JP7090093B2 - 核酸ハイブリダイゼーションアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456,598号(ESX-032PRV)、2017年2月15日に出願された同第62/459,337号(ESX-033PRV2)、2017年2月9日に出願された同第62/457,084号(ESX-017PRV)、2017年2月15日に出願された同第62/459,267号(ESX-017PRV2)、2017年2月9日に出願された同第62/456,904号(ESX-027PRV)、2017年2月15日に出願された62/459,303号(ESX-027PRV2)、2017年2月9日に出願された同第62/457,075号(ESX-035PRV)、2017年2月16日に出願された同第62/460,052号(ESX-035PRV2)、および2017年2月16日に出願された同第62/460,083号(ESX-035PRV3)の利益を主張し、それらの出願はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特に、本発明は、限定するものではないがアッセイなどの生物学的および化学的アッセイを実施するデバイスおよび方法に関する。
従来の核酸ハイブリダイゼーションアッセイは複雑で、時間がかかり、面倒であり、実験室設備および多量の試料が必要である。例えば、サザンブロットは通常、完了するまでに数時間かかる。さらに、従来の核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、比較的大量の試料(典型的には>100μL)が必要であり、これは試料が限られているかまたは不足している多くの状況では適用できない。したがって、ほんの少しの試料しか必要としない、高速で、正確で、持ち運び可能で、および/または安価である核酸ハイブリダイゼーションアッセイを開発することが望ましい。さらに、専門家でない者がアッセイを実施することができることが望ましい。本発明はこれらの必要性を満たす。
均一な核酸検出アッセイを実施するための方法であって、
(a)第1のプレートおよび第2のプレートを備えるQMAXデバイスを取得するステップであって、
前記第1のプレートおよび前記第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第1のプレートが、その試料接触領域上に、
(i)表面増幅表面と、
(ii)前記増幅表面上に固定されており、前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を含み、
前記第2のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
(c)前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)(c)の後、前記プレートを前記閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取ることにより前記標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、(ii)前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および(iii)前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記表面増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の1つは、前記2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200umである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が200um未満である、閉鎖構成である、方法。
[本発明1002]
均一な試料を分析するためのデバイスであって、
第1のプレート、第2のプレート、および結合部位を備え、
(a)前記第1のプレートおよび前記第2のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
(b)前記第1のプレート上の前記試料接触領域が、
(i)近接依存性信号増幅層と、
(ii)標的核酸の一部に結合する、前記近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を有し、
(c)前記第2のプレート上の前記試料接触領域が、前記標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
前記構成の1つは開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にある閉鎖構成であり、
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および前記近接依存性信号増幅層の増幅率は、前記標的特異的核酸プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。
[本発明1003]
サーマルサイクラーおよび本発明1002のデバイスを備える、装置。
[本発明1004]
サーマルサイクラー、本発明1002のデバイス、およびリアルタイムPCR用の読み取り器を備える、装置。
[本発明1005]
迅速な核酸検出アッセイのための方法であって、
(a)第1のプレートおよび第2のプレートを備えるQMAXデバイスを取得するステップであって、
前記第1のプレートおよび前記第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第1のプレートが、その試料接触領域上に結合部位を含み、前記結合部位が、前記部位上に固定されておりかつ前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブを含み、
前記第2のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
(c)一定期間のインキュベーションのために前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)前記プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたって前記プレートを再度押圧し、次いで前記洗浄スポンジを解放するステップと、
(e)(d)の後、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、(ii)前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および(iii)前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記近接依存性増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の1つは、前記2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200umである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が200um未満である、閉鎖構成である、方法。
[本発明1006]
前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が300秒以下になるように構成されている、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1007]
前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が300秒以下になるように構成されている、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1008]
前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が60秒以下になるように構成されている、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1009]
前記標的核酸が、ゲノムDNA、cfDNA、cDNA、ctDNA、mRNA、およびmiRNAを含む、DNAまたはRNAである、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1010]
ステップ(b)から結果を得るまでの時間が10分未満である、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1011]
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した前記標識の濃度、および前記表面増幅層の増幅率は、前記プローブに直接的または間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく、前記閉鎖構成において可視化されるように構成されている、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1012]
前記近接依存性増幅表面に結合した前記標識が、60秒未満で可視化される、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1013]
前記近接依存性増幅表面に結合した前記標識が、60秒未満で可視化される、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1014]
前記貯蔵部位が、前記閉鎖構成において前記第1のプレート上の前記結合部位のほぼ上方にある、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1015]
前記標的特異的核酸プローブおよび前記標的特異的核酸検出剤が、前記標識を含むサンドイッチを形成する、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1016]
前記信号が、前記増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を除去するための洗浄ステップを使用せずに読み取られる、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1017]
前記増幅表面に結合した前記標識が、個々の結合事象を計数することにより読み取られる、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1018]
前記増幅表面に結合した前記標識が、一括読み取り法によって読み取られる、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1019]
前記アッセイが、0.1nM以下の検出感度を有する、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1020]
前記アッセイが、スポンジを使用して、前記増幅表面に結合していない生体物質または標識を除去することを含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1021]
前記信号増幅層がD2PAを含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1022]
前記信号増幅層が金属材料層を含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1023]
前記信号増幅層が、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られた連続金属フィルムを含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1024]
異なる金属層が、光信号を増強するために、局所的に増強するかもしくは反射体として機能するかまたはその両方である、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1025]
前記信号増幅層が、金属材料層、および前記金属材料層の上部の誘電材料を含み、前記捕捉剤が前記誘電材料上にある、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1026]
前記金属材料層が、均一な金属層、ナノ構造金属層、または組み合わせである、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1027]
プラズモン増強により信号を増幅する、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1028]
アッセイが、ラマン散乱により前記標識を検出することを含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1029]
前記第1のプレートの前記試料接触領域が、前記近接依存性増幅表面を含むが前記標的特異的核酸プローブを含まない部位をさらに含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1030]
前記アッセイが、前記近接依存性増幅表面を含むが前記標的特異的核酸プローブを含まない前記部位を読み取ることによりバックグラウンド信号を計算することを含む、前記本発明のいずれかのデバイス、装置、または方法。
[本発明1031]
前記デバイスが、前記プレートの1つの上に固定されたスペーサーをさらに備え、前記スペーサーが、前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔を調節する、前記本発明のいずれかのデバイスまたは方法。
[本発明1032]
前記表面増幅層の前記増幅率が、前記捕捉剤に直接的または間接的に結合した単一の標識からの前記光信号を可視化するように調整される、前記本発明のいずれかのデバイスまたは方法。
以下の詳細な説明は、限定ではなく例示として本発明のいくつかの実施形態を示す。本明細書で使用される節の見出しおよび任意のサブタイトルは、構成目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するものとして決して解釈するべきではない。節の見出しおよび/またはサブタイトル下の内容は、節の見出しおよび/またはサブタイトルに限定されず、本発明の説明全体に適用される。
生物学的および化学的アッセイ(すなわち、検査)において、アッセイ操作を簡素化するか、またはアッセイ速度を加速するデバイスおよび/もしくは方法は、しばしば非常に価値がある。
これらの実施形態では、基板の上面近くに増幅区域があり、該区域では、基板に結合した標識または基板に非常に近い標識のみが増強された。
(i)基板上の実質的に連続した金属バックプレーンと、
(ii)金属バックプレーンから延びる、またはバックプレーンの穴を通って基板から延びる、1つ以上の誘電体柱または半導体柱と、
(iii)柱上部の金属ディスクであって、ディスクのエッジの少なくとも一部が、間隙によって金属バックプレーンから離れている、金属ディスクと、を含んでもよく、
間隙および金属エッジの一部は、高信号増幅領域の一部であり、金属ディスクは、円形、多角形、ピラミッド形、楕円形、細長い棒形状、またはそれらの任意の組み合わせを有する。金属ディスクは、0.5~30nmの範囲の距離で金属フィルムから離れており、ディスクの平均横寸法は、20nm~250nmの範囲であり、信号増幅層は、円形、多角形、ピラミッド形、楕円形、細長い棒形状、またはそれらの任意の組み合わせからなる形状群から選択された形状を有する1つ以上の金属ディスクを含み、ディスクの平均横寸法は、20nm~250nmの範囲であり、隣接するディスク間の間隙は、0.5~30nmの範囲であり、
金属構造体は、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られる。
柱は周期的もしくは非周期的であり、または金属構造体はランダムな形状を有し、
増幅される信号は、ラマン散乱、色度、ルミネセンス、蛍光、エレクトロルミネセンス、化学ルミネセンス、および/または電気化学ルミネセンスである。
基板(第1のプレート)上の標的分析物(標識を有する)の最終捕捉密度(LoDまたはアッセイ感度に直接関連する)がdcであると定義し、
液体中の標識密度がDLであると定義し、
増幅率がAであると定義し、
増幅率が基板のLA内では均一であると定義し、
液体の高さがX-プレートではLX(LX>>LA)であると定義し、
液体の標識信号強度の標準偏差(sd)がσであると定義し、
捕捉フルオロフォアからの信号は、(1+3×sd)×液体からのバックグラウンド信号より大きくなければならないので、以下である:
Adc≧(1+3σ)(DlLX+ADlLA)。
この方法において検出可能な最小捕捉密度(LoDに比例する)は、以下の通りである:
図2は、本発明のいくつかの実施形態による例示的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの説明図である。
(A).チップの調製:捕捉プローブを基板表面上に固定した。
(B).チップのブロッキング:チップをブロッカーでブロッキングした。
(C).試料の導入:遊離核酸または細胞/粒子に含有される核酸のいずれかの形態の目的の標的を含む生体液(全血、血漿、血清、唾液、尿、汗など)を、基板表面に添加した。
(D)QMAXカードの閉鎖および押圧:マイクロスケール構造側を下に向けたQMAXカードをチップの上部に配置し、押圧した。必要な細胞溶解試薬、タンパク質変性試薬、ハイブリダイゼーション試薬、および標識された検出プローブを、マイクロスケール構造を有するQMAXカードの側面上で乾燥させた;
(E)~(F).細胞または粒子の溶解、標的配列の捕捉および検出:乾燥させた試薬を生体液中に溶解した。必要に応じて、細胞(または粒子)を溶解試薬で溶解して、標的核酸配列を放出させた。次いで、放出されたまたは遊離の標的核酸配列を基板表面上の固定された捕捉プローブによって捕捉し、ハイブリダイゼーションを介して、標識された検出プローブによって検出した。
(G).洗浄:QMAXカードを剥がし、好適な洗浄溶液を含有する吸収材で基板表面を洗浄した。
(H).信号の検出:標識された検出プローブからの信号を検出器によって検出した。
図2(A)に見ることができるように、標的核酸配列の領域に相補的な特定の配列を有するDNAオリゴヌクレオチド(捕捉プローブ)を基板表面上にコーティングした。「捕捉プローブ(1)」と呼ぶDNAオリゴヌクレオチドは、通常10~50bpの長さで、基板へのコーティングを容易にするために3’末端が修飾される。一般に使用される3’末端修飾には、チオール、ジチオール、アミン、ビオチンなどが含まれるが、これらに限定されない。基板は、捕捉プローブの固定化のために使用され、金表面、PMMA、PSなどを含むが、これらに限定されない。基板上にコーティングされる捕捉プローブの密度は、捕捉プローブのアクセス性に非常に重要であり、したがってアッセイの感度に影響を及ぼす。ある用途では、単一の標的核酸配列に特異的である単一タイプの捕捉プローブを基板上に固定化することができる。別の用途では、異なる標的核酸配列または単一の標的核酸配列の異なる領域に特異的である異なるタイプの捕捉プローブを基板上に固定化することができる。コーティングは室温で一晩行うのが理想的であったが、短くすることもできる。コーティング後、PBST緩衝液を使用して、コーティングされていない捕捉プローブを洗い流した。
実施例1:96ウェルプレートを使用した、IR800標識検出プローブにより検出されるMプレート上のTE緩衝液中のmiR21ハイブリダイゼーションアッセイ
アッセイの詳細(図3を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金Mプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●各ウェルに50μLのmiR21標的(TE緩衝液で希釈)を添加し、50μLの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●室温で2時間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とTE緩衝液中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●2時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Mプレート上でのTE緩衝液中の510fM miR21標的のLoDを達成した。
●6桁のダイナミックレンジを達成した。
アッセイの詳細(図5を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金Mプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●各ウェルに50μLのmiR21標的(10%血漿中に混ぜる)を添加し、50μLの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●室温で2時間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度と10%血漿中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●2時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Mプレート上での10%血漿中の820fM miR21標的のLoDを達成した。
●6桁のダイナミックレンジを達成した。
●10%血漿でのアッセイ感度はTE緩衝液と同様であり、これは血漿マトリックスでの干渉が有意でないことを示している。
アッセイの詳細(図7を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金Mプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●各ウェルに50μLのmiR21標的(ニートの全血中に混ぜる)を添加し、50μLの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●室温で2時間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●2時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Mプレート上のニートの全血中の9.7pM miR21標的のLoDを達成した。
●6桁のダイナミックレンジを達成した。
●ニートの全血でのアッセイ感度はTE緩衝液および10%血漿に匹敵し、これは全血のマトリックス中での堅固なアッセイ性能を示している。
アッセイの詳細(図9を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面上に0.5μlの1μM miR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で様々な時間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●miR21ハイブリダイゼーションアッセイにおいてIR800標識検出プローブを使用し、30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧したとき、信号強度は1分間のハイブリダイゼーション時間と比較して2分間のハイブリダイゼーション時間でより高くなる。
●2分後、信号強度は飽和する。
●したがって、IR800標識検出プローブおよび30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用するさらなる核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、2分間のハイブリダイゼーション時間を使用する。
アッセイの詳細(図11を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μLのmiR21標的(TE緩衝液で希釈)を滴下し、0.5μLの1μMビオチン化検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●1μLのストレプトアビジン-40nmビーズ(4%BSAで1:10希釈)を滴下する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で様々な時間待つ。
●チップ表面をDNAウォッシャーで3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用して一括信号測定を行う。
●miR21ハイブリダイゼーションアッセイにおいてIR800標識検出プローブを使用し、30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧したとき、信号強度は1分間のハイブリダイゼーション時間と比較して2分間のハイブリダイゼーション時間でより高くなる。
●信号強度は5分でピークに達した。
●したがって、ストレプトアビジン-40nmビーズおよび30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用したさらなる核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、5分間のハイブリダイゼーション時間を使用する。
アッセイの詳細(図13を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μLのmiR21標的(TE緩衝液で希釈)を滴下し、0.5μLの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とTE緩衝液中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、TE緩衝液中の861pM miR21標的のLoDを達成した。
●3桁のダイナミックレンジを達成した。
アッセイの詳細(図15を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μLのmiR21標的(TE緩衝液で希釈)を滴下し、0.5μLの1μMビオチン化検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●1μLのストレプトアビジン-40nmビーズ(4%BSAで1:10希釈)を滴下する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で5分待つ。
●チップ表面をDNAウォッシャーで3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とTE緩衝液中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、TE緩衝液中の28nM miR21標的のLoDを達成した。
●1桁のダイナミックレンジを達成した。
アッセイの詳細(図17を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の8.41pM miR21標的のLoDを達成した。
●5桁のダイナミックレンジを達成した。
●QMAXカードを使用すると、金薄膜上でほぼ同じ感度(8.41pMと比較して9.7pM)を伴ってアッセイ時間が著しく(2時間~2分間に)短縮される。
アッセイの詳細(図19を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μMビオチン化検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●1μLのストレプトアビジン-40nmビーズ(4%BSAで1:10希釈)を滴下する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で5分待つ。
●チップ表面をDNAウォッシャーで3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●2分間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、ニートの全血中の8.8nM miR21標的のLoDを達成した。
●2桁のダイナミックレンジを達成した。
アッセイの詳細(図21を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μMビオチン化検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●1μLのストレプトアビジン-40nmビーズ(4%BSAで1:10希釈)を滴下する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で5分待つ。
●チップ表面をDNAウォッシャーで3回すすぐ。
●倒立顕微鏡を使用してピクセル化(PIXelated)測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の87pM miR21標的のLoDを達成した
●2桁のダイナミックレンジを達成した。
アッセイの詳細(図23を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μMビオチン化検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●1μLの500ng/mlストレプトアビジン-Cy5を滴下する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間待つ。
●チップ表面をDNAウォッシャーで3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の68pM miR21標的のLoDを達成した
●4桁のダイナミックレンジを達成した。
●ストレプトアビジン-Cy5を検出標識として使用したアッセイ感度(68pM)は、IR800を標識として使用した場合(8.41pM)ほど良好ではない。
アッセイの詳細(図25を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを室温で一晩Mプレート上にコーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の10pM miR21標的のLoDを達成した。
●5桁のダイナミックレンジを達成した。
●再度、QMAXカードを使用すると、金薄膜上でほぼ同じ感度(8.41pMと比較して10pM)を伴ってアッセイ時間が著しく(2時間~2分間に)短縮される。
●しかしながら、Mプレートを使用しても、恐らくMプレートの品質が低いことに起因して、アッセイの感度は改善しなかった。
アッセイの詳細(図27を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブを室温で一晩Mプレート上にコーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●倒立顕微鏡を使用してピクセル化(PIXelated)測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用し、ピクセル化測定法を使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の350fM miR21標的のLoDを達成した。
●ピクセル化法で測定した場合(350fM)、同じアッセイの一括測定法(10pM)よりも感度が約2桁高い。
アッセイの詳細(図29を参照):
●1μMのチオール化捕捉プローブをXウェルに室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●チップ表面に0.5μlのmiR21標的(ニートの全血で希釈)を滴下し、0.5μlの1μM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●PETフィルムで押圧し、室温で2分間ハイブリダイゼーションを行う。
●XウェルをDNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●正規化された信号強度とニートの全血中のmiR21標的の濃度との相関が観察された。
●30μmスペーサーを備えたQMAXカードを使用して、2分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の140fM miR21標的のLoDを達成した。
●PETフィルムで押圧すると、LoDがわずかに改善された(押圧ありではLoD=140pMに対して、押圧なしではLoD=336pM)。
アッセイの詳細(図31および32を参照):
●500nMのチオール化捕捉プローブを金Mプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●PBSTで3回すすぎ、次いで50μM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
●各ウェルに50μLの10nM miR21標的(ニートの全血で希釈)を添加し、50μLの100nM IR800標識検出プローブ(H7140ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈)と混合する。
●室温で2時間ハイブリダイゼーションを行う。
●MプレートをDNAウォッシャー(1×SSC+0.05% Tween20)で3回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
●完全に一致したmiR21標的は、検査した全てのミスマッチ標的の中で最高の信号強度をもたらした。
●ミスマッチ塩基対の信号強度への影響は場所に依存する。
●ハイブリダイゼーション領域の中心に位置するミスマッチ塩基対は、ハイブリダイゼーション領域の末端にあるミスマッチ塩基対よりも顕著な影響を与える。
●ハイブリダイゼーション領域の末端に単一のミスマッチ塩基対を導入しただけでも、信号強度が約3倍減少した。
A1.核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用のデバイスであって、
第1のプレート、第2のプレート、およびスペーサーを備え、
i.プレートは、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、
ii.各プレートはそれぞれ、核酸分析物を含む試料と接触するための試料接触領域を有する内側面を含み、
iii.スペーサーは、所定の実質的に均一な高さを有し、
iv.第1のプレートは、第1のプレートの内側面上にコーティングされた核酸捕捉プローブを含み、
v.第2のプレートは、第2のプレートの内側面上にコーティングされた核酸検出プローブを含み、
構成の1つは、2つのプレートが部分的または完全に分離され、プレート間の間隔がスペーサーによって調節されてなく、試料がプレートの一方または両方の上に置かれる、開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、開放構成で試料を置いた後に構成される閉鎖構成であり、閉鎖構成では、少なくとも1つのスペーサーが2つのプレートの間にあり、置かれた試料の少なくとも一部が、プレートによって圧縮されて非常に均一な厚さの層となり、かつプレートに対して実質的に動かず、層の均一な厚さが、2つのプレートの内側面によって制限され、かつプレートおよびスペーサーによって調節され、
捕捉プローブは、分析物の一部に相補的に結合し、分析物を第1のプレートの内側面に固定するように構成され、
検出プローブは、均一な厚さの層へと拡散して、分析物の別の部分に相補的に結合し、検出可能な信号を生成するように構成されている、デバイス。
(a)核酸分析物を含む液体試料を取得することと、
(b)A1~A12の項目のいずれかのデバイスを取得することと、
(c)プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くことと、
(d)(c)の後、2つのプレートを合わせ、プレートを押圧して閉鎖構成にすることと、
(e)均一な厚さの層からの信号を検出および測定し、それによって核酸分析物の存在および/または量を決定することと、を含む、方法。
本発明は、様々な実施形態を含み、これらは、様々な構成要素が互いに矛盾しない限り、複数の様式で組み合わせることができる。実施形態は、別個独立としてではなく、単一の発明出願とみなされるべきであり、各出願は、参照として他の出願を有し、また、あらゆる目的のためにその全体が参照される。これらの実施形態は、本出願の開示だけでなく、本明細書において参照され、組み込まれ、または優先権が主張される文書も含む。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法を説明するために使用される用語は、本出願、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に定義されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカード、スペーサー、および均一な試料の厚さの実施形態を含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、試料の少なくとも一部を均一性の高い層にするのに役立つスペーサーを備える。スペーサーの構造、材料、機能、バリエーション、および寸法、ならびにスペーサーおよび試料層の均一性は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、Qカードの操作および試料の測定を容易にするのに役立つヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダー(slider)を備える。ヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーの構造、材料、機能、バリエーション、寸法は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、カードがスマートフォン検出システムによって読み取られることを可能にするスライダーとともに使用される。Qカード、スライダー、およびスマートフォン検出システムの構造、材料、機能、バリエーション、寸法、および接続は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々なタイプの検出方法を含むか、または使用することができる。検出方法は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、分析物検出に使用される様々なタイプの標識を使用することができる。標識は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な種類の分析物(バイオマーカーを含む)の操作および検出に適用することができる。分析物は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な用途(分野および試料)に使用することができる。用途は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、データ転送、ストレージ、および/または分析のためのクラウド技術を使用することができる。関連するクラウド技術は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/426065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の実施形態では、スペーサーは、1つのプレート上に固定された平らな上部および足部を有する柱であり、平らな上部は、微小な表面変動を伴う平滑性(smoothness)を有し、変動は5未満、10nm未満、20nm未満、30nm未満、50nm未満、100nm未満、200nm未満、300nm未満、400nm未満、500nm未満、600nm未満、700nm未満、800nm未満、1000nm未満、またはいずれかの2つの値の間の範囲である。好ましい平らな柱上部の滑らかさは、50nm以下の表面変動である。
本発明の特定の実施形態では、スペーサーは側壁角を有する柱である。いくつかの実施形態では、側壁角は、5度未満(表面の垂直線から測定される)、10度未満、20度未満、30度未満、40度未満、50度未満、70度未満、またはいずれかの2つの値の間の範囲内である。好ましい実施形態では、側壁角は、5度未満、10度未満、または20度未満である。
本発明の特定の実施形態では、厳密でない力による押圧を使用することにより、均一な流体試料薄層が形成される。詳細を加えることなく、次いで、厳密でない押圧力の定義を加える、「厳密でない押圧力」という用語。本明細書で使用される場合、力との関連における「厳密でない」という用語(例えば「厳密でない押圧力」)は、(a)力が加えられた時点において正確には分かっていないか、または正確に予測できない大きさを有し、(b)0.01kg/cm2(センチメートル平方)~100kg/cm2の範囲の圧力を有し、(c)力が加えられるごとに大きさが変動し、および(d)(a)および(c)の力の非厳密さ(すなわち変動)が、実際に加えられる力の合計の少なくとも20%である、力を指す。
「スペーサー充填率」または「充填率」という用語は、総プレート面積に対するスペーサー接触面積の比を指し、ここで、スペーサー接触面積は、閉鎖構成においてスペーサーの上面がプレートの内側面と接触する接触面積を指し、総プレート面積は、スペーサーの平らな上部が接触するプレートの内側面の総面積を指す。2つのプレートがあり、各スペーサーは1つのプレートにそれぞれ接触する2つの接触面を有するので、充填率は最小の充填率である。
本開示による本発明対象のさらなる例は、以下の列挙された段落に記載されている。
以下の詳細な説明は、限定ではなく例示として本発明のいくつかの実施形態を示す。本明細書で使用される節の見出しおよび任意のサブタイトルは、構成目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するものとして決して解釈するべきではない。節の見出しおよび/またはサブタイトル下の内容は、節の見出しおよび/またはサブタイトルに限定されず、本発明の説明全体に適用される。
図1は、配列決定のための核酸を捕捉するために使用することができるQMAX(Q:定量化、M:増大、A:試薬の添加、X:加速;圧縮調節オープンフロー(CROF)としても既知である)デバイスの例示的な実施形態の概略図である。図1において、QMAXデバイスは開放構成である。(a)QMAXは、第1のプレート、第2のプレート、および第2のプレート上のウェルを備える。(b)第1のプレート上のウェルアレイの上面図。(c)第2のプレート上の柱状アレイの上面図。
第1のプレート、第2のプレート、およびウェルを備え、
(a)第1のプレートおよび第2のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する流体試料と接触するための試料接触領域を有し、
(b)第2のプレートが、試料接触領域において複数のウェルを有し、各ウェルは、(i)50μm以下のウェル深さ、(ii)試料の体積よりも実質的に小さいウェル体積、(iii)結合部位であって、捕捉プローブがその部位に固定されており、かつ捕捉プローブが標的プローブを捕捉する、結合部位を有し、
構成の1つは、第1のプレートの内側面と第2のプレートのウェルの縁(rim)との間の平均間隔が少なくとも300μmであり、試料がプレートの一方または両方の上に置かれる、開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、開放構成において試料が置かれた後の構成である閉鎖構成であり、閉鎖構成では、試料の少なくとも一部がウェル内側にあり、第1のプレートの内側面と第2のプレートのウェルの縁との間の平均間隔が開放構成での平均間隔の1/10(10分の1)未満である、QMAXデバイス。
例えば、第1のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が1μLの体積で1fMである場合、600の1~2倍、2~5倍、5~10倍、10~100倍、100~1000倍、1000~10000倍である。
例えば、第1のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が1uLの体積で1pMである場合、600,000の1~2倍、2~5倍、5~10倍、10~100倍、100~1000倍、1000~10000倍である。
例えば、第1のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が1uLの体積で1nMである場合、600,000,000の1~2倍、2~5倍、5~10倍、10~100倍、100~1000倍、1000~10000倍である。
いくつかの実施形態では、ウェル数は、核酸捕捉ステップの後に、ウェルの大部分がただ1つの標的核酸プローブを捕捉することを達成するような様式である。
図37は、QMAXデバイスを使用した、核酸配列決定における核酸プローブ捕捉ステップを実施するための例示的プロセスの基本的ステップを示すフローチャートである。
(a)捕捉プローブをコーティングすることにより、第1のプレートを調製することと、
(b)請求項1に記載のデバイスを取得することと、
(c)標的核酸を含有する試料を取得することと、
(d)プレートが開放構成で構成されているときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くことであって、第1のプレートの内側面と第2のプレートのウェルの縁との間の平均間隔は少なくとも300umである、置くことと、
(e)(d)の後、請求項1に記載のデバイスの2つのプレートを閉鎖構成へと移動させることであって、試料の少なくとも一部がウェル内部にあり、第1のプレートの内側面と第2のプレートのウェルの縁との間の平均間隔が開放構成における平均間隔の1/10(10分の1)未満である、移動させることと、
(f)第2のプレートを剥がし、第1のプレートを洗浄することと、
(g)その後、核酸配列決定ステップを行うこと、を含む、方法。
図38は、核酸配列決定のための第1のプレートの調製ステップの例を示している。
次いで、第1のプレートをPBSTで3回すすぎ、次いで50uM MCHで30分間ブロッキングし、次いでPBSTで3回すすいだ。
図39は、標的核酸を捕捉するための閉鎖構成のQMAXデバイスの例示的実施形態の概略図である。
いくつかの実施形態では、標的プローブは、結合プローブの以下の測定および評価を容易にするために標識に結合される。標識は、該標識が上記捕捉剤への結合前または結合後のいずれかで、直接的または間接的に、発光標識または光学的に検出可能な標識である。標識は、ラマン散乱、色度、ルミネセンス、蛍光、エレクトロルミネセンス、ケミルミネセンス、および/または電気化学ルミネセンスの信号を伴った標識である。本明細書で使用される場合、「発光標識」という用語は、外部励起下のときに発光することができる標識を指す。これはルミネセンスであり得る。蛍光標識(色素分子または量子ドットを含む)、およびルミネセンス標識(例えば、エレクトロルミネセンスまたはケミルミネセンス標識)は、発光標識の類型である。外部励起は、蛍光では光(光子)、エレクトロルミネセンスでは電流、ケミルミネセンスでは化学反応である。外部励起は、上記の組み合わせにすることができる。「標識分析物」という語句は、標識の存在を評価することによって分析物を検出することができるように、発光標識で検出可能に標識された分析物を指す。標識分析物は直接的に標識されてもよく(すなわち、分析物自体は、例えば強い結合、例えば共有結合または非共有結合を介して、標識に直接結合されてもよい)、または標識分析物は間接的に標識されてもよい(すなわち、分析物は、直接的に標識された二次捕捉剤によって結合される)。
DNAウォッシャー(5×SSC+0.05% Tween20)を含有するスポンジで第1のプレートを3回すすぐ。
第1のプレートは、以下の核酸配列決定ステップの準備がされている。
図40は、(a)1pM濃度の1μLの標的核酸試料を使用したQMAX、(b)10fM濃度の100uLの核酸試料を使用した通常の96マイクロウェルプレート、(c)1pM濃度の100uLの標的核酸試料を使用した通常の96マイクロウェルプレートでの標的DNAを捕捉するための代表的な時間経過研究を示している。x軸は、インキュベーション時間である。y軸は、捕捉された核酸に結合したIR-800色素からの蛍光信号である。実験プロセスは図37のフローチャートに従う。
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、100nm、1um、5um、10um、20um、50um、500um、1mmまたはいずれかの2つの値の間の範囲、および500nm~1um、1um~10μmまたは10um~30um、30um~50umの好ましい範囲の高さを有することができる。
均一な核酸検出アッセイを実施するための方法であって、
(a)第1のプレートおよび第2のプレートを備えるQMAXデバイスを取得するステップであって、
第1のプレートおよび第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
第1のプレートが、その試料接触領域上に、
(i)表面増幅表面と、
(ii)該増幅表面上に固定されており、標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を含み、
第2のプレートが、標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くステップと、
(c)プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)(c)の後、プレートを閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで試料接触領域を読み取ることにより標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)閉鎖構成での試料の厚さ、(ii)閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および(iii)近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して核酸プローブに間接的に結合している標識が、表面増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
構成の1つは、2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200umである開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が2つのプレートの間にあり、かつプレートの内側面の間の平均間隔が200um未満である、閉鎖構成である、方法。
第1のプレート、第2のプレート、および結合部位を備え、
(a)第1のプレートおよび第2のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
(b)第1のプレート上の試料接触領域が、
(i)近接依存性信号増幅層と、
(ii)標的核酸の一部に結合する、近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を有し、
(c)第2のプレート上の試料接触領域が、標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
構成の1つは開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が2つのプレートの間にある閉鎖構成であり、
閉鎖構成での試料の厚さ、閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および近接依存性信号増幅層の増幅率は、標的特異的核酸プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。
(a)第1のプレートおよび第2のプレートを備えるQMAXデバイスを取得するステップであって、
第1のプレートおよび第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
第1のプレートが、その試料接触領域上に結合部位を含み、結合部位が、該部位上に固定されておりかつ標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブを含み、
第2のプレートが、標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くステップと、
(c)一定期間のインキュベーションのためにプレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたってプレートを再度押圧し、次いで洗浄スポンジを解放するステップと、
(e)(d)の後、読み取りデバイスで試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)閉鎖構成での試料の厚さ、(ii)閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および(iii)近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して核酸プローブに間接的に結合している標識が、近接依存性増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
構成の1つは、2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200umである開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が2つのプレートの間にあり、かつプレートの内側面の間の平均間隔が200um未満である、閉鎖構成である、方法。
本発明は、様々な実施形態を含み、これらは、様々な構成要素が互いに矛盾しない限り、複数の様式で組み合わせることができる。実施形態は、別個独立としてではなく、単一の発明出願とみなされるべきであり、各出願は、参照として他の出願を有し、また、あらゆる目的のためにその全体が参照される。これらの実施形態は、本出願の開示だけでなく、本明細書において参照され、組み込まれ、または優先権が主張される文書も含む。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法を説明するために使用される用語は、本出願、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に定義されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカード、スペーサー、および均一な試料の厚さの実施形態を含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、試料の少なくとも一部を均一性の高い層にするのに役立つスペーサーを備える。スペーサーの構造、材料、機能、バリエーション、および寸法、ならびにスペーサーおよび試料層の均一性は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、Qカードの操作および試料の測定を容易にするのに役立つヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーを備える。ヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーの構造、材料、機能、バリエーション、寸法は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにQカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Qカードは、カードがスマートフォン検出システムによって読み取られることを可能にするスライダー(slider)とともに使用される。Qカード、スライダー、およびスマートフォン検出システムの構造、材料、機能、バリエーション、寸法、および接続は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々なタイプの検出方法を含むか、または使用することができる。検出方法は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、分析物検出に使用される様々なタイプの標識、捕捉剤、および検出剤を使用することができる。標識は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な種類の分析物(バイオマーカーを含む)の操作および検出に適用することができる。分析物は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な用途(分野および試料)に使用することができる。用途は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、データ転送、ストレージ、および/または分析のためにクラウド技術を使用することができる。関連するクラウド技術は、本明細書に開示されているか、または2016年8月10日および2016年9月14日にそれぞれ出願されたPCT出願(米国を指定)第PCT/US2016/045437号および第PCT/US0216/051775号、2017年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/456065号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456287号、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456504号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示による本発明対象のさらなる例は、以下の列挙された段落に記載されている。
Claims (18)
- 均一な核酸検出アッセイを実施するための方法であって、
(a)互いに対して移動可能である第1のプレートおよび第2のプレートを備える、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのためのデバイスを取得するステップであって、
前記第1のプレートおよび前記第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第1のプレートが、その試料接触領域上に、
(i)近接依存性信号増幅層と、
(ii)前記近接依存性信号増幅層上に固定されており、前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸捕捉プローブと
を含む結合部位を含み、
前記第2のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
(c)前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)(c)の後、前記プレートを前記閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取ることにより前記標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、(ii)前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および(iii)前記近接依存性信号増幅層の増幅率は、標的核酸を介して前記標的特異的核酸捕捉プローブに間接的に結合している標識が、前記近接依存性信号増幅層に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記開放構成は、前記2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200μmである構成であり、
前記閉鎖構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が200μm未満である構成である、方法。 - 均一な試料を分析するためのデバイスであって、
第1のプレート、第2のプレート、および結合部位を備え、
(a)前記第1のプレートおよび前記第2のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
(b)前記第1のプレート上の前記試料接触領域が、
(i)近接依存性信号増幅層と、
(ii)標的核酸の一部に結合する、前記近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸捕捉プローブと
を含む結合部位を有し、
(c)前記第2のプレート上の前記試料接触領域が、前記標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
前記構成の1つは開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が200μm未満である、閉鎖構成であり、
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および前記近接依存性信号増幅層の増幅率は、前記標的特異的核酸捕捉プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。 - サーマルサイクラーおよび請求項2に記載のデバイスを備える、装置。
- サーマルサイクラー、請求項2に記載のデバイス、およびリアルタイムPCR用の読み取り器を備える、装置。
- 迅速な核酸検出アッセイのための方法であって、
(a)互いに対して移動可能である第1のプレートおよび第2のプレートを備える、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのためのデバイスを取得するステップであって、
前記第1のプレートおよび前記第2のプレートがそれぞれ、1つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第1のプレートが、その試料接触領域上に、
(i)近接依存性信号増幅層と、
(ii)前記近接性信号増幅層上に固定されており、前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸捕捉プローブと
を含む結合部位を含み、
前記第2のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
(b)前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
(c)一定期間のインキュベーションのために前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
(d)前記プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたって前記プレートを再度押圧し、次いで前記洗浄スポンジを解放するステップと、
(e)(d)の後、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
(i)前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、(ii)前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および(iii)近接依存性信号増幅層の増幅率は、標的核酸を介して前記標的特異的核酸捕捉プローブに間接的に結合している標識が、前記近接依存性信号増幅層に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記開放構成は、前記2つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも200μmである構成であり、
前記閉鎖構成は、前記試料の少なくとも一部が前記2つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が200μm未満である構成である、方法。 - 前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的特異的核酸捕捉プローブへの飽和結合時間が300秒以下になるように構成されている、請求項1または5に記載の方法。
- 前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的特異的核酸捕捉プローブへの飽和結合時間が300秒以下になるように構成されている、請求項2に記載のデバイス。
- 前記閉鎖構成における前記第1のプレートと前記第2のプレートとの間の間隔が、前記標的特異的核酸捕捉プローブへの飽和結合時間が300秒以下になるように構成されている、請求項3または4に記載の装置。
- 前記近接依存性信号増幅層の増幅率が、前記標的特異的核酸捕捉プローブに直接または間接的に結合された単一の標識からの光信号を可視化するように調整される、請求項1または5に記載の方法。
- 前記標識が、前記標的特異的核酸捕捉プローブへの結合前または結合後のいずれかで、直接的または間接的に、発光標識または光学的に検出可能な標識である、請求項1または5記載の方法。
- 前記標的特異的核酸捕捉プローブおよび前記標的特異的核酸検出剤が、前記標識を含むサンドイッチを形成する、請求項1または5に記載の方法。
- 前記標識が前記標的核酸に直接結合している、請求項1または5に記載の方法。
- 前記標識が、前記標的特異的核酸捕捉プローブへの結合前または結合後のいずれかで、直接的または間接的に、発光標識または光学的に検出可能な標識である、請求項2に記載のデバイス。
- 前記標的特異的核酸捕捉プローブおよび前記標的特異的核酸検出剤が、前記標識を含むサンドイッチを形成する、請求項2に記載のデバイス。
- 前記標識が前記標的核酸に直接結合している、請求項2に記載のデバイス。
- 前記近接依存性信号増幅層の増幅率が、前記標的特異的核酸捕捉プローブに直接的または間接的に結合された単一の標識からの光信号を可視化するように調整される、請求項2に記載のデバイス。
- 30μm以下の高さを有するスペーサーをさらに含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記デバイスが、30μm以下の高さを有するスペーサーをさらに含む、請求項1または5に記載の方法。
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