅を行う装置において、前記マイクロチャンバは、チップ内に１つのチャンバを含み、内表面に水と水素結合を形成して安定な水層を形成する親水性官能基を含む。形成された安定な水層は、核酸と結合する。前記親水性官能基は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ポリカルボキシル基、およびシラノール基からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましいが、これらに限定されず、いかなる親水性基であってもよい。
前記核酸含有試料保管部は、マイクロチャンバに核酸含有試料を供給する部分であり、マイクロチャンバと第１のマイクロチャンネルを介して相互連結されている。
前記コスモトロピック塩溶液保管部は、マイクロチャンバにコスモトロピック塩を供給する部分であって、マイクロチャンバと第２のマイクロチャンネルを介して相互接続されている。分離しようとする核酸含有試料が第１マイクロチャンネルを通して装置に導入されると、前記コスモトロピック塩溶液保管部は、コスモトロピック塩を、第２マイクロチャンネルを通してマイクロチャンバに供給し、マイクロチャンバ内で核酸含有試料とコスモトロピック塩とが混合され、コスモトロピック塩の塩析効果により、核酸がマイクロチャンバに結合される。
前記ＰＣＲ混合物保管部は、マイクロチャンバにＰＣＲ混合物を供給する部分であって、マイクロチャンバと第３のマイクロチャンネルを介して相互接続されている。核酸がマイクロチャンバに濃縮された後、前記ＰＣＲ混合物保管部はＰＣＲ混合物を第３のマイクロチャンネルを通してマイクロチャンバ内に注入し、ＰＣＲを行う。
前記加熱部および前記冷却部は、前記マイクロチャンバを加熱および冷却する部分であり、ＰＣＲ混合物がマイクロチャンバ内に導入されると、ＰＣＲの条件により、加熱部および冷却部は、加熱および冷却によりマイクロチャンバの温度を調節する。
本発明の一実施形態による核酸の濃縮および増幅を行う装置において、前記マイクロチャンバの内表面は、複数個のピラーを有することが好ましい。核酸含有試料とマイクロチャンバとの接触機会を増加させるために、前記マイクロチャンバの内表面は、平面構造よりも広い表面積を有するピラー構造を有することがより好ましい。前記ピラーは、正方形、長方形、菱形、円筒形、円錘形、六角形、八角形などの多様な形を有することができる。前記ピラー間の間隔は８〜５０μｍであることが好ましい。前記ピラー間の間隔が前記範囲を外れると、核酸の結合効率および増幅効率が低下する場合がある。
本発明の一実施形態による核酸の濃縮および増幅を行う装置において、前記核酸含有試料は、血液、血清、小便、唾液、または細胞培養液に存在するバクテリアもしくはウイルスの細胞溶解物であることが好ましいが、これらに制限されるものではない。本発明に用いられる核酸含有試料は、哺乳動物、植物、バクテリア、または酵母由来であることが好ましい。前記拡散含有試料は、単一細胞形態であってもまたは組織形態であってもよく、前記単一細胞または前記組織は、試験管内培養物由来でありうる。
本発明の第３は、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバを備えるチップと、前記チップを収容する核酸増幅部と、を備えることを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置である。本発明の装置は、チップおよび核酸増幅部を含み、前記チップは、内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバを備え、前記チップは１つのチャンバを含む。前記マイクロチャンバは、内表面に親水性官能基を有しているため、ここに核酸含有試料およびコスモトロピック塩を含む溶液を導入すると、核酸がマイクロチャンバの内表面に結合されて核酸が濃縮される。前記核酸増幅部は、前記チップを含み、前記チップの前記マイクロチャンバ内で濃縮された核酸を増幅する。核酸が濃縮されたマイクロチャンバを備えるチップは、前記核酸増幅部に配置されて、マイクロチャンバ内にＰＣＲ混合物が導入され、濃縮された核酸を増幅させるためにＰＣＲが行われる。
本発明の第４は、前記核酸の濃縮および増幅を行う装置を備えるラボ・オン・チップである。本発明の核酸の濃縮および増幅を行う装置において、それぞれの機能的な構成要素は、公知のマイクロ流体技術およびＭＥＭＳ素子を用いてプロセス・オン・チップ（Ｐｒｏｃｅｓｓ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）によって具現されうるだけではなく、ラボ・オン・チップでも具現されうる。
以下、本発明について、実施例を通してさらに具体的に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１：チップの表面積の増大に対するＰＣＲの効率の違い）
チップの表面積の増大に対するＰＣＲの効率の違いを調べた。ＰＣＲは、ＴＭＣ１０００（Ｓａｍｓｕｎｇ社製）機器を用いて行った。ＴＭＣ１０００は、シリコンチップ上で定量ＰＣＲを行う装置である。別途に記載した場合を除き、すべての実験に用いられたテンプレートＤＮＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ゲノムＤＮＡであり、反応当たり１．４×１０５コピーが用いられた。１コピーのゲノムＤＮＡは、７個の標的核酸（１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子）を有しているので、反応当たり総数で１０６コピーの標的遺伝子が含まれている。ＰＣＲプライマーとして、フォワードプライマー（ＹＣＣＡＫＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣ：配列番号１）およびリバースプライマー（ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＲＲＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ：配列番号２）が用いられた。
別途に記載した場合を除き、ＰＣＲ混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｓｏｌｇｅｎｔ社製）、５．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭであるプライマー、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲ温度条件は、次の通りである。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲチューブでのＰＣＲは、９４℃５分間で１サイクル、ならびに９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル行った後、生成されたＰＣＲ産物を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて定量化した。チップでのＰＣＲは、９４℃１分間で１サイクル、ならびに９４℃で５秒間、６２℃で５秒間、ならびに７２℃で２０秒間を４０サイクル行い、生成されたＰＣＲ産物は、ＴＭＣ１０００（Ｓａｍｓｕｎｇ社製）を用いてリアルタイムで測定した。
図３は、チップの表面積の増大に対するＰＣＲの効率の違いを示すグラフである。図３から分かるように、体積に対するチップの表面積の比が増加するほど、生成されたＰＣＲ産物の量が少なくなり、生成されたＰＣＲ産物の量が、体積に対するチップの表面積の比と密接に関連しているということが分かる。したがって、大きい表面積を有するチップを用いてＰＣＲを行うためには、ＰＣＲ阻害を低減させる他の添加剤が加えられる必要がある。
（実施例２：ＰＥＧの濃度の違いに対するＰＣＲの効率の違い）
大きな表面積を有するチップに関し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度の違いに対するＰＣＲの効率の違いを調べた。ＰＣＲ混合物の総質量に対してＰＥＧを０．３１質量％、１．２５質量％、２．５質量％、５質量％、および１０質量％の濃度でそれぞれ添加した５サンプルを調製したことを除いては、実施例１と同様にＰＣＲを行った。図４は、ＰＥＧの濃度の違いに対するＰＣＲの効率の違いを示すグラフである。図４で左側のグラフはＲｎ値を示し、右側のグラフはＣｔ値を示す。蛍光測定値であるＣｔは、スレショルド・サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）としてリアルタイムで増幅される蛍光量を測定することにより表される。同じ試料が用いられれば、Ｃｔ値が低いほどＰＣＲの効率が高い。Ｃｔ値は、１サイクルの差は、２倍かまたは半分のＤＮＡ濃度であるということを示す単位である。Ｒｎは、ＰＣＲ産物の濃度と関連し、Ｒｎ値が大きいほどＰＣＲ産物の濃度が高いということを意味する。図４から分かるように、５質量％のＰＥＧを添加した場合に、Ｒｎ値が最も大きく、Ｃｔ値が最も小さいので、ＰＣＲの効率が最も高いということが分かる。
（実施例３：ＢＳＡの濃度の違いに対するＰＣＲの効率の違い）
大きな表面積を有するチップに関し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度の違いによるＰＣＲの効率の違いを調べた。ＰＣＲ混合物の総質量に対してＰＥＧ５質量％を添加し、そこにＢＳＡを、ＰＣＲ混合物全量に対して０．６２ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、および１０ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した５サンプルを調製したことを除いては、実施例１と同様にＰＣＲを行った。図５は、ＢＳＡの濃度の違いに対するＰＣＲの効率の違いを示すグラフである。図５で、左側のグラフはＲｎ値を表し、右側のグラフはＣｔ値を表す。図５から分かるように、０．６２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した場合に、Ｒｎ値が最も大きく、Ｃｔ値が最も小さいので、ＰＣＲの効率が最も高いということが分かる。
（実施例４：様々な表面積を有するチップに対するＰＣＲの効率の違い）
様々な表面積を有するチップに対するＰＣＲの効率の違いを調べるために、６種類のチップを調製した。シリコンチップ（Ｓｉ／ＳｉＯ２）の調製工程は下記の通りである。
（１）ウェハ洗浄
ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝３：１体積比、１２０℃）で１５分間処理し、流水で洗浄後に乾燥した。
（２）ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）コーティング
洗浄されたウェハ上に、スピンコーターを用いてヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）５ｍｌを滴下した後、５００ｒｐｍで５秒および４，０００ｒｐｍで４０秒コーティングを行い、１２０℃で２分間、ホットプレートでベーキングした。
（３）フォトレジスト（ＰＲ）コーティング
ベーキングされたウェハ上に、フォトレジスト（ＧＸＲ６０１、ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社から入手可能）を５ｍｌ滴下した後、５００ｒｐｍで５秒および４，０００ｒｐｍで４０秒コーティングを行った。
（４）ソフトベーキング
フォトレジストがコートされたウェハを、ホットプレートを用いて９５℃で２分間ベーキングを行った。
（５）ＵＶ露光
ＵＶ ａｌｉｇｎｅｒ（ｉ線）にピラー作製用マスクを装着した後、フォトレジストがコートされたウェハに対して、３６５ｎｍの波長の光を２５０ｍＪ／ｃｍ２の照射量で照射した。
（６）現像
ＭＩＦ ３００（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）現像機を用いて現像を行った。
（７）ハードベーキング
現像されたウェハに対して、１１５℃で２分間ハードベーキングを行った。
（８）Ｄｅｅｐ ＲＩＥ
ＳＴＳ ＩＣＰ−ＲＩＥ機器を用いて、１００μｍのＳｉエッチングを行った。
（９）除去
アッシング装置を用い、エッチングされたウェハからフォトレジストを除去した。
（１０）ＰＲストリップ
残存するフォトレジストの除去および洗浄するために、アッシングされたウェハをピラニア溶液で１５分間処理し、洗浄および乾燥を行った。
（１１）フッ化水素（ＨＦ）処理
前記（１０）で得られたウェハを、希釈したＨＦで１分間処理し、自然酸化物を除去した。
（１２）Ｓｉ酸化
ＳｉＯ２の成長のために、水蒸気を用いた湿式酸化を行い、ＳｉＯ２を３，０００Ａの厚さに成長させた。
（１３）ウェハ洗浄
ウェハをピラニア溶液で１５分間処理し、洗浄および乾燥を行った。
（１４）陽極接合
前記（１３）で洗浄されたウェハの上にガラス基板を置き、４００℃の熱と１，０００Ｖの電圧とを印加して接合させ、マイクロチップを完成させた。
図６は、様々な表面積を有する６種類のチップを示す写真である。各チップのピラーのサイズ、ピラー間の間隔、ピラー高、総表面積、試料を導入できる体積、および体積に対する表面積の比は、下記表１の通りである。
調製されたチップに関して、ＤＮＡ結合効率およびＰＣＲ効率を調べた。ＤＮＡ結合効率を測定するために使用した緩衝液は、次の通りである。結合緩衝液として、１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用い、洗浄緩衝液として、０．０１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用いた。まず、ＤＮＡを含む試料を、結合緩衝液と１：１体積比で混合した後チップに注入し、次に、洗浄緩衝液をチップに加えて洗浄を行った。チップから出てきた結合緩衝液および洗浄緩衝液に含まれているＤＮＡ量をＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて定量し、このように測定したＤＮＡ量と、もともと試料に入っていたＤＮＡ量との差によって、チップに結合されたＤＮＡ量を予測した。
ＰＣＲは、それぞれのチップで用いられているＰＣＲ混合物に、ＰＥＧ ５質量％およびＢＳＡ ０．６２ｍｇ／ｍｌをそれぞれ添加したことを除いては、実施例１と同様にＰＣＲを行った。図７は、様々な表面積を有するチップに対するＤＮＡ結合の効率およびＰＣＲの効率を示すグラフである。図７から分かるように、ピラーのサイズが２５μｍであり、ピラー間の間隔が１７μｍである２番のチップの場合に、Ｃｔ値が最も小さく、ＤＮＡ結合効率が高いということが分かる（図７中、矢印で表示している）。この結果から、ＤＮＡ結合効率は、チップの表面積に概して比例し、表面積が大きいほど、ＤＮＡ結合効率も高くなるということが分かる。しかし、チップの表面積が大きいほどＣｔ値は上昇し、ＰＣＲの効率は低下する。
（実施例５：精製されたＤＮＡを用いた核酸濃縮および増幅の効率）
精製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ ｇＤＮＡ ０．０１２ｎｇ／μｌ（１６７００標的遺伝子コピー／μｌ）を用いて、核酸の濃縮および増幅の効率を調べた。ＤＮＡの濃縮において、結合緩衝液として、１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用い、洗浄緩衝液として、０．０１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用いた。ＰＣＲは、実施例４と同様に行った。図８は、核酸の濃縮に対するＰＣＲの効率を示すグラフである。図８で、曲線Ａは、核酸を濃縮する前の、初期のＤＮＡ溶液からの核酸のＰＣＲの結果であり、曲線Ｂは、本発明の方法を用いて濃縮したＤＮＡを用いたＰＣＲの結果である。図８から分かるように、濃縮前と比較して、濃縮したＤＮＡを用いた場合は、著しく低いＣｔ値および高いＲｎ値を表す。したがって、本発明の核酸の濃縮および増幅の方法を利用すれば、ＤＮＡは効率良くマイクロチャンバの内表面に結合され、それによりチップ内で濃縮されるということが分かる。
本発明の方法を用いた核酸の濃縮の効率を定量的に評価するために、テンプレートとして大腸菌ＢＬ２１のｇＤＮＡコピー数によるＣｔ値を測定した。結果は下記表２の通りである。
前記表２に記載されたデータを用い、大腸菌ＢＬ２１ ｇＤＮＡの標的遺伝子コピー数によるＣｔ値を表す標準曲線を作成した。図９は、大腸菌ＢＬ２１ ｇＤＮＡの標的遺伝子コピー数に対するＣｔ値を示す標準曲線である。図９で、右側の点線は、理論的に大腸菌ＢＬ２１ ｇＤＮＡのすべてが損失なく４０倍濃縮される場合（１．００×１０６コピー）に対応するＣｔ値を表し、左側の点線は、濃縮前の初期のＢＬ２１ ｇＤＮＡ溶液（１６７００コピー／μｌ）に対応するＣｔ値を表す。図９から分かるように、ピラー構造を有さない６番のチップの場合、ＤＮＡの濃縮効率が低くＣｔ値が相対的に高いが、２番のチップの場合、ＤＮＡの濃縮効率が非常に高くＣｔ値が非常に低い。２番のチップの場合、１．００×１０６コピーの３５％に該当するＣｔ値を示す。よって、４０倍の濃縮の工程で６５％の損失が生じたが、ＤＮＡのかなりの量が濃縮されたということを表している。
（実施例６：細胞溶解物を利用した核酸濃縮および増幅効率）
１．３×１０５細胞／μｌの濃度を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１の溶解物を用い、核酸の濃縮および増幅の効率を調べた。ＤＮＡの濃縮において、結合緩衝液として、１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用い、洗浄緩衝液として、０．０１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）の混合物を用いた。ＰＣＲは、実施例４と同様に行った。図１０は、核酸の濃縮に対するＰＣＲ効率の違いを示すグラフである。図１０で、曲線Ａは、核酸を濃縮する前の、初期のＤＮＡ溶液からの核酸のＰＣＲの結果であり、曲線Ｂは、本発明の方法を用いて濃縮したＤＮＡを用いたＰＣＲの結果である。図１０から分かるように、濃縮前のＤＮＡを用いたＣｔ値は２５．５であったが、核酸濃縮後のＣｔ値は１５．３７と顕著に低くなっている。すなわち、本発明の方法を用いると、ＰＣＲ阻害剤が多量に存在する細胞溶解物でも、核酸が効率よく濃縮、精製、および増幅されるということが分かる。
本発明の方法を用いた核酸の濃縮の効率を定量的に評価するために、テンプレートである大腸菌ＢＬ２１細胞数に対するＣｔ値を測定した。結果は下記表３の通りである。
前記表３に記載されたデータを用い、大腸菌ＢＬ２１細胞数に対するＣｔ値の標準曲線を作成した。図１１は、大腸菌ＢＬ２１細胞数に対するＣｔ値を示す標準曲線である。図１１で、右側の点線は理論的に大腸菌ＢＬ２１細胞を５０倍濃縮する場合（１×１０７細胞／μｌ）に対応するＣｔ値（１９．６９）を表し、左側の点線は、濃縮前の初期の大腸菌ＢＬ２１細胞数（１．３×１０５細胞／μｌ）に対応するＣｔ値を表す。図１１から分かるように、２番のチップの場合、Ｃｔ値は１９．６９よりも著しく低いということが分かる。２番のチップに対応するＣｔ値を細胞数に換算すれば、初期の細胞が約５００倍以上濃縮されたことになる。これは、核酸濃縮の過程で、細胞溶解物中に存在するＰＣＲ阻害剤が除去されて、核酸がさらに純粋な形態で得られたためである。
したがって、本発明の方法を用いれば、ＰＣＲ阻害剤が含まれる細胞溶解物が効率よく精製、濃縮および増幅されうる。
本発明の、単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法、ならびに該方法を行う装置は、例えば、ＤＮＡ試料関連の技術分野に効果的に適用可能である。
本発明の、単一のマイクロチャンバで核酸の濃縮および増幅を行う方法を示す模式図である。 コスモトロピック塩の存在下で、マイクロチャンバの親水性内表面に核酸が結合されることを示す模式図である。 チップの表面積の増大に対するＰＣＲ効率の違いを示すグラフである。 ＰＥＧの濃度の違いに対するＰＣＲ効率の違いを示すグラフである。 ＢＳＡの濃度に対するＰＣＲ効率の違いを示すグラフである。 様々な表面積を有する６種類のチップを示す写真である。 様々な表面積を有するチップに対するＤＮＡ結合効率の違いおよびＰＣＲ効率の違いを示すグラフである。 核酸濃縮によるＰＣＲ効率の上昇を示すグラフである。 大腸菌ＢＬ２１ ｇＤＮＡの標的遺伝子コピー数に対するＣｔ値を示す標準曲線である。 細胞溶解物において、核酸の濃縮および精製によるＰＣＲ効率の上昇を示すグラフである。 大腸菌ＢＬ２１細胞数に対するＣｔ値を示す標準曲線である。
符号の説明
１０ 核酸を含む生物学的試料、
２０ マイクロチャンバ、
３０ リアルタイム検出、
２１０ シリコン基板、
２２０ 水層、
２３０ 核酸。

Claims (18)

  1. 親水性内表面を有するマイクロチャンバに、核酸含有試料とコスモトロピック塩とを含む溶液を導入し、前記マイクロチャンバの内表面に前記核酸を結合させることにより、前記核酸を濃縮する段階と、
    前記マイクロチャンバにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を添加してＰＣＲを行う段階と、
    を含むことを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を単一のマイクロチャンバで連続的に行う方法。
  2. 前記核酸を濃縮する段階が、前記マイクロチャンバの内表面に結合されていない核酸を含む試料を洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリメラーゼ連鎖反応を行う段階は、ポリエチレングリコールおよびウシ血清アルブミンを添加する段階を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ポリエチレングリコールの濃度は、ＰＣＲ混合物の総質量に対して１〜１０質量％であり、前記ウシ血清アルブミンの濃度は、ＰＣＲ混合物の全量に対して０．１〜１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記マイクロチャンバの内表面は、複数個のピラーを有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ピラー間の間隔は、８〜５０μｍであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 前記親水性内表面は、ヒドロキシル基、アミン基、カルボン酸基、ポリカルボン酸基、およびシラノール基からなる群より選択される少なくとも1種の親水性官能基を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記コスモトロピック塩は、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ化物、ギ酸塩、および酢酸塩からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記核酸含有試料と前記コスモトロピック塩とを含む前記溶液は、ｐＨが３〜１０であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記コスモトロピック塩の濃度は、前記核酸含有試料と前記コスモトロピック塩とを含む前記溶液の全量に対して１００〜２，０００ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記核酸含有試料は、血液、血清、小便、唾液、または細胞培養液に存在するバクテリアもしくはウイルスの細胞溶解物であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか1項に記載の方法。
  12. 内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバと、
    前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバに核酸含有試料を供給する核酸含有試料保管部と、
    前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにコスモトロピック塩を供給するコスモトロピック塩溶液保管部と、
    前記マイクロチャンバとマイクロチャンネルを介して相互接続され、前記マイクロチャンバにＰＣＲ混合物を供給するＰＣＲ混合物保管部と、
    前記マイクロチャンバを加熱および冷却する加熱部および冷却部と、
    を備えることを特徴とする、核酸含有試料中の核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置。
  13. 前記マイクロチャンバの内表面は、複数個のピラーを有することを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
  14. 前記ピラー間の間隔は８〜５０μｍであることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
  15. 前記親水性官能基は、ヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、ポリカルボキシル基、およびシラノール基からなる群より選択される少なくとも1種であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
  16. 前記核酸含有試料は、血液、血清、小便、唾液、または細胞培養液に存在するバクテリアもしくはウイルスの細胞溶解物であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の装置。
  17. 内表面に親水性官能基を有するマイクロチャンバを備えるチップと、
    前記チップを含む核酸増幅部と、
    を備えることを特徴とする、核酸の濃縮および増幅を連続的に行う装置。
  18. 請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の装置を備えることを特徴とする、ラボ・オン・チップ。
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