JP5811483B2 - 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年4月3日に提出された米国仮特許出願第61/042,259号の優先権の恩典を主張する。
本発明は概して、核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、多数の核酸配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いるための方法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の開発は、DNA増幅を、分子診断検査を含む種々の用途に用いることを可能にした。しかし、分子鑑別診断(MDD)アッセイのためにPCRを用いることには諸課題が伴う。PCRは特異的なプライマーまたはプライマーのセット、温度条件および酵素を利用する。このため例えば、PCR反応は混入を受けやすく、プライマーの結合は異なるプライマーに対して異なる条件を必要とすることがあり、プライマーは標的配列のみを増幅するためには標的配列に対して特異的である必要がある。このことは単一の試料から多数の配列を増幅することをさらに困難としている。
[本発明1001]
第1の増幅反応において、高濃度の標的特異的プライマーを用いて1つまたは複数の標的核酸を増幅し、それによって、少なくとも1つの共通プライマー結合部位を含む少なくとも1つの核酸アンプリコンを生成する段階;
該少なくとも1つの核酸アンプリコンをレスキュー(rescue)する段階;および
第2の増幅反応において、該少なくとも1つの核酸アンプリコンを、該少なくとも1つの共通プライマー結合部位と結合する共通プライマーを用いて増幅する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
前記高濃度の標的特異的プライマーがネステッド(nested)プライマーである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記1つまたは複数の標的核酸が、ウイルス、細菌および真菌の核酸からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記1つまたは複数の標的核酸が、ヒト臨床試料から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記1つまたは複数の標的核酸が、動物由来の臨床試料から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの共通プライマーが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの核酸アンプリコンをレスキューする段階が、第2の反応系における第2の増幅のためのアンプリコンを得るために第1の反応系における増幅完了物からの少量試料採取を行う段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるプライマーを含む、プライマーキット。
本発明者は、医学的試料、環境試料、食品試料および他の試料の、それらの試料中の微生物および他の病原体(agent)を同定することを目的とする評価のために、ウイルス、細菌、真菌、植物および/または動物の細胞由来の核酸の存在、ならびに存在する相対量を検出するために用いることのできる、新たな方法を開発した。本方法を、本明細書では、アンプリコンレスキューマルチプレックス(amplicon rescue multiplex)ポリメラーゼ連鎖反応(「arm-PCR」)と称するものとする。この方法では、標的核酸のPCR増幅を、2つの異なる反応系において逐次的に行う。これらの系は、例えば、標的核酸を増幅してアンプリコンを生成させるために必要な標的核酸、プライマー、酵素、ヌクレオチド(例えば、dNTP)および緩衝液を含む、別個のカラム、反応容器またはチップ区域で構成されうる。第1の増幅反応において高濃度のプライマーを用い、その反応の間に形成されたアンプリコンを、異なる反応系における第2の増幅反応に用いるためにレスキューすることにより、本発明者は、感度および特異性を高め、検出可能な結果が生じるまでに必要な時間を短縮し、かつ自動化に適している方法を開発した。
、またはそれらの組み合わせの中から選択されたプライマーが、第2の増幅反応において非常に優れた結果を与えることを見いだした。
食品伝染疾患の原因となる病原体を増幅して検出するためのarm-PCR反応をデザインした。各病原体に対して用いた標的遺伝子は、以下の表1に列挙されている。
95℃を15分間
94℃を15秒間
55℃を15秒間
72℃を15秒間
これらの3サイクルを2〜20回繰り返した(本実施例では合計15回)
96℃を15秒間
70℃を15秒間
これらの2サイクルを、本実施例では6回繰り返した
72℃を3分間
4℃に保つ
95℃を15分間(酵素を熱活性化するため)
93℃を15秒間
55℃を15秒間×30サイクル
72℃を15秒間
72℃を3分間
4℃に保つ
Claims (5)
- 第1の増幅反応において、ネステッド(nested)プライマーを構成するそれぞれのプライマーを0.2〜1μMのプライマー濃度で用いて1つまたは複数の標的核酸を増幅し、それによって、少なくとも1つの共通プライマー結合部位を含む少なくとも1つの核酸アンプリコンを生成する段階であって、該ネステッドプライマーが、フォワードアウトプライマー、フォワード共通プライマータグを有するフォワードインプライマー、リバースアウトプライマー、およびリバース共通プライマータグを有するリバースインプライマーを含む、段階;
該少なくとも1つの核酸アンプリコンをレスキュー(rescue)する段階;および
第2の増幅反応において、該少なくとも1つの核酸アンプリコンを、該少なくとも1つの共通プライマー結合部位と結合する少なくとも一つのフォワード共通プライマーおよび少なくとも一つのリバース共通プライマーを用いて増幅する段階
を含む、方法。 - 前記1つまたは複数の標的核酸が、ウイルス、細菌および真菌の核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的核酸が、ヒト臨床試料から得られる、請求項1記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的核酸が、動物由来の臨床試料から得られる、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つの核酸アンプリコンをレスキューする段階が、第2の反応系における第2の増幅のためのアンプリコンを得るために第1の反応系における増幅完了物からの少量試料採取を行う段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
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