CN101078024A - 在单个微室中浓缩和扩增核酸的方法和仪器 - Google Patents

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Abstract

提供在单个微室中顺序进行核酸的浓缩和扩增的方法，该方法包括：向具有亲水性表面的微室中加入含核酸的样品和含亲液盐的溶液，从而通过将核酸结合在微室表面上来浓缩核酸；和通过向微室中添加PCR混合物而实施聚合酶链式反应(PCR)。由于核酸可逆地结合在微室表面，因而与发生不可逆结合的氧化铝的表面相比，PCR产率更高。此外，所有的工艺都在单个微室中顺序进行，从而可以减少样品和消耗品的量，可以减少处理和分析中耗费的时间和劳动，由于通过排除运输样品的过程而无样品损失，因而可以提高检测灵敏度，并且能够显著地减小交叉污染的危险。因此，建立用于浓缩和扩增核酸的完整的自动化系统是容易的。

Description

在单个微室中浓缩和扩增核酸的方法和仪器
技术领域
本发明涉及在单个微室(micro chamber)中浓缩和扩增核酸的方法和仪器。
背景技术
在分子生物学中，高纯度双链质粒DNAs、单链噬菌体DNAs、染色体DNAs、以及琼脂糖凝胶纯化的DNA片段的生产是非常重要的。纯化DNAs的理想方法应当简单快速，并且几乎不包括额外的样品操作。用这种方法获得的DNAs可以用于直接转化、限制酶分析、连接或测序。这样的方法在DNA样品的自动化生产中非常有吸引力，其在实验室研究和诊断中很受欢迎。
传统上，用固相纯化核酸的方法是已知的。例如，美国专利5,234,809披露了用结合核酸的固相纯化核酸的方法，该方法包括：混合原料、离液(chaotropic)材料、和结合核酸的固相；从液体中将结合有核酸的固相分离并冲洗固相核酸复合物。然而，该方法是费时且复杂的，因此不适合于芯片实验室(Lab-On-a-Chip，LOC)。同时，该方法存在问题，因为需要用离液材料。
美国专利6,291,166披露了用固相基质获取核酸的方法。由于核酸不可逆地结合于固相基质，因而存储后对核酸固相基质复合物的延迟分析或重复分析是可能的，因此该方法具有优势。然而，根据该方法，具有正电荷表面的矾土(Al2O3)需要用碱性材料如NaOH亲水性化处理，核酸不可逆地结合于亲水性化处理的矾土，因此不能从矾土分离。因此，所述方法存在的问题是，在不可逆结合有DNA的固相基质中，聚合酶链式反应(PCR)产率低。
美国专利6,383,783公开了从样品分离核酸的方法，所述方法包括：向疏水性有机聚合物固相加入包含目标核酸的样品，以将目标核酸附着于固相；和将非离子表面活性剂添加到固相并去除附着的目标核酸。然而，尽管在常规方法中使用疏水性固相分离核酸，但在本发明中核酸的浓缩和扩增是利用具有亲水性表面的固相和亲液(kosmotropic)盐在单个微室中顺序进行的。
本发明的发明人研究了基于上述现有技术的浓缩和扩增核酸的方法，并确认了核酸的浓缩和扩增在单个微室中顺序进行，以便通过向其表面上具有亲水性官能团的微室添加亲液盐，在微室中浓缩核酸，并且用浓缩的核酸在微室中实施PCR。
发明内容
本发明提供在单个微室中顺序进行核酸浓缩和扩增的方法，其可以最小化样品损失、时间和成本。
本发明还提供顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：在其表面上具有亲水性官能团的微室；存储亲液盐溶液的部件；存储聚合酶链式反应(PCR)混合物的部件；以及加热部件和冷却部件。
本发明还提供用于顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：包括在其表面上具有亲水性官能团的微室的芯片；和在其上装配了所述芯片的核酸扩增部件。
本发明还提供包括浓缩和扩增核酸的仪器的芯片实验室(lab-on-a-chip)。
附图说明
通过参考附图详细描述其示例性实施方案，本发明上述以及其他特征和优势将更为明显，其中：
图1为图解如何根据本发明的实施方案在单个微室中实施核酸的浓缩和扩增的视图；
图2为图解根据本发明的实施方案，在亲液盐的存在下，如何将核酸结合在微室的亲水性表面上的视图；
图3为显示根据本发明的实施方案，相应于芯片表面积的增加的聚合酶链式反应(PCR)效率的图表；
图4图示两个图表，这两个图表显示根据本发明的实施方案，相对于PEG浓度的PCR效率；
图5图示两个图表，这两个图表显示根据本发明的实施方案，相对于BSA浓度的PCR效率。
图6图示根据本发明的实施方案，代表具有不同表面积的六种芯片的照片。
图7为显示根据本发明的实施方案，不同表面积的六种芯片的DNA结合效率和PCR效率的图表。
图8为显示根据本发明的实施方案，相应于核酸浓度的PCR效率提高的图表。
图9为标准曲线，其显示相应于大肠杆菌(E.coli)BL21 gDNA的目标基因拷贝数的Ct值。浓缩核酸后，在标准曲线上为所测试芯片(芯片#2和芯片#6)的Ct值指定相应位置。
图10为显示根据本发明的实施方案，相应于来自细胞溶解产物的核酸的浓缩和纯化的PCR效率增加的图表。
图11为标准曲线，其显示相应于E.coli BL21细胞数目的Ct值。浓缩核酸后，在标准曲线上为所测试芯片(芯片#2)的Ct值指定相应位置。
具体实施方式
现在将参考附图更为充分地描述本发明，附图中显示本发明的示例性实施方案。
根据本发明的实施方案，提供在单个微室中顺序进行核酸的浓缩和扩增的方法，所述方法包括：向具有亲水性表面的微室中加入含核酸的样品和含亲液盐的溶液，以通过将核酸结合在微室的表面上而浓缩核酸；和通过向所述微室添加PCR混合物来实施PCR。
本发明涉及在单个微室中制备用于核酸分析的样品和实施实时PCR的技术。为扩增和检测目标基因，必须从生物样品分离和纯化DNA。通过纯化步骤去除存在于细胞溶解产物中且抑制PCR的多种杂质。在常规方法中，在单独的微室中纯化、扩增和检测特定基因，因此在基因分析中耗费了大量时间和成本，并且样品交叉污染的可能性很高。在本发明中，核酸纯化/浓缩和核酸扩增是集成化的，因此简化了分析过程，并且减小了交叉污染的风险。
图1为图解如何根据本发明的实施方案在单个微室中实施核酸的浓缩和扩增的视图。在单个微室中从包含核酸的生物样品纯化和浓缩目标基因，然后所纯化和浓缩的目标基因在微室中扩增，从而进行实时检测。然而，这必须满足几个要求。首先，用于DNA纯化和浓缩的试剂不应影响实时聚合酶链式反应(PCR)，因此不能使用PCR抑制剂如离液盐和乙醇。第二，PCR必须在具有大的表面积的SiO2芯片中进行，而SiO2的表面起到PCR抑制剂的作用，因此需要添加适当的添加剂以减少PCR抑制。第三，所述SiO2芯片必须具有高的DNA结合效率。
为解决这些问题，用亲液盐代替传统上用于纯化核酸的离液盐。使用离液盐时，微室表面脱水，核酸通过氢键直接结合到微室，因此核酸的结合受pH的影响，并且离液盐起到PCR抑制剂的作用。相反，使用亲液盐时，微室的表面是水合的，因此在微室的表面上形成稳定的水层。核酸可以通过亲水性相互作用的盐析效应在微室的表面上被水合。图2为图解根据本发明的实施方案，在亲液盐的存在下，如何将核酸结合在微室的亲水性表面上的视图。由图2可以看到，由于亲液盐的盐析效应，硅石底物(图2的左边部分)通过氢键与水结合，所形成的水层(图2的中间部分)再次与核酸(图2的右边部分)形成氢键，因此核酸借助稳定的水层结合于微室。因此，核酸与微室结合不需要传统上核酸结合所需的酸性条件，并且微室的表面不必限于硅石。
在根据本发明实施方案的核酸浓缩中，当加入包含核酸的样品和包含亲液盐的溶液时，由于亲液盐的盐析效应，水在微室的表面形成氢键，然后所形成的水层再次与核酸形成氢键，结果，核酸结合于微室的表面。核酸结合在微室表面之后，通过洗去除核酸外的未结合于微室的其它成分，可以将核酸纯化和浓缩为更纯的形式。核酸结合于微室时所使用的溶液可以用作冲洗液，所述冲洗液的浓度低于核酸结合于微室时所使用的亲液盐的浓度。
在根据本发明当前实施方案的扩增核酸的方法中，将PCR混合物添加到在其中浓缩核酸的微室中，然后使用结合到微室表面的或者从微室表面分离的目标核酸实施PCR。本领域技术人员将会理解，PCR混合物的组成和浓度将根据所加入的聚合酶而变化。此外，可以依据所要扩增的PCR产物的长度、模板与引物之间的序列同源性、引物的长度等适当地选择PCR条件。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，可以在PCR方法中添加聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)。SiO2的表面在具有大的表面积的微室中起到PCR抑制剂的作用，因此需要添加适当的添加剂以减小抑制。因此，在本发明的实施方案中，通过添加聚乙二醇(PEG)和牛血清白蛋白(BSA)来提高PCR扩增效率。聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)的浓度可以分别为1-10体积％和0.1-10mg/ml。PEG和BSA的浓度超出这些范围时，PCR扩增效率降低。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，微室的表面可以具有许多柱状物。为了增加包含核酸的样品与微室接触的机会，微室的表面优选具有柱状结构而非平面结构，所述柱状结构具有大的表面积。所述柱状物可以具有不同的形状，如正方形、矩形、菱形、圆柱状、圆锥状、六边形、八边形等。柱状物之间的间距可以为8～50μm。柱状物之间的间距超出此范围时，核酸的结合和扩增效率降低。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，微室的亲水性官能团可以是任何的亲水性基团如羟基、胺基、羧基、多羧基(polycarboxyl)、硅烷醇基等等。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，亲液盐可以为硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)、乙酸盐(CH3COO-)等等，但不限于这些。亲液盐诱导蛋白质结晶，作为疏水粒子的盐析离子，形成按照霍夫迈斯特序(Hofmeister series)的水的结构。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，含核酸的样品和含亲液盐的溶液可以具有3-10的pH。包括含核酸样品的溶液和含亲液盐溶液的溶液的pH超出此范围时，DNA可能会物理和化学变性，并且影响随后的进程。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，亲液盐的浓度可以为100～2,000mM。亲液盐的浓度小于100mM时，结合于微室的核酸的结合效率降低。亲液盐的浓度大于2,000mM时，很难制备所述溶液。
在根据本发明当前实施方案的浓缩和扩增核酸的方法中，含核酸的样品可以为血液、血清、尿、唾液或存在于细胞培养物液体中的细菌的细胞溶解产物，但不限于这些。根据本发明实施方案的含核酸样品可以来自哺乳动物、植物、细菌、或酵母。样品可以为单细胞形式或组织形式，所述细胞或组织可以源于体外培养物。
根据本发明的另一实施方案，提供用于顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：在其表面上具有亲水性官能团的微室；通过微通道与微室互连的存储含核酸样品的部件，其为微室提供含核酸样品；通过微通道与微室互连的存储亲液盐溶液的部件，其为微室提供亲液盐；通过微通道与微室互连的存储PCR混合物的部件，其为微室提供PCR混合物；加热和冷却微室的加热部件和冷却部件。
根据本发明当前实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器基本上包括在其表面上具有亲水性官能团的微室，存储含核酸样品的部件，存储亲液盐溶液的部件，存储PCR混合物的部件以及加热部件和冷却部件。在根据本发明当前实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器中，所述微室包括芯片中的微室，并且在其表面上具有亲水性官能团，其因此与水一起形成氢键，从而构成水层。所形成的稳定水层与核酸结合。所述亲水性官能团可以为任何亲水性基团如羟基、胺基、羧基、多羧基、硅烷醇基等等。
所述存储含核酸样品的部件是为微室提供含核酸样品、且通过微通道与微室互连的部件。
存储亲液盐溶液的部件是为微室提供亲液盐、且通过微通道与微室互连的部件。当把要分离的含核酸样品加入到仪器中时，存储亲液盐溶液的部件为微室提供亲液盐，含核酸样品和亲液盐在仪器中混合，并且，由于亲液盐的盐析效应，核酸结合于微室。
存储PCR混合物的部件是为微室提供PCR混合物、且通过微通道与微室互连的部件。核酸在微室中浓缩后，存储PCR混合物的部件将PCR混合物注入到微室中以实施PCR。
加热部件和冷却部件是加热和冷却微室的部件，当把PCR混合物加入到微室中时，加热部件和冷却部件通过根据PCR条件加热和冷却来控制微室的温度。
在根据本发明当前实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器中，微室的表面可以具有许多柱状物。为了增加含核酸样品与微室接触的机会，微室的表面优选具有柱状结构而非平面结构，所述柱状结构具有大的表面积。所述柱状物可以有多种形状，如正方形、矩形、菱形、圆柱状、圆锥状、六边形、八边形等。柱状物之间的间距可以为8～50μm。柱状物之间的间距超出此范围时，核酸的结合和扩增效率降低。
在根据本发明当前实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器中，含核酸的样品可以为血液、血清、尿、唾液或存在于细胞培养物液体中的细菌的细胞溶解产物，但不限于这些。根据本发明实施方案的含核酸的样品可以来自哺乳动物、植物、细菌、或酵母。样品可以为单细胞形式或组织形式，所述细胞或组织可以源于体外培养物。
根据本发明的另一实施方案，提供用于顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：包括在其表面上具有亲水性官能团的微室的芯片；和在其上装配了所述芯片的核酸扩增部件。根据本发明当前实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器包括芯片和核酸扩增部件，所述芯片包括在其表面上具有亲水性官能团的微室，且所述芯片包括单个微室。所述微室在其表面上具有亲水性官能团，因此，当把含核酸的样品和包含亲液盐的溶液加入到微室中时，核酸结合在微室的表面上，核酸被浓缩。核酸扩增部件包括位于其上的芯片，并且在芯片的微室中扩增浓缩的核酸。将所述芯片置于微室中，所述芯片包括在其中浓缩核酸的微室，并且将PCR混合物加入到微室中，然后实施PCR以扩增浓缩的核酸。
根据本发明的另一实施方案，提供包括用于浓缩和扩增核酸的仪器的芯片实验室。在根据本发明实施方案的用于浓缩和扩增核酸的仪器中，每种功能组件都可以通过利用已知的微流体技术和MEMS装置的芯片方法(process-on-a-chip)而工作，并且可以通过芯片实验室进一步工作。
以下将参考下述的实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅仅用于说明性目的，而不是意味着限制本发明的范围。
实施例1：依据芯片表面积增加的PCR效率
依据芯片表面积的增加测定了PCR效率。用TMC1000(Samsung)仪器实施了PCR。TMC1000是在基于硅的芯片上实施定量PCR的仪器。除非另有说明，所有实施例中使用的模板DNA都是E.cloli BL21的基因组DNA，每个反应使用1.4×105个拷贝。一个拷贝基因组DNA具有七个目标核酸(16s-rRNA基因)，因此每个反应共计包括106个目标基因拷贝。正向引物(YCCAKACTCCTACGGGAGGC；SEQ ID NO ：1)和反向引物(GTATTACCGCRRCTGCTGGCAC；SEQ ID NO：2)用作PCR引物。
除非另有说明，PCR混合物包括1×PCR缓冲液(Solgent Co.Ltd.)、5.0mMMgCl2、200μM dNTP、0.2μM的每种引物、0.1mg/ml BSA、和0.1U/μl的Taq DNA聚合酶。PCR的温度条件如下。在EppendorfPCR管中实施PCR：94℃5分钟1个循环，94℃30秒、62℃30秒和72℃30秒30个循环，然后用Bioanalyzer(Agilent)对所获得的PCR产物进行定量。在芯片中实施PCR：94℃1分钟1个循环，94℃5秒、62℃5秒和72℃20秒40个循环，然后用TMC1000(Samsung)仪器实时监测所获得的PCR产物。
图3为显示根据本发明的实施方案，依据芯片表面积的增加的PCR效率的图表。由图3可以看到，芯片表面积相对于体积的比值越高，所获得的PCR产物的量越少，并且所生产的PCR产物的量也与芯片表面积相对于体积的比值密切相关。因此，为了用具有大的表面积的芯片实施PCR，需要添加其它的添加剂以减小PCR抑制。
实施例2：依据PEG浓度的PCR效率
对于具有大的表面积的芯片，测定了根据聚乙二醇(PEG)浓度的PCR效率。除了通过分别向PCR混合物添加浓度为0.31％、1.25％、2.5％、5％和10％的PEG而制备了5个样品外，以与实施例1中相同的方式实施PCR。图4图示两个图表，这两个图表显示相对于PEG浓度的PCR效率。图4中，左边的图表显示Rn值，右边的图表显示荧光测定值Ct。所述荧光测定值Ct通过测定荧光的量来表示，所述荧光的量是作为阈值循环实时扩增的。使用相同的样品时，Ct值越低，PCR效率越高。Ct为表示1个循环差异代表加倍或减半的DNA浓度的单位。Rn与PCR产物的浓度有关，Rn值越高，PCR产物的浓度越高。如图4所示，当添加5％(w/w)的PEG时，Rn具有最高值，Ct具有最低值，因此获得最高的PCR效率。
实施例3：依据BSA浓度的PCR效率
对于具有大的表面积的芯片，测定了与牛血清白蛋白(BSA)浓度有关的PCR效率。除了向PCR混合物添加了5％的PEG，并且通过向其添加0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml的BSA而制备了5个样品外，以与实施例1相同的方式实施了PCR。图5图示两个图表，这两个图表显示根据BSA浓度的PCR效率。图5中，左边的图表显示Rn值，右边的图表显示Ct值。如图5所示，添加0.62mg/ml BSA时，Rn具有最高值，Ct具有最低值，因此获得最高的PCR效率。
实施例4：依据具有不同表面积的芯片的PCR效率
为了测定根据具有不同表面积的芯片的PCR效率，制备了六种芯片。制备基于硅的芯片(硅/二氧化硅)的方法如下：
(1)薄片冲洗
薄片在Piranah溶液(H2SO4∶H2O2＝3∶1，120℃)中处理15分钟，在流水下冲洗后干燥。
(2)六甲基二硅氮烷(HMDS)涂覆
用旋转涂布机将5ml六甲基二硅氮烷(HMDS)涂覆在冲洗过的薄片上，以500rpm涂覆5秒和4000rpm涂覆40秒，然后涂覆过的薄片在电热板中于120℃烘烤两分钟。
(3)PR涂覆
将5ml光刻胶(GXR 601)涂覆在烘烤过的薄片上，然后以500rpm 5秒和4000rpm 40秒进行涂覆。
(4)温和烘烤(soft baking)
PR-涂覆的薄片用电热板于95℃烘烤两分钟。
(5)紫外线(UV)辐照
将用于制造柱状物的掩膜安装在UV光刻机(aligner)(i-line)中，然后照射250mJ的紫外线。
(6)显影
用MIF 300显影剂进行显影。
(7)强烈烘烤(hard baking)
已显影的薄片于115℃强烈烘烤两分钟。
(8)深层RIE
用STS ICP-RIE装置蚀刻烤干的薄片达100μm的硅。
(9)灰化
用灰化装置从蚀刻的薄片中灰化光刻胶。
(10)PR剥离
灰化的薄片在Piranah溶液中处理15分钟，冲洗并干燥以去除和洗去残留的PR。
(11)氟化氢(HF)加工
用稀释的HF处理所得薄片一分钟，去除天然氧化物。
(12)硅氧化
为了进行SiO2显影，用蒸气进行湿热氧化以显影3000的厚度。
(13)薄片冲洗
所述薄片在Piranah溶液中处理15分钟，冲洗并干燥。
(14)阳极键合(Anodic bonding)
将玻璃基板置于(13)中冲洗过的薄片上，400℃加热并向其施加1000伏的电压以制成微芯片。
图6图示根据本发明的实施方案，代表具有不同表面积的六种芯片的照片。可以引入样品的柱状物尺寸、柱状物之间的间距、柱状物高度、总表面积、体积、表面积与体积的比值如表1所示。
表1
  芯片编号   1   2   3   4   5   6
  柱状物尺寸(μm)   25   25   50   100   25   0
  柱状物之间的间距(μm)   8   17   9   50   30
  柱状物高度(μm)   100   100   100   100   100   100
总表面积(mm2)   451.6(5x)   313.2(3.48x)   283.9(3.15x)   130(1.44x)   220.2(2.45x)   90(1x)
  微室体积(μl)   1.92   2.91   1.27   2.5   3.57   4.5
  表面积与体积的比值   11.6   5.33   11.1   2.95   3   1
对于所制备的芯片，测定了DNA结合效率和PCR效率。为测定DNA结合效率，使用如下的缓冲液。1M硫酸钠(pH 3.0)和1M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作结合缓冲液，0.01M硫酸钠(pH 3.0)和0.01M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作冲洗缓冲液。首先，将包含DNA的样品与结合缓冲液以1∶1的比例混合，将所述混合物加到芯片中，随后通过将冲洗缓冲液添加到所述芯片来冲洗该芯片。用picogreen(Molecular Probe)定量来自芯片的包括于结合缓冲液和冲洗缓冲液中的DNA的量，通过所定量的DNA的量与存在于起始样品中的DNA的量之间的差异预测结合到所述芯片的DNA的量。
除了对于每种芯片，将5％的PEG和0.62mg/ml的BSA添加到PCR混合物之外，以与实施例1中相同的方式实施PCR。图7为显示根据本发明的实施方案，具有不同表面积的六种芯片的DNA结合效率和PCR效率的图表。如图7所示，对于具有25μm的柱状物尺寸、17μm的柱状物之间间距的2号芯片，Ct具有最低值，DNA结合效率高(图7中以箭头表示的)。由此结果可以看到，DNA结合效率通常与芯片的表面积成正比，表面积越大，DNA结合效率越高。然而，芯片的表面积越大，Ct值越高，因此PCR效率降低。
实施例5：使用纯化DNA的核酸的浓缩和扩增效率
使用纯化的0.012ng/μl的E.coli BL21 gDNA(16700个目标基因拷贝/μl)测定了核酸的浓缩和扩增效率。在DNA浓缩中，1M硫酸钠(pH 3.0)和1M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作结合缓冲液，0.01M硫酸钠(pH 3.0)和0.01M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作冲洗缓冲液。以与实施例4中相同的方式实施PCR。图8是显示根据核酸浓度的PCR效率的图表。图8中，曲线A代表浓缩前对来自初始DNA溶液的核酸实施PCR的结果，曲线B代表使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法浓缩的DNA的PCR结果。如图8所示，与浓缩前的Ct相比，浓缩后Ct值显著降低。因此，使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法时，在芯片中有效地浓缩DNA。
为了定量评估使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法浓缩核酸的效率，测定了依据作为模板的E.coli BL21的gDNA拷贝数的Ct值。结果如表2所示。
表2
  DNA(目标基因拷贝/芯片)   Ct
  3.00E+06   14.86
  1.00E+06   16.77
  3.33E+05   18.22
  1.11E+05   20.80
  3.70E+04   22.32
  1.23E+04   24.23
用表2所示数据构建了代表依据E.coli BL21 gDNA的目标基因拷贝数的Ct值的标准曲线。图9为标准曲线，其显示根据本发明实施方案，依据E.coli BL21 gDNA的目标基因拷贝数的Ct值。图9中，右边的点线代表相应于所有E.coli BL21 gDNA都理想地浓缩至高达40倍而无损失(1.00E+06个拷贝)时的Ct值，左边的点线代表相应于浓缩前原始BL21 gDNA溶液(16700个拷贝/μl)的Ct值。如图9所示，对于没有柱状结构的6号芯片，DNA的浓缩效率较低，从而Ct值相对较高，然而对于2号芯片，DNA的浓缩效率非常高，因此Ct值非常低。2号芯片的图表代表相应于1.00E+06个拷贝的35％的Ct值。因此可以看到，在40倍浓缩工艺中产生65％的损失，但浓缩了相当多的DNA。
实施例6：使用细胞溶解产物的核酸的浓缩和扩增效率
用1.3×105个细胞/μl的E.coli BL21溶解产物测定了核酸的浓缩和扩增效率。在DNA浓缩中，1M硫酸钠(pH 3.0)和1M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作结合缓冲液，0.01M硫酸钠(pH 3.0)和0.01M乙酸钠(pH 3.0)的混合物用作冲洗缓冲液。以与实施例4中相同的方式实施PCR。图10是显示根据本发明的实施方案，依据核酸浓度的PCR效率的图表。图10中，曲线A代表浓缩前对来自初始DNA溶液的核酸实施PCR的结果，曲线B代表使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法浓缩的DNA的PCR结果。由图10可以看到，浓缩前的Ct值为25.5，而核酸浓缩后的Ct值显著地减少到15.37。也就是说，使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法时，即便是在其中存在大量PCR抑制剂的细胞溶解产物中，也可以有效地浓缩、纯化和扩增核酸。
为了定量评估使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法浓缩核酸的效率，测定了依据作为模板的E.coli BL21的细胞数目的Ct值。结果如表3所示。
表3
  细胞数目   Ct
  1.00E+07   19.69
  3.33E+06   21.24
  1.11E+06   22.72
  3.70E+05   24.74
  1.23E+05   26.37
  4.12E+04   27.80
用表3所示数据做出了代表依据E.coli BL21的细胞数目的Ct值的标准曲线。图11为根据本发明实施方案，显示依据E.coli BL21的细胞数目的Ct值的标准曲线。图11中，右边的点线代表相应于E.coli BL21细胞理想地浓缩至高达50倍(1×107个细胞/μl)时的Ct值(19.69)，左边的点线代表相应于浓缩前原始BL21的细胞数目(1.3×105个细胞/μl)的Ct值。根据图11，对于2号芯片，Ct值远低于19.69。当把对应于2号芯片的Ct值转变为细胞数目时，其显示原始细胞浓缩了约500倍以上。这是因为存在于细胞溶解产物中的PCR抑制剂在浓缩核酸的过程中被除去，因此核酸被纯化为更纯形式。
因此，当使用根据本发明实施方案的浓缩和扩增核酸的方法时，可以有效地纯化、浓缩和扩增包含PCR抑制剂的细胞溶解产物。
根据本发明，由于核酸可逆地结合在微室表面，因而与发生不可逆结合的氧化铝的表面相比，PCR回收率更高。此外，所有的工艺都在单个微室中顺序进行，从而可以减少样品和消耗品的量，可以减少处理和分析中耗费的时间和劳动，由于通过排除运输样品的过程而无样品损失，因而可以提高检测灵敏度，并且能够显著地减小交叉污染的危险。因此，建立用于浓缩和扩增核酸的完整的自动化系统是容易的。
虽然已经详细地展示了本发明并参考其示例性实施方案描述了本发明，但本领域普通技术人员会了解，可以在不脱离权利要求书限定的本发明的精神和范围的前提下，做出多种形式上和细节上的改变。
                                   序列表
<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)
<120>在单个微室中浓缩和扩增核酸的方法和仪器
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>1
yccakactcc tacgggaggc                                                 20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>2
gtattaccgc rrctgctggc ac                                              22

Claims (18)

1.在单个微室中顺序进行核酸的浓缩和扩增的方法，该方法包括：
将包含核酸的样品和包含亲液盐的溶液加入到具有亲水性表面的微室中，从而通过将核酸结合在微室表面上来浓缩核酸；和
通过将PCR混合物添加到所述微室中来实施聚合酶链式反应(PCR)。
2.权利要求1的方法，其中浓缩核酸进一步包括冲洗未结合到微室表面上的样品。
3.权利要求1的方法，其中实施PCR包括添加聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)。
4.权利要求3的方法，其中聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)的浓度分别为1-10体积％和0.1-10mg/ml。
5.权利要求1的方法，其中微室的表面有多个柱状物。
6.权利要求5的方法，其中柱状物之间的间距为8～50μm。
7.权利要求1的方法，其中所述亲水性官能团选自：羟基、胺基、羧基、多羧基和硅烷醇基。
8.权利要求1的方法，其中所述亲液盐选自：硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)和乙酸盐(CH3COO-)。
9.权利要求1的方法，其中所述包含核酸的样品和亲液盐具有3-10的pH。
10.权利要求1的方法，其中亲液盐的浓度为100～2000mM。
11.权利要求1的方法，其中所述包含核酸的样品为血液、血清、尿、唾液或存在于细胞培养物液体中的细菌的细胞溶解产物。
12.用于顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：在其表面上具有亲水性官能团的微室；通过微通道与微室互连的存储含核酸样品的部件，其为微室提供含核酸的样品；通过微通道与微室互连的存储亲液盐溶液的部件，其为微室提供亲液盐；通过微通道与微室互连的存储PCR混合物的部件，其为微室提供PCR混合物；加热和冷却微室的加热部件和冷却部件。
13.权利要求12的仪器，其中微室的表面具有多个柱状物。
14.权利要求13的仪器，其中柱状物之间的间距为8～50μm。
15.权利要求12的仪器，其中所述亲水性官能团选自：羟基、胺基、羧基、多羧基和硅烷醇基。
16.权利要求12的仪器，其中所述包含核酸的样品为血液、血清、尿、唾液或存在于细胞培养物液体中的细菌的细胞溶解产物。
17.用于顺序进行核酸的浓缩和扩增的仪器，所述仪器包括：包括在其表面上具有亲水性官能团的微室的芯片；和包括位于其上的芯片的核酸扩增部件。
18.包括权利要求12或17的仪器的芯片实验室。
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