DE102015012691A1

DE102015012691A1 - Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae

Info

Publication number: DE102015012691A1
Application number: DE102015012691.1A
Authority: DE
Inventors: Kornelia Berghof-Jäger; Florian Christoph Priller
Original assignee: Biotecon Diagnostics GmbH
Current assignee: Biotecon Diagnostics GmbH
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2017-03-30

Abstract

Bereitgestellt werden Mittel und Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae mittels spezifischer Oligonukleotide unter Unterscheidung zwischen toten und lebensfähigen Mikroorganismen, und Kit aus diesen Methoden.

Description

Zusammenfassung
Bereitgestellt werden Mittel und Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae mittels spezifischer Oligonukleotide unter Unterscheidung zwischen toten und lebensfähigen Mikroorganismen, und Kit aus diesen Methoden.
Hintergrund
Der Nachweis pathogener Bakterienspezies der Gattung Vibrio, sowie der bei diesen auftretenden, toxinkodierenden Gene, dient insbesondere der Bewertung bakterieller Verunreinigung von Lebensmitteln. Vibrio treten bevorzugt in Salz- und Brackwasser auf und stellen somit ein Risiko für die Sicherheit von Meereserzeugnissen dar. Hauptverursacher von Lebensmittelvergiftungen sind die Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae. Übliche Verfahren zur Überwachung und zum Nachweis dieser Spezies sind in den internationalen Normen ISO/TS 21872-1:2007, ISO/TS 21872-2:2007, dem Bacteriological Analytical Manual (8th Edition, Revision A, 1998, Chapter 9: Vibrio) sowie CAC/GL 73-2010 beschrieben.
Beim Nachweis kann optional das Virulenzpotenzial der Spezies Vibrio parahaemolyticus und Vibrio cholerae bestimmt werden. Bei Vibrio parahaemolyticus ist das Vorhandensein der Toxingene thermostable direct hemolysin (tdh) und thermostable related hemolysin (trh) bzw. Varianten dieser Gene mit Krankheitssymptomen nach Verzehr assoziiert. Stämme von Vibrio cholerae, welche die Choleratoxin-Gene ctxA und ctxB tragen, und üblicherweise den Serotypen O1 oder O139 angehören, sind Auslöser der Cholera. Wie Daniel und Shafaie (Infect Med, 2000, 17: 665–685) in ihrer Übersichtsarbeit darstellen, liegen die Infektionsdosen aber auch bei Vibrio mit nachgewiesenen Virulenzgenen sehr hoch. Bei Vibrio parahaemolyticus wird eine Infektionsdosis von mindestens 10⁵ koloniebildenden Einheiten (KBE) benötigt, bei ctx-tragenden Vibrio cholerae geht man sogar von mindestens 10⁶ KBE aus. Infektionen können zudem von Isolaten herrühren, die keines der genannten Toxingene tragen.
Nach den üblichen nationalen gesetzlichen Regelungen zum Nachweis pathogener Vibrio ist daher die qualitative und quantitative Bestimmung des Auftretens der oben genannten drei pathogenen Spezies auf Nahrungsmitteln verpflichtend. Der Nachweis der Toxingene ist für Fragen der Lebensmittelsicherheit hingegen untergeordnet, entsprechende Untersuchungen daher zumeist optional.
Nach "Fish and Fishery Products Hazards and Controls Guidance – Fourth Edition, 2011, APPENDIX 5: FDA and EPA Safety Levels in Regulations and Guidance" der FDA gelten verzehrfertige Waren mit einer Kontamination von weniger als 10⁴ KBE/g Vibrio parahaemolyticus als verkehrsfähig, unabhängig vom Virulenzpotenzial. In ebendiesen Regularien werden zudem für lebensmitteltechnisch behandelte Muscheln und Austern quantitative Grenzwerte von weniger als 30 KBE/g Vibrio parahaemolyticus und Vibrio vulnificus vorgegeben. Ebenso publizierte die International Commission an Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, 1986) quantitative mikrobiologische Richtwerte für Vibrio parahaemolyticus von 100 KBE/g und 1000 KBE/g. Zu untersuchende Lebensmittel sind üblicherweise im Verhältnis 1:10 in einem flüssigen Anreicherungs-/Extraktionsmedium zu homogenisieren. Entsprechende quantitative Nachweismethoden sollten daher Sensitivitäten von mindestens 10 KBE/ml aufweisen, idealerweise sogar 3 KBE/ml.
Der klassische Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae erfolgt über nur beschränkt selektive Nährmedien, denen z. B. Gallensalze und Indikatorfarbstoffe zugesetzt wurden. Dabei ist zu beachten, dass etwaige positive Ergebnisse (charakteristische Kolonieform und -farbe), die durch Anreicherung in alkalischem Peptonwasser mit nachfolgender Kultivierung auf TCBS-Agar erhalten werden, präsumtiv sind und durch eine weitere biochemische Charakterisierung der Isolate auf speziellen Nährmedien bestätigt werden müssen. Da die verwendeten Anreicherungsmedien das Wachstum der Begleitflora nur unzureichend unterbinden, kann durch diese das Wachstum von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae unterdrückt werden. Außerdem können die Nährmedien eine inhibitorische Wirkung entfalten. Ein weiterer Nachteil dieser Kultivierungs-Nachweisverfahren liegt in ihrem hohen Zeitaufwand, da die Kultivierungsphasen jeweils bis zu 48 Stunden dauern. Eine quantitative Bestimmung der Keimzahlen ist zudem nur über ein aufwändiges Titerverfahren (MPN-Verfahren) möglich, bei welchem je Probe mindestens 9 Analysen durchgeführt werden müssen.
Aufgrund der genannten Nachteile werden seit ca. 25 Jahren vermehrt nukleinsäurebasierte Nachweismethoden eingesetzt, welche die Detektion der Spezies und der Toxine basierend auf genetischer Information zulassen. Eine offiziell anerkannte Methode stellt hierbei die Koloniehybridisierung dar, mittels welcher eine quantitative Bestimmung der Keimzahl bis minimal 10 KBE/g realisierbar ist. Dabei wird eine Verdünnung von Lebensmittelhomogenisat auf geeignetem Nähragar (z. B. T₁N₃) für bis zu 24 Stunden bebrütet, die Bakterienkolonien auf Filterpapier übertragen und durch Lyse und Waschen vorbereitet. Während der Hybridisierung lagern sich chemisch markierte Nukleinsäuresonden an den komplementären Basen der nun freiliegenden Zielsequenzen an. Die Sonden wiederum können mit einer chemischen Farbreaktion nachgewiesen werden. Wird der gefärbte Filter anschließend wieder an der ursprünglichen Agarplatte ausgerichtet, so lassen sich die Kolonien der nachzuweisenden Spezies bestimmen. Dieses Verfahren verzichtet jedoch nicht auf die oben beschriebene selektive Kultivierung, ist technisch sehr anspruchsvoll und ebenfalls zeitaufwändig. Das Ergebnis für identifizierte Kolonien ist zudem nochmals über Alternativverfahren zu bestätigen, wodurch es für Routinekontrollen im Lebensmittelbereich nicht geeignet ist. Wie außerdem Jones et al. (J Food Prot., 2009, 72: 2106–9) berichten, führt diese Kombination von phänotypischer und DNS-Typisierung zu deutlich geringer als der theoretisch möglichen Sensitivität, v. a. beim Nachweis von Vibrio parahaemolyticus.
Alternativ wurden auch Nachweismethoden auf Basis der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder vergleichbarer Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren entwickelt. Diese nutzen Zielsequenzen, welche gewöhnlich nur als Einzelkopie je Genom vorliegen, zumindest aber in weniger als drei Kopien je Genom. Vorteile dieser Methoden sind das Entfallen der Kultivierung auf Selektivagar, ein dadurch reduzierter Zeitbedarf sowie ein im Vergleich zur Koloniehybridisierung verringerter technischer Aufwand. Der analytische Nachweis wird bei diesen Methoden über PCR-Gelelektrophorese oder ein vergleichbares Verfahren bewerkstelligt. Eine derartige Auswertung ist jedoch rein qualitativer Natur, sodass diese Methoden die den in den Regularien geforderten quantitativen Nachweis nicht oder nur über den Umweg eines Titerverfahrens erzielen können.
EP1424401 B1 offenbart ein PCR-Verfahren für den Nachweis von Vibrio parahaemolyticus mittels des rpoD-Gens.
US6048697 A offenbart ein PCR-Verfahren für den Nachweis von Vibrio parahaemolyticus mittels des gyrB-Gens.
US6183973 B1 offenbart ein PCR-Verfahren für den Nachweis von Vibrio vulnificus mittels des wza-Gens.
EP2271767 A1 offenbart ein PCR-Verfahren für einen Mehrfachnachweis von Vibrio parahaemolyticus mittels des tlh-Gens und von Vibrio cholerae mittels des ompW-Gens unter zusätzlicher Bestimmung des Choleratoxins mittels des ctx-Gens.
In der Vergangenheit wurde bereits versucht, spezifische Nachweismethoden auf Basis der Echtzeit-PCR zu entwickeln. Wie andere PCR-Methoden nutzen auch diese Zielsequenzen, welche gewöhnlich nur als Einzelkopie je Genom vorliegen, zumindest aber in weniger als drei Kopien je Genom. Derart gestaltete Echtzeit-PCR-Methoden weisen eine vergleichsweise geringe Sensitivität auf (Luo et al., 2010, J Clin Microbiol., 48: 2569–70; Chern et al., 2011, Lett Appl Microbiol., 52: 298–306).
WO2014148877 A1 offenbart ein Echtzeit-PCR-Verfahren für einen Mehrfachnachweis von Vibrio vulnificus mittels des vvh-Gens und Vibrio cholerae mittels des ompW-Gens. Die Erfindung legt keine Methode zur Quantifizierung dar.
EP1577393 A1 offenbart ein Echtzeit-PCR-Verfahren für den Nachweis von Vibrio cholerae mittels des gyrB-Gens oder rpoD-Gens. Die beschriebene Erfindung erhebt Anspruch auf ein quantitatives Verfahren, offenbart jedoch keine geeignete Methode.
US20090226895 A1 offenbart ein Echtzeit-PCR-Verfahren für den NAchweis von Vibrio parahaemolyticus mittels des toxR-Gens unter Bestimmung des Toxingens tdh. Ein Verfahren wird exklusiv für klinische Proben beschrieben, die maximale Sensitivität wird mit 100 KBE/ml angegeben. Das offenbarte Verfahren ist zwar quantitativ, jedoch nicht für Lebensmittelanalytik geeignet, und verfehlt die dafür relevante Nachweisgrenze von 10 KBE/ml.
Eine ausreichend sensitive Quantifizierung der Spezies ist hingegen mit Zielsequenzen durchführbar, welche in mehreren Kopien je Genom vorliegen. Wie von Inglis und Kalischuk (Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70: 2296–2306) beispielhaft gezeigt, gelten hier die Nukleotidsequenzen der rDNA Operons als geeignete Zielsequenzen. Mit diesen konnte jedoch bisher im Genus Vibrio keine direkte Unterscheidung der nachzuweisenden Spezies erreicht werden (Luo und Hu, 2008, Dis Aquat Organ., 82: 209–16; Shikongo-Nambabi et al., Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 2012, 7.2: 16–30; Lal und Ransangan, 2013, International Journal of Research in Pure and Applied Microbiology, 3: 17–24). Lediglich durch Größenunterschiede der sogenannten Spacer-DNA-Sequenzen konnte in vorausgehenden Arbeiten eine Speziesunterscheidung mittels der Nukleotidsequenzen der rDNA Operons erzielt werden (González-Escalona et al., 2007, Foodborne Pathog Dis., 4: 327–37; Hoffmann et al., 2010, BMC Microbiol. 23; 10: 90). Die hierbei verwendeten Primer sind jedoch unspezifisch und hybridisieren auch mit der DNS anderer als der Zielspezies. Die dadurch erforderliche Gelelektrophorese stellt ein sehr aufwändiges Verfahren dar, welches zudem nicht quantitativer Natur ist. Zusätzlich wird eine eindeutige Auswertung durch die hohe Heterogenität der Fragmentlängen bei verschiedenen Stämmen einer Spezies erschwert.
Aufgabe der Erfindung ist demnach die Bereitstellung von Verfahren bzw. Mitteln zur Realisierung eines verbesserten bzw. sensitiveren Nachweises von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae.
Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines quantitativen Nachweisverfahrens bzw. von Mitteln für einen quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae, insbesondere eines Nachweisverfahrens, das die Nachweisgrenze von 10 KBE/ml erreicht.
Beschreibung der Erfindung
Mit dieser Erfindung wird ein Echtzeit-PCR-Nachweis zur sensitiven, spezifischen und simultanen Quantifizierung von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae auf Basis von Zielsequenzen offenbart, welche in mehrfacher Kopie im Genom vorliegen.
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass es über die Verwendung von bestimmten Oligonukleotiden als Primer und/oder Sonden, bevorzugt bestimmter Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern, möglich ist, spezifische Sequenzen in den rDNA Operons zum Nachweis der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae zu nutzen. Diese liegen je nach Spezies und Stamm in 6–11 Kopien je Genom vor, wodurch die Sensitivität der direkten Quantifizierung höher liegt als bei bisherigen Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide hybridisieren als Primer und/oder Sonden spezifisch in kodierenden Bereichen, ITS-(„intergenic transcribed spacer region”) oder IGS-Regionen („intergenic spacer region”) der rDNA Operons, deren DNS-Sequenzen spezifisch für die Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae sind.
Bereits ein für Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae spezifischer Primer bzw. eine für die jeweilige Spezies spezifische Sonde, ausgewählt aus den aufgeführten SEQ ID NOs 1 bis 27, kann ausreichen, die Spezifität des erfindungsgemäßen Nachweissystems zu gewährleisten.
Als Hybridisierung wird im Folgenden die Doppelstrangbildung zweier identischer oder ähnlicher Nukleotidfragmente (DNS, RNS, alle bekannten DNS-Analoga) bezeichnet. Von spezifischer Hybridisierung spricht man, wenn eine stabile Hybridnukleinsäure zwischen dem Oligonukleotid und der entsprechenden Ziel-DNS-Sequenz des Oligonukleotids besteht, nicht jedoch zu anderer DNS als der Ziel-DNS.
Derivate oder Varianten von offenbarten Oligonukleotiden können beispielsweise Sequenzvarianten, chemisch modifizierte DNS oder DNS-Analoga sein. Dem Fachmann sind weitere Varianten der DNS bekannt.
Listung der erfindungsgemäß bevorzugten Sequenzen zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus:
Die hier beschriebene Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf Varianten der SEQ ID NOs: 1–9 sowie deren Nutzung zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus.
Der erfindungsgemäße Nachweis von Vibrio parahaemolyticus erfolgt mittels spezifischer Hybridisierung mindestens einer der SEQ ID NOs: 1–9 oder ihrer Varianten als Primer oder Sonde und ist spezifisch für diese Spezies. Der bevorzugte erfindungsgemäße Nachweis ist ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren unter Verwendung eines oder mehrerer Primer aus den SEQ ID NOs: 1–9 oder ihrer Varianten.
Listung der erfindungsgemäß bevorzugten Sequenzen zum Nachweis von Vibrio vulnificus:
Die hier beschriebene Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf Varianten der SEQ ID NOs: 10–18 sowie deren Nutzung zum Nachweis von Vibrio vulnificus.
Der erfindungsgemäße Nachweis von Vibrio vulnificus erfolgt mittels spezifischer Hybridisierung mindestens einer der SEQ ID NOs: 10–18 oder ihrer Varianten als Primer oder Sonde und ist spezifisch für diese Spezies. Der bevorzugte erfindungsgemäße Nachweis ist ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren unter Verwendung eines oder mehrerer Primer aus den SEQ ID NOs: 10–18 oder ihrer Varianten.
Listung der erfindungsgemäß bevorzugten Sequenzen zum Nachweis von Vibrio cholerae:
Die hier beschriebene Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf Varianten der SEQ ID NOs: 19–27 sowie deren Nutzung zum Nachweis von Vibrio cholerae.
Der erfindungsgemäße Nachweis von Vibrio cholerae erfolgt mittels spezifischer Hybridisierung mindestens einer der SEQ ID NOs: 19–27 oder ihrer Varianten als Primer oder Sonde und ist spezifisch für diese Spezies. Der bevorzugte erfindungsgemäße Nachweis ist ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren unter Verwendung eines oder mehrerer Primer aus den SEQ ID NOs: 19–27 oder ihrer Varianten.
Das bevorzugte erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT). Werden hierbei die erfindungsgemäßen Oligonukleotide verwendet, so führt dies zur spezifischen Bildung von Amplifikaten der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae oder eines Gemisches spezifischer Amplifikate mehrerer dieser Spezies, sofern Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae bzw. eine Mischung dieser Spezies in einer Probe vorliegen.
Mögliche spezifische Amplifikate, welche mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden gemäß SEQ ID NOs: 1–27 erhalten werden können entsprechen den SEQ ID NOs: 28–32 oder Teilsequenzen davon.
Hierbei entspricht SEQ ID NO: 28 oder Teilsequenzen davon dem Amplifikationsprodukt von einem oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 1–9; SEQ ID NO: 29 oder Teilsequenzen davon dem Amplifikationsprodukt von einem oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 10–13; SEQ ID NO: 30 oder Teilsequenzen davon dem Amplifikationsprodukt von einem oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 14–18; und SEQ ID NOs: 31 und 32 oder Teilsequenzen davon den Amplifikationsprodukten von einem oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 19–27.

Im einfachsten Fall handelt es sich bei dem Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren um ein lineares Verfahren, bei welchem je Spezies nur ein einzelnes Oligonukleotid als Primer Verwendung findet. Vorzugsweise sind Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren jedoch exponentielle Reaktionen, bei welchen mindestens zwei Oligonukleotide je Spezies als sogenannte Vorwärts- und Rückwärtsprimer eingesetzt werden. Tabelle 1 beschreibt im Folgenden alle möglichen erfindungsgemäßen Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zum spezifischen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae. Tabelle 1 – Erfindungsgemäße Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern aus den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden. „Primer” bezeichnet ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder dessen Derivat. Wird der „1. Primer” als Vorwärtsprimer definiert, so bildet der „2. Primer” den Rückwärtsprimer. Wird der „2. Primer” als Vorwärtsprimer definiert, so bildet der „1. Primer” den Rückwärtsprimer.

Index	1. Primer	2. Primer	Index	1. Primer	2. Primer
1	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 3	36	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 18
2	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 4	37	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 17
3	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 5	38	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 18
4	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 6	39	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 17
5	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 7	40	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 18
6	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 8	41	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO: 18
7	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 9	42	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 20
8	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 3	43	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 21
9	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 4	44	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 22
10	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 5	45	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 23
11	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 6	46	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 24
12	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 7	47	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 25
13	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 8	48	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 26
14	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 9	49	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 27
15	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 4	50	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 22
16	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 6	51	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 23
17	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 7	52	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 24
18	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 8	53	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 25
19	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 9	54	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 26
20	SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 5	55	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 27
21	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6	56	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 22
22	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 7	57	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 23
23	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 8	58	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 24
24	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 9	59	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 25
25	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 8	60	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 26
26	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 8	61	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 27
27	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 9	62	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 23
28	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 11	63	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 24
29	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 12	64	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 26
30	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 13	65	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 27
31	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 13	66	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 24
32	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 13	67	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 25
33	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 15	68	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 26
34	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 16	69	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 27
35	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 17

Die Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern in Tabelle 1 stellen hierbei minimale Kombinationen für den erfindungsgemäßen Nachweis dar. Dem Fachmann ist bekannt, dass auch unter Verwendung zusätzlicher Primer, wahlweise als zusätzliche Vorwärts- und/oder Rückwärtsprimer, die Spezifität und Sensitivität des erfindungsgemäßen Nachweises gewährleistet bleibt. Zusätzliche Primer können aus den SEQ ID NOs: 1–27 oder aus anderen Sequenzen gewählt werden. Bevorzugt für den erfindungsgemäßen Nachweis ist die Zugabe von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zusätzlichen Primern aus den SEQ ID NOs: 1–9 zu den Kombinationen 1–27 für den Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, die Zugabe von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zusätzlichen Primern aus den SEQ ID NOs: 10–18 zu den Kombinationen 28–41 für den Nachweis von Vibrio vulnificus und die Zugabe von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zusätzlichen Primern aus den SEQ ID NOs: 19–27 zu den Kombinationen 42–69 für den Nachweis von Vibrio cholerae.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform stellt der Einsatz dieser Methoden auf sogenannten Biochips dar. Diese können in ihrer Bauart und Ausführungsform variieren. Beispielsweise kann auf einem Biochip die simultane Analyse vieler verschiedener Proben bewerkstelligt werden, z. B. durch Aufbringen der Proben in separate Reaktionskammern. In einer anderen Ausführung erlaubt ein Biochip z. B. die Detektion vieler verschiedener Zielsequenzen durch getrenntes Aufbringen und Fixierung einzelner Oligonukleotide, welche später mit einer Probe in Kontakt gebracht werden. Enthält eine Probe DNS der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae oder ein Gemisch davon, kann die spezifische Hybridisierung der Oligonukleotide auf dem Biochip mit dieser DNS zum Nachweis der Spezies genutzt werden.
Eine weitere Variante der bevorzugten Ausführungsformen enthält zusätzliche Prozessschritte, wie beispielsweise ein Lyseverfahren für bakterielle Zellen oder ein Amplifikationsverfahren für die nachzuweisenden Nukleinsäuren. Letzteres kann wahlweise ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren und/oder über Southern-Blot-Verfahren mit spezifischen Sonden für Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae sein. Eine weiteres geeignetes Amplifikationsverfahren stellt die Ligase-Kettenreaktion (LCR) dar.
Eine weitere Variante der bevorzugten Ausführungsformen umfasst den Nachweis mittels Echtzeit-Detektion.
Eine weitere Variante der bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren und/oder deren Detektion auf einem Biochip, wobei eine gekoppelte Amplifikation und Detektion auf demselben Biochip besonders bevorzugt wird.
Das durch die Erfinder bevorzugte Verfahren ist die Echtzeit-PCR. Die Erfindung offenbart ein kommerziell nutzbares Produkt zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae auf Basis der Echtzeit-PCR.
In der bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den simultanen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae oder Kombinationen von mindestens zwei der genannten Spezies mittels mehrerer Oligonukleotide, mindestens jedoch eines je Spezies, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–27 als Primer und/oder Sonden in einer sogenannten Multiplexreaktion. Dieser Nachweis geschieht spezifisch unter Verhinderung eines Falsch-Nachweises von artverwandten Spezies wie beispielsweise Vibrio alginolyticus und Vibrio mimicus. Im Falle einer Amplifikation über PCR spricht man speziell von „Multiplex-PCR”. Der Fachmann weiß zur Anpassung an verschiedene Nachweisverfahren hierzu optimale Kombinationen von Primern und/oder Sonden aus den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden zusammenzustellen. Vorzugsweise werden die offenbarten Oligonukleotide oder aus diesen gewonnene Kombinationen in Form eines kommerziellen Produkts (Kit) zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae angeboten. Ein derartiges Kit kann zusätzliche Reagenzien zum Nachweis oben genannter wie auch weiterer Bakterien enthalten. Insbesondere kann ein Kit Reagenzien und Enzyme zur Durchführung eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens sowie passende Reaktionsgefäße und/oder Trägermaterial enthalten, z. B. Verbrauchsmaterial für Biochips.
Zusammengefasst stellen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide und ihre Derivate sowie daraus gewonnene Kombinationen ein geeignetes Mittel zum spezifischen Nachweis der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae dar.
Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren ermöglichen die Amplifikation individueller Nukleinsäuremoleküle, welche über geeignete Detektionsverfahren mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden. Gewöhnlicher Weise umfasst ein mikrobiologischer Nachweis auf Basis eines NAT vier Prozessschritte: Eine Anreicherung der nachzuweisenden Bakterien, Isolation der DNS und/oder RNS, Amplifikation spezifischer Bereiche der bakteriellen Nukleinsäuren, sowie die Detektion der Amplifikate. Im Spezialfall der Echtzeit-Detektion werden die beiden letztgenannten Schritte gleichzeitig ausgeführt.
Die Anreicherung der Bakterien geschieht nach etablierten kulturellen Verfahren ausgehend vom zu untersuchenden Probenkörper, z. B. verzehrfähige Garnelen, Austern oder Krabben. Im Falle eines sehr sensitiven Nachweises (gewöhnlich 1 Zelle je 25 g Lebensmittel) geschieht die Anreicherung in kommerziell verfügbaren Flüssigmedien über mindestens eine Stunde bei für das Bakterienwachstum optimalen Temperaturen, z. B. 37°C. Im Falle eines quantitativen Direktnachweises dient das flüssige Nährmedium nur zum Abschwemmen der Bakterien von der Matrix. Es wird auf Bebrütung und Standzeiten von über einer Stunde verzichtet, um eine Veränderung der Menge der in der Probe enthaltenen Bakterien zu vermeiden. In speziellen Fällen erfolgt ein Nachweis direkt aus einer Flüssigkeit (Milch, Säfte, Blut, Urin, etc.) unter Wegfall einer zusätzlichen Anreicherung.
Der zweite Schritt dient der Isolation und ggf. Reinigung der bakteriellen Polynukleotide. Gewöhnlich werden die Bakterien hierzu zunächst vom Medium/der Flüssigkeit getrennt, beispielsweise über Zentrifugation. Die Bakterien können über einen Waschschritt weiter gereinigt werden. Anschließend werden die Zellen aufgebrochen und die enthaltenen Nukleinsäuren freigesetzt. Dies kann mechanisch, chemisch, enzymatisch oder thermisch erfolgen. Die bakteriellen Nukleinsäuren können dann direkt für das nachfolgende Nachweisverfahren verwendet oder weiter gereinigt werden. Letzteres kann beispielsweise über spezifische Präzipitation, Phenol-Chloroform-Extraktion oder spezifisch mit DNS interagierenden Oberflächen bewerkstelligt werden. Letztere sind als Bestandteil kommerzieller Produkte erhältlich, z. B. in Form von Zentrifugenröhrchen oder Magnetpartikel.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren enthält eine interne Positivkontrolle zur Vermeidung falsch-negativer Befunde. Bei der internen Positivkontrolle handelt es sich um eine probenfremde Nukleinsäure, bevorzugt ein Plasmid oder ein synthetisches Polynukleotid, welches zur Nachweisreaktion gegeben und spezifisch detektiert wird. Im Beispiel eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens wird neben den bakteriellen Nukleinsäuren auch die interne Kontrolle amplifiziert, welche somit als „interner Molekülstandard” die Effektivität der Reaktion wiedergibt (Ballagi-Pordany und Belak, 1996, Mol. Cell. Probes 10, 159–164). Die interne Positivkontrolle wird in einer definierten Menge dem Reaktionsgemisch beigemischt und zusammen mit den Zielsequenzen amplifiziert. Als interne Kontrolle wird bevorzugt eine einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure mit frei wählbarer Länge gewählt.
Im Rahmen der „Guten Laborpraxis” für diagnostische Verfahren sollte der gesamte Analyseprozess zusätzlich mit externen Positivkontrollen überwacht werden. Im Fall des erfindungsgemäßen Nachweises von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae gewährleistet eine externe Positivkontrolle mit Zellen einer oder mehrerer der genannten Spezies die Verifizierung des gesamten Prozessablaufs, eingeschlossen Anreicherung, Nukleinsäureisolation, Amplifikation und Detektion. Nachteil dieses Verfahrens ist die Gefahr einer Kreuzkontamination ausgehend von der externen Positivkontrolle und somit falsch-positive Ergebnisse. Falsch-positive Ergebnisse können durch Verwendung einer externen Positivkontrolle ausgeschlossen werden, welche sich eindeutig von den nachzuweisenden Spezies unterscheidet.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren umfasst neben einem qualitativen molekularbiologischen Nachweis auch ein quantitatives Verfahren, welches eine hohe Übereinstimmung mit bekannten quantitativen Verfahren aufweist, präferenziell mit der MPN-PCR oder Koloniehybridisierung.
Das erfindungsgemäße quantitative Nachweissystem beinhaltet eine Methode zur Unterscheidung lebender von toten Vibrio spp. Besonders geeignete Verfahren verhindern selektiv die Amplifikation von DNS und/oder RNS toter Mikroorganismen.
Nukleasen beispielsweise spalten langkettige Nukleotide in kleine Oligonukleotid-Bruchstücke oder einzelne Basen auf. Eine Amplifikation ist von solch kleinen Bruchstücken nicht mehr möglich. Die DNS und RNS lebender Zellen sind durch eine intakte Zellwand vor Nuklease-Einwirkung geschützt. Bei toten Zellen ist die Zellwand hingegen oft beschädigt, wodurch Nukleasen die DNS und RNS dieser Zellen eliminieren können. Die Behandlung einer Probe mit Nukleasen begünstigt somit die Amplifikation der Nukleinsäuren von ausschließlich lebenden Zellen in einem nachfolgenden Nachweis mittels eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT).
Auch lichtreaktive interkalierende Farbstoffe wie Propidiummonoazid (PMA) oder Ethidiummonoazid-Bromid (EMA) können zur Unterscheidung lebender von toten Zellen herangezogen werden. Dem Fachmann sind weitere Verbindungen bekannt, u. a. elektroreaktive und chemisch reaktive interkalierende Substanzen. Die reaktiven interkalierenden Substanzen können die perforierte Zellmembran von toten Zellen, jedoch nicht die intakte Membran von lebenden Zellen durchdringen. Sie binden somit selektiv an die freiliegende DNS und/oder RNS toter Zellen. Energetische Anregung dieser Substanzen, beispielsweise durch Photonen definierter Wellenlänge, bewegt diese, kovalent an benachbarte Moleküle zu binden, insbesondere die DNS und RNS. Derartige chemische Modifikationen verhindern die Nutzung der Nukleinsäuren durch Enzyme, wie beispielsweise Polymerasen. Die Behandlung einer Probe mit reaktiven interkalierenden Substanzen begünstigt somit die Amplifikation der Nukleinsäuren von ausschließlich lebenden Zellen in einem nachfolgenden Nachweis mittels eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT).
Die im erfindungsgemäßen quantitativen Nachweissystem bevorzugte Methode zur Unterscheidung lebender von toten Vibrio spp. ist eine Vorbehandlung der Probe mit einer Nuklease, eine Vorbehandlung der Probe mit einer reaktiven interkalierenden Substanz, oder eine kombinierte Vorbehandlung der Probe mit einer Nuklease und einer reaktiven interkalierenden Substanz.
Die Erfindung offenbart ein kommerziell nutzbares Verfahren zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae auf Basis von Zielsequenzen in Mehrfachkopie. Das kommerzielle Verfahren kann einen oder mehrere der oben beschriebenen zusätzlichen Aspekte eines bevorzugten Nachweissystems aufweisen.
Definitionen
Nukleotide
Nukleotide sind die monomeren Bestandteile der DNS oder RNS. In der hier offenbarten Erfindung werden folgende Abkürzungen für Nukleinbasen verwendet:
G = Guanosin, A = Adenosin, T = Thymidin, C = Cytidin, R = G oder A, Y = C oder T, K = G oder T, W = A oder T, S = C oder G, M = A oder C, B = C, G oder T, D = A, G oder T, H = A, C oder T, V = A, C oder G, N = A, C, G oder T, I = Inosin, U = Uridin.
DNS-Analoga
DNS-Analoga im Sinne der Erfindung sind chemische Gruppen und daraus synthetisierte Oligomere, welche die Funktion natürlicher DNS übernehmen können. Erfindungsgemäß sind dies insbesondere, aber nicht ausschließlich, PNS, LNA, ZNA, GNA, TNA und PMO.
„PNS” bezeichnet Peptid-Nukleinsäuren, in denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid ersetzt ist. Das Rückgrat besteht dabei in der Regel aus 2-Aminoethylglycin-Einheiten, welche anstelle der geladenen Phosphodiester-Bindungen der DNS über neutrale Amid-Bindungen miteinander verbunden sind.
„LNA” (englisch für „locked nucleic acid”) bezeichnet modifizierte RNS-Nukleotide, deren Ribose-Einheit zusätzlichen mit einer Brücke zwischen dem 2'-Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff verknüpft ist (1,2:5,6-di-O-isopropylene-alpha-D-allofuranose).
„ZNA” (englisch für „zip nucleic acid”) bezeichnet ein mit kationischen Spermin-Einheiten modifiziertes Oligonukleotid, welche die Hybridisierung des Nukleotids an ein komplementäres Nukleotid durch Verringerung elektrostatischer Kräfte zwischen beiden Nukleotiden erleichtern.
„GNA” (englisch für „glycol nucleic acid”) bezeichnet Nukleinsäuren, deren Rückgrat statt aus Ribose oder Desoxyribose aus Glykol-Einheiten bestehet, welche durch Phosphodiester-Bindungen verknüpft sind.
„TNA” (englisch für „threose nucleic acid”) bezeichnet Nukleinsäuren, deren Rückgrat statt aus Ribose oder Desoxyribose aus Threose-Einheiten bestehet, welche durch Phosphodiester-Bindungen verknüpft sind.
„PMO” (englisch für „phosphorodiamidate morpholino oligo”), unter anderem auch „Morpholino” genannt, bezeichnet Nukleinsäuren, deren Rückgrat statt aus Ribose oder Desoxyribose aus Morpholin-Einheiten bestehet, welche durch Phosphorodiamidat-Gruppen verknüpft sind.
Nukleinsäure
Bei Nukleinsäure im Sinne der Erfindung kann es sich um Desoxyribonukleinsäure (DNS), Ribonukleinsäure (RNS) oder jede andere Art von DNS-Analoga sowie Hybridmolekülen daraus handeln.
Erfindungsgemäß gelten als Nukleinsäuren auch Oligonukleotide, in welchen in 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bis zu 20% der Basen, bevorzugt jedoch die Base in mindestens 1 Nukleotid, durch Basen ersetzt sind, welche gewöhnlich nicht in natürlicher DNS auftreten (z. B. Xanthin, Hypoxanthin, etc.).
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können chemische Modifikationen aufweisen, z. B. Signalmolekülgruppen für einen direkten oder indirekten Nachweis. Dem Fachmann sind insbesondere, aber nicht ausschließlich, folgende Modifikationen bekannt:

(i) Modifikation mit radioaktiven Gruppen, insbesondere Isotopenmarkierung mit radioaktivem Phosphat, Schwefel, Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, usw.
(ii) Modifikation mit Gruppen zum indirekten Farbnachweis (z. B. Digoxygenin, Biotin, usw.)
(iii) Modifikation mit fluoreszierenden Gruppen (z. B. Fluorescein, Rhodamin, usw.)
(iv) Modifikation mit chemilumineszenten Gruppen
(v) Modifikation mit elektrochemischen Gruppen
(vi) Modifikation mit Nanopartikeln (z. B. Gold-Nanopartikel, Silber-Nanopartikel, usw.)
(vii) Modifikation mit Gruppen zur Anheftung auf Oberflächen (z. B. Biotin, Streptag, Antikörper, Antigene usw.)
(viii) Modifikation mit Gruppen, welche eine direkte oder indirekte Nachweisreaktion mithilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Bindungsaffinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen ermöglichen

Die Erfindung schließt ebenfalls Kombinationen der unter (i) bis (viii) beschriebenen sowie in identischer Weise zweckhafter Modifikationen mit ein. Der Fachbegriff „Modifikation” bezeichnet hierbei direkt an die DNS gebundene chemische Gruppen zum direkten oder indirekten Nachweis oder zur Immobilisierung an einem Trägermaterial.
Metalle, radioaktive, gefärbte oder fluoreszierende Gruppen sind direkt nachweisbare Modifikationen. Immunologisch oder enzymatisch nachweisbare Gruppen, wie Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme oder Enzymfragmente sind indirekt nachweisbare Modifikationen, welche gewöhnlich in mehrstufigen Verfahren detektiert werden. In einer bevorzugten Ausführung erfolgt ein indirekter Nachweis über direkt an das Oligonukleotid gekoppelte Haptene, welche in einer nachfolgenden Antikörperreaktion nachgewiesen werden.
Hybridisierung
Unter dem Begriff „Hybridisierung” ist die Bildung eines Doppelstrangs aus zwei chemisch identischen oder ähnlichen Nukleinsäurefragmenten (DNS, RNS, alle bekannten DNS-Analoga) zu verstehen. Unter dem Begriff „spezifische Hybridisierung” ist erfindungsgemäß eine Hybridisierung zu verstehen, bei welcher unter stringenten Bedingungen eine stabile Hybridnukleinsäure zwischen dem Oligonukleotid und der entsprechenden Ziel-DNS-Sequenz des Oligonukleotids besteht, nicht jedoch zu anderer DNS als der Ziel-DNS. Im Sinne dieser Erfindung weist das Merkmal ”Sequenz, die mit einer Sequenz nach (i) spezifisch hybridisiert” auf eine Sequenz hin, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz nach (i) hybridisiert.
Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen beruht auf vielen Faktoren, unter anderem auf der Zusammensetzung der Hybridnukleinsäure, der Paarungsgeometrie und dem Auftreten von Fehlpaarungen zwischen den Nukleinsäuren, sowie den Umgebungsparametern wie der Ionenstärke und Reaktionstemperatur. Passende Bedingungen können beispielsweise mittels thermodynamischer Berechnungen ermittelt werden (SantaLucia et. al., 1996 Biochemistry 35: 3555–62.) Dem Fachmann sind verschiedene manuelle und computergestützte Verfahren zur Berechnung optimaler Bedingungen bekannt. Exemplarisch können die stringenten Hybridisierungsbedingungen wie in Beispiel 1 gewählt werden.
Primer
Als Primer gelten Oligonukleotide, welche in der Lage sind ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren zu starten. In der erfindungsgemäßen Definition hybridisieren Primer spezifisch mit dem Zielmolekül, z. B. DNS oder RNS, und werden von Polymerase verlängert. Primer können zusätzlich zu ihrer spezifischen Funktion auch als Sonde verwendet werden.
Sonde
Unter einer Sonde ist ein Oligonukleotid oder Polynukleotid zu verstehen, welches spezifisch an DNS oder RNS hybridisiert. Sonden dienen dem direkten oder indirekten Nachweis dieser Zielnukleinsäuren. Eine Sonde kann hierzu mit fluoreszierenden oder farbgebenden Gruppen zum direkten Nachweis modifiziert sein (z. B. zum Einsatz in NATs oder Microarray). In anderen Ausführungen können Sonden mit Modifikationen zum indirekten Nachweis (z. B. für ELISA) versehen sein.
In einer speziellen Ausführung wird zur Generierung eines FREI-Signals (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ein Paar fluoreszierender Sonden gewählt, welche spezifisch an unmittelbar benachbarte Regionen desselben Nukleinsäureabschnitts binden. Bei diesem Verfahren wird der Fluorophor an einer der Sonden mit einem Lichtstrahl definierter Wellenlängen angeregt und überträgt anschließend die Anregungsenergie auf den Fluorophor der zweiten Sonde. Diese generiert ein Emissionssignal von definierter Wellenlänge.
In einer weiteren Ausführung dient eine Sonde (Hydrolyse-Sonde) dem Nachweis mittels der 5'-3' Exonukleaseaktivität einer Polymerase, welche zum Verdau spezifisch hybridisierter Oligonukleotide führt. Eine Hydrolyse-Sonde ist an einem Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff, am anderen Ende mit einem Quencher modifiziert, welcher die Lichtemission des Fluoreszenzfarbstoffs absorbiert. Verlängert die Polymerase eine Nukleinsäure und trifft dabei auf die spezifisch hybridisierte Sonde, so wird durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase die Sonde verdaut und der Reporter-Fluoreszenzfarbstoff vom Quencher getrennt. Der freigesetzte Fluorophor kann somit photometrisch detektiert werden, welches den Nachweis der zugrundeliegenden DNS-Sequenz darstellt.
Dem Fachmann sind weitere für Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren geeignete Sondentypen bekannt, insbesondere, aber nicht ausschließlich, LoopTag-Sonden, Molecular Beacons, Displacing Probes, Light-Up Probes, Lanthanid-markierte Sonden, Scorpion-Primer, Lux-Primer, Amplifluor^TM Hairpin Primer und WellRed-Primer.
Oligonukleotidfragmente
Oligonukleotidfragmente oder Nukleinsäurefragmente entstehen zufällig oder gezielt durch Deletion eines oder mehrerer Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Ende oder durch Nukleaseverdau. Oligonukleotidfragmente der erfindungsgemäßen Sequenzen (SEQ ID NOs) können zum spezifischen Nachweis herangezogen werden.
Identische DNS-Sequenzen/Sequenzübereinstimmung
Eine Bestimmung der Identität (im Sinne einer 100%-prozentigen Übereinstimmung bei kompletter Überlappung) von DNS oder RNS-Sequenzen wird anhand von Teilsequenzen längerer Polynukleotide durchgeführt. Diese Teilsequenzen erstrecken sich über zehn zusammenhängende Nukleotide, welche als „identisch” bezeichnet werden, wenn die Abfolge aller zehn Basen einer Sequenz identisch mit der Abfolge der Basen in der zu vergleichenden Sequenz ist. Die Nukleotide Thymidin und Uridin gelten dabei als identisch, da sie identische Paarungseigenschaften mit anderen Nukleotiden aufweisen. Alle denkbaren Teilsequenzen, Oligonukleotidfragmente und langen Polynukleotide sind zur Identitätsbestimmung heranzuziehen.
Werden zum Beispiel zwei Polynukleotide von je 20 Basen Länge, welche sich im 5. Nukleotid unterscheiden, einem paarweisen Sequenzvergleich unterzogen, so sind 6 der zu vergleichenden 10-Nukleotid-Teilsequenzen identisch und 5 unterscheiden sich in je einem Nukleotid.
Daneben kann die Sequenzidentität auch prozentual bestimmt werden. Um die tatsächliche Sequenzübereinstimmung festzulegen, werden auch Teilsequenzen herangezogen, deren minimale Länge der Länge der tatsächlich genutzten Sequenz entspricht, z. B. die Länge eines Primer.
Zum Beispiel werden ein Polynukleotid A mit einer Länge von 100 Nukleotiden und ein Polynukleotid B mit einer Länge von 200 Nukleotiden verglichen. Ein Primer von 14 Nukleotiden Länge ist als Teilsequenz in Polynukleotid B enthalten. Zur Bestimmung der Sequenzübereinstimmung von Polynukleotid A mit dem Primer werden beide Sequenzen über ihre gesamte Länge verglichen (Beispielsweise über den BLAST Algorithmus mit Einstellung „Gap Cost = Existence: 2/Extension 1”). Tritt die Sequenz des Primers in Polynukleotid A nun mit einem Unterschied in einem Nukleotid auf, so entspricht die Übereinstimmung dem Verhältnis 13:14 bzw. 92,9%.
Derivate der erfindungsgemäßen Oligonukleotide
Als Varianten, Variationen oder Derivate der erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind Sequenzen zu verstehen, welche sich in mindestens einem Nukleotid von den spezifischen Sequenzen der SEQ ID NOs 1–27 unterscheiden, beispielsweise durch Austausch von Basen, Insertionen, Deletionen, Anhänge oder Einbau von DNS-Analoga. Dies umfasst auch Sequenzen, welche mindestens 70%, 80% oder 90% Sequenzübereinstimmung mit den spezifischen Sequenzen der SEQ ID NOs 1–27 haben, sowie Oligonukleotide welche ähnlich spezifisch hybridisieren. Der Aspekt der spezifischen Hybridisierung legt dar, dass eine Variation zu einer ähnlichen Hybridisierung mit einer der Zielsequenzen führt, wie eines der in SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Oligonukleotide.
Gemäß der Erfindung sind jegliche Derivate der in SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Oligonukleotide als gleichwertige Alternativen zu den Oligonukleotiden aus SEQ ID NOs 1–27 zu erachten. Als Derivat der in SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Oligonukleotide gilt

A) eine Nukleinsäure oder Oligonukleotid, welches unter spezifischen oder stringenten Bedingungen mit einem der in SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Oligonukleotide hybridisiert;
B) eine Nukleinsäure oder Oligonukleotid, welches mindestens 70, 75, 80, 85, 90 oder 95% Sequenzidentität einer Nukleinsäure nach A) aufweist, wobei die Sequenzidentität über Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20 oder 25, bevorzugt 10–50, besonders bevorzugt 15–40 und am bevorzugtesten 20–35, Nukleotiden Länge bestimmt wird;
C) eine Nukleinsäure oder Oligonukleotid mit komplementärer Sequenz zu den in SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Oligonukleotiden oder einer Nukleinsäure nach A) und B).

Eine weiterführende Definition der Derivate wird weiterhin in den „Ausführungsformen” beschrieben.
Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
Als Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT) im Sinne der Erfindung gelten alle dem Fachmann bekannten Technologien zur Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen. Unter den Begriff fallen insbesondere, aber nicht ausschließlich, Verfahren auf Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR), Multiple-Displacement Amplification (MDA), Strand-Displacement Amplification (SDA), Isothermal Multiple-Displacement Amplification (IMDA), Gibson Assembly, Recombinase Polymerase Amplification (RPA), Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), Helicase-dependent Amplification (HDA), Rolling Circle Amplification (RCA), Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR), Nicking Endonuclease Signal Amplification (NESA), Nicking Endonuclease Assisted Nanoparticle Activation (NENNA), Hybridisierungskettenreaktion (HCR) und Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA).
Nachweis- und Auswerteverfahren
Dem Fachmann stehen verschiedene Methoden zur Auswertung eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens zur Verfügung. Zu diesen zählen insbesondere, aber nicht ausschließlich, die Echtzeit-Detektion, digitale Endpunktauswertung (z. B. ddPCR), Elektrophorese, Sequenzierung (z. B. Sanger-Sequenzierung, sog. „Sequenzierung der zweiten Generation”, Nanoporen-Sequenzierung), Durchflusszytometrie und elektrochemische Detektion.
Multiplex-PCR/Multiplex-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
Mit Multiplex-PCR wird eine PCR-Reaktion bezeichnet, in welcher mehr als zwei Primer zum Einsatz kommen, oder zwei Primer, welche nicht wie ein zusammengehöriges Vorwärts-/Rückwärts-Primerpaar eingesetzt werden. Bei Anwesenheit aller Zielsequenzen in der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion werden damit mindestens zwei Amplifikate gebildet. Diese Amplifikate unterscheiden sich zumindest in den Primer-Binderegionen, es kann sich aber auch um unterschiedliche Sequenzen handeln.
Wird diesem Prinzip nicht die PCR sondern ein anderes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren zugrunde gelegt, so spricht man allgemeiner von Multiplex-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren.
Echtzeit-Detektion
In der erfindungsgemäßen Definition stellt „Echtzeit-Detektion” die simultane Ausführung zweier Prozesse dar: Der Nachweis von DNS oder RNS und ein Verfahren zur Detektion dieser DNS oder RNS. Teil des Prozesses kann beispielsweise die Freisetzung von DNS/RNS aus Zellen, die Aufreinigung von DNS/RNS aus komplexem Probenmaterial oder die Amplifikation von Polynukleotiden sein. Unter Detektion ist die Aufzeichnung eines Signals zu verstehen, welches zumindest mit der Anwesenheit, besser mit der exakten Menge, vorhandener DNS oder RNS in der Reaktion korreliert. In Kombination mit einer NAT ist eine Zunahme des Signals mit der fortschreitenden Amplifikation der Zielsequenz zu erwarten. Im speziellen Fall der Kombination von PCR mit Echtzeit-Detektion spricht man von Echtzeit-PCR. Echtzeit-Detektion und -PCR kann auch auf miniaturisierten Geräten durchgeführt werden, z. B. Biochips.
In einer Ausführung wird das Signal durch fluoreszenzmarkierte Sonden generiert. Dem Fachmann sind weitere Methoden bekannt, insbesondere, aber nicht ausschließlich, die Generierung eines Signals über interkalierende Farbstoffe, elektrochemische Sonden, Nanopartikel, radioaktive Moleküle oder enzymatische Farb- und Fluoreszenzreaktionen. Bei einigen Methoden kann eine Schmelzkurvenanalyse zur Absicherung der Ergebnisse erfolgen.
Der Begriff „Echtzeit” ist hierbei synonym mit „Online”.
Biochip
Unter „Biochip” ist eine technische Lösung zur Ausführung von Nukleinsäureanalysen im Miniaturformat und/oder im Hochdurchsatzformat zu verstehen. Dem Fachmann sind verschiedene Ausführungsformen bekannt, insbesondere, aber nicht ausschließlich, Microarrays, PCR-Arrays und Mikrofluidik-Chips.
Schmelzkurven und Schmelzpunkt
Erfindungsgemäß wird als Schmelzkurve bzw. deren Analyse der folgende Prozess definiert. Erhitzen einer DNS-haltigen Probe bis zu einer kritischen Temperatur, welche zur Denaturierung der DNS führt; kühlen der Probe auf eine Temperatur unterhalb der Anlagerungstemperatur der DNS bzw. einer Sonde; kontrolliertes Erhitzen der Probe bei gleichzeitiger Messung („Echtzeit”-, „Online”-Detektion) der Dissoziation der DNS voneinander bzw. der Sonde von der DNS. Als Messung ist das Ablesen eines Signals zu verstehen, welches sich proportional zur dissoziierten oder noch nicht dissoziierten DNS verhält. Im Fall einer der PCR nachgeschalteten Schmelzkurvenanalyse mit einer Hybridisierungssonde oder einem doppelstrangbindenden, interkalierenden Farbstoff verringert sich das Signal mit zunehmender Temperatur. Der Wendepunkt der aus dem Signalverlauf resultierenden Kurve ist als Schmelzpunkt oder Schmelztemperatur definiert. Der Schmelzpunkt einer Probe ist diejenige Temperatur, bei welcher die Hälfte der Sonde bzw. der doppelsträngigen DNS von der Ziel-DNS dissoziiert ist. Ebenso kann die erste Ableitung, bzw. deren negativer Wert, zur Berechnung und Darstellung des Schmelzpunktes verwendet werden. Der Schmelzpunkt ist hierbei das Minimum, bzw. das Maximum, der resultierenden Kurve. Eine Schmelzkurven- bzw. Schmelzpunktbestimmung kann in gleicher Weise auf miniaturisierten Instrumenten durchgeführt werden, z. B. Biochips.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt schematisch die Position und Sequenzpolarität der SEQ ID NOs 1–9 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus zur Zielsequenz der rDNA-Operons.
zeigt schematisch die Position und Sequenzpolarität der SEQ ID NOs 10–18 zum Nachweis von Vibrio vulnificus zu den Zielsequenzen der rDNA-Operons.
zeigt schematisch die Position und Sequenzpolarität der SEQ ID NOs 19–27 zum Nachweis von Vibrio cholerae zur Zielsequenz der rDNA-Operons.
zeigt Einzelwerte und Standardkurven (Trend) einer Echtzeit-PCR-Quantifizierung von DNS der Spezies Vibrio parahaemolyticus (Stamm BCD 16250; offene Rechtecke), Vibrio vulnificus (Stamm BCD 10119; offene Dreiecke) und Vibrio cholerae (Stamm BCD 16248; offene Kreise) zwischen 0,5 und 1.000.000 Genomkopien.
zeigt die Inhibition der DNS-Amplifikation von toten Vibrio parahaemolyticus in einer Echtzeit-PCR nach erfolgter EMA-Behandlung (gepunktete Linien). Je eine Anreicherung von getrockneten Algen (graue Linien) und Teigtaschen mit Garnelen (schwarze Linien) wurden mit 10⁶ KBE/ml toten Zellen dotiert. Eine Kontroll-Aufarbeitung ohne EMA-Behandlung (gestrichelte Linien) wurde mitgeführt.
zeigt die ungestörte DNS-Amplifikation von lebenden Vibrio parahaemolyticus in einer Echtzeit-PCR nach erfolgter EMA-Behandlung (gepunktete Linien). Je eine Anreicherung von getrockneten Algen (graue Linien) und Teigtaschen mit Garnelen (schwarze Linien) wurden mit 10⁶ KBE/ml lebensfähigen Zellen dotiert. Eine Kontroll-Aufarbeitung ohne EMA-Behandlung (gestrichelte Linien) wurde mitgeführt.
zeigt Einzelwerte und Standardkurven (Trend) einer Echtzeit-PCR-Quantifizierung von DNS-Extrakten aus Anreicherungskulturen mit Vibrio parahaemolyticus (Stamm BCD 16255; offene Rechtecke), Vibrio vulnificus (Stamm BCD 16470; offene Dreiecke) oder Vibrio cholerae (Stamm BCD 16297; offene Kreise). Die verwendeten Anreicherungen waren mit einer dezimalen Verdünnungsreihe von 10⁰ bis 10⁷ KBE/ml je Bakterienstamm dotiert.
Ausführungsformen

1. Ein Oligonukleotid als Primer oder Sonde zur spezifischen Detektion von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae, wobei i) das Oligonukleotid a) eine Teilsequenz einer der Sequenzen aus den SEQ ID NOs: 28–32 aufweist, wobei besagte Teilsequenz in mindestens 5, 10, 15 oder 20 Stämmen aus Tabelle 4 auftritt; b) zwischen 10–50, bevorzugt 15–40 und besonders bevorzugt 20–35 Nukleotide lang ist; und c) bevorzugt in 3–15, stärker bevorzugt in 4–13 und besonders bevorzugt in 5–11 Kopien je bakteriellem Genom vorkommt; ii) das Oligonukleotid a) eine Sequenz aufweist, welche unter spezifischen oder stringenten Bedingungen mit einem Oligonukleotid nach i) hybridisiert; und b) zwischen 10–50, bevorzugt 15–40 und besonders bevorzugt 20–35 Nukleotide lang ist; oder iii) das Oligonukleotid a) mindestens 70, 75, 80, 85, 90 oder 95% Sequenzidentität mit dem Oligonukleotid nach i) oder ii) aufweist, wobei die Sequenzidentität über Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20 oder 25, bevorzugt 10–50 und besonders bevorzugt 20–35, Nukleotiden Länge bestimmt wird; und b) zwischen 10–50, bevorzugt 15–40 und besonders bevorzugt 20–35 Nukleotide lang ist; oder iv) das Oligonukleotid eine komplementäre Sequenz zu einem Oligonukleotid nach einer der Ausführungsformen i) bis iii) aufweist.

Der Ausdruck „als Primer oder Sonde zur spezifischen Detektion” beschriebt die Eigenschaft eines Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen (55°C–70°C) bevorzugt oder ausschließlich mit einer der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae zu hybridisieren. Im Falle der Verwendung eines Oligonukleotids nach i) bis iv) als Sonde gewährleistet diese die spezifische Detektion der Nukleinsäure dieser Spezies. Im Falle der Verwendung eines Oligonukleotids nach i) bis iv) als Primer gewährleistet dieser die spezifische Amplifikation der Nukleinsäure dieser Spezies. Bevorzugte Oligonukleotide der Beschreibung „als Primer oder Sonde zur spezifischen Detektion” hybridisieren unter stringenten Bedingungen (55°C–70°C) mit keiner weiteren Spezies oder lassen in einer Kombination als Vorwärts- und Rückwärtsprimer nur eine Amplifikation der Nukleinsäuren der Zielspezies zu, aber sonst keiner weiteren Spezies.

2. Ein Oligonukleotid gemäß Ausführungsform 1, welches a) aus den SEQ ID NOs: 1–9 oder 10–18 oder 19–27 ausgewählt ist; b) eine Sequenz aufweist, welche unter spezifischen oder stringenten Bedingungen mit einem Oligonukleotid nach a) hybridisiert; c) mindestens 70, 75, 80, 85, 90 oder 95% Sequenzidentität mit dem Oligonukleotid nach a) oder b) aufweist, wobei die Sequenzidentität über Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20 oder 25, bevorzugt 10–50, besonders bevorzugt 15–40 und am bevorzugtesten 20–35, Nukleotiden Länge bestimmt wird; oder d) das Oligonukleotid eine komplementäre Sequenz zu einem Oligonukleotid nach einer der Ausführungsformen a) bis c) aufweist.
3. Ein Paar der erfindungsgemäßen Oligonukleotide, welches ein geeignetes Primerpaar zum Nachweis der Spezies i) Vibrio parahaemolyticus darstellt, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 1–9, aufweist; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9 aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 1–9 oder deren Derivaten ergänzt wird, bevorzugt durch 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 zusätzliche Primer, besonders bevorzugt durch 1, 2, 3, oder 4 zusätzliche Primer und am bevorzugtesten durch 1 oder 2 zusätzliche Primer; ii) Vibrio vulnificus darstellt, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 10–18, darstellt; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18 aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 10–18 oder deren Derivaten ergänzt wird, bevorzugt durch 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 zusätzliche Primer, besonders bevorzugt durch 1, 2, 3, oder 4 zusätzliche Primer und am bevorzugtesten durch 1 oder 2 zusätzliche Primer; i) Vibrio cholerae darstellt, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 19–27, darstellt; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27 aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 19–27 oder deren Derivaten ergänzt wird, bevorzugt durch 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 zusätzliche Primer, besonders bevorzugt durch 1, 2, 3, oder 4 zusätzliche Primer und am bevorzugtesten durch 1 oder 2 zusätzliche Primer.

Ein „Kombination nach Tabelle 1” ist eine Kombination von Sequenzen, wie sie in Tabelle 1 dargestellt ist, wobei die Kombination auch dann erfüllt ist, wenn statt einer Sequenz mit SEQ ID NO: X ein oder zwei Derivate von X verwendet werden. D. h. alle SEQ ID NOs: sind durch ihre erfindungsgemäßen Derivate ersetzbar.
Ein Primer des Paares wird bevorzugt als Vorwärtsprimer eingesetzt, der andere Primer als Rückwärtsprimer. Die Primer eines Paares können auch einzeln verwendet werden (Einzelprimer-Amplifikation).
Ein Derivat ist

In einer bevorzugten Ausführungsform dient das Primerpaar aus SEQ ID NOs: 2 und 5 oder aus SEQ ID NOs: 3 und 7 oder aus SEQ ID NOs: 4 und 9 dem Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, das Primerpaar aus SEQ ID NOs: 10 und 13 oder aus SEQ ID NOs: 14 und 18 oder aus SEQ ID NOs: 16 und 17 dem Nachweis von Vibrio vulnificus und das Primerpaar aus SEQ ID NOs: 20 und 27 oder aus SEQ ID NOs: 21 und 24 oder aus SEQ ID NOs: 19 und 26 dem Nachweis von Vibrio cholerae. Alle SEQ ID NOs: sind durch ihre erfindungsgemäßen Derivate ersetzbar.

4. Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Ausführungsformen 1 oder 2 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae.

Der bevorzugte Nachweis geschieht über Primerpaare gemäß Ausführungsform 3, besonders bevorzugt

a) mittels eines Primerpaars aus SEQ ID NOs: 2 und 5, aus SEQ ID NOs: 3 und 7 bzw. aus SEQ ID NOs: 4 und 9 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus; bzw.
b) eines Primerpaars aus SEQ ID NOs: 10 und 13, aus SEQ ID NOs: 14 und 18 bzw. aus SEQ ID NOs: 16 und 17 zum Nachweis von Vibrio vulnificus; bzw.
c) eines Primerpaars aus SEQ ID NOs: 20 und 27, aus SEQ ID NOs: 21 und 24 bzw. aus SEQ ID NOs: 19 und 26 zum Nachweis von Vibrio cholerae.

Den Primerpaaren kann jeweils ein weiterer dritter Primer optional beigefügt werden. Alle SEQ ID NOs: sind durch ihre erfindungsgemäßen Derivate ersetzbar.
Zusätzlich können Sonden mit einer Sequenz gemäß Ausführungsformen 1 oder 2 zur Detektion eingesetzt werden, besonders bevorzugt SEQ ID NO: 5 oder 8 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, SEQ ID NO: 11 oder 17 zum Nachweis von Vibrio vulnificus und SEQ ID NO: 22 oder 24 zum Nachweis von Vibrio cholerae. Alle SEQ ID NOs: sind durch ihre erfindungsgemäßen Derivate ersetzbar.

5. Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Ausführungsformen 1 oder 2 oder einem oder mehreren Primerpaaren gemäß Ausführungsform 3 zum Multiplex-Nachweis a) von Vibrio parahaemolyticus und Vibrio vulnificus; oder b) von Vibrio parahaemolyticus und Vibrio cholerae; oder c) von Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae; oder d) von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae.
6. Ein kommerzielles Produkt (Kit), welches a) ein Oligonukleotid gemäß Ausführungsformen 1 oder 2; b) ein Primerpaar gemäß Ausführungsform 3; oder c) mehrere Sequenzen in einer Kombination wie in Ausführungsform 4 beschrieben, enthält.
7. Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Ausführungsform 1 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder zur Unterscheidung von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae gegenüber artverwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Vibrio.

Bevorzugt ist die Unterscheidung gegenüber 5, 10, 20 oder allen Spezies aus Tabelle 5; am bevorzugtesten ist die Unterscheidung gegenüber Vibrio alginolyticus und/oder Vibrio mimicus.

8. Ein Verfahren zur Amplifikation bakterieller Nukleinsäuren von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder ein Verfahren zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae in einer Probe, wobei a) die bakterielle Nukleinsäure in der Probe RNS oder DNS ist, besonders bevorzugt jedoch DNS; und b) die bakteriellen Nukleinsäuren von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder ihre Teilsequenzen in einem Amplifikationsschritt mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Primern amplifiziert werden.
9. Das Verfahren von Ausführungsform 8, wobei die Primer im Amplifikationsschritt der Ausführungsform 8 Oligonukleotide gemäß Ausführungsformen 1 und 2, ein Primerpaar gemäß Ausführungsform 3, oder eine Kombination von Sequenzen wie in Ausführungsform 4 genannt, darstellen.

Das Verfahren ist zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder zur Unterscheidung von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae gegenüber artverwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Vibrio, geeignet.

10. Das Verfahren gemäß Ausführungsform 8 oder 9, wobei eine Sonde zur spezifischen Detektion von Nukleinsäuren der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae a) während eines Amplifikationsschrittes; und/oder b) in einem getrennten Detektionsschritt eingesetzt wird; wobei die Sonde in Schritt a) oder b) ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß Ausführungsformen 1 und 2, bevorzugt ausgewählt aus SEQ ID NOs: 3–8, SEQ ID NOs: 11 und 12, SEQ ID NOs: 15–17 und SEQ ID NOs: 20–26, oder besonders bevorzugt SEQ ID NOs: 5, 8, 11, 17, 22 und/oder 24 ist.

Bevorzugt sind Sonden, wie in Ausführungsform 4 beschrieben.

11. Das Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 8 bis 10, wobei der Amplifikationsschritt ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren umfasst.
12. Das Verfahren gemäß Ausführungsform 11, wobei das Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren die PCR ist.
13. Das Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 8 bis 12, welches zusätzlich eine Southern-Blot-Hybridisierung umfasst.
14. Das Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 8 bis 13, wobei ein modifiziertes Oligonukleotid als Sonde zum Einsatz kommt, sodass dieses Oligonukleotid in analytischen Detektionsverfahren als Signal oder Signalgeber genutzt werden kann, wobei es sich bei der Modifikation um eine oder mehrere (i) radioaktive Gruppen, (ii) Gruppen zum indirekten Farbnachweis, (iii) fluoreszierende Gruppen, (iv) chemilumineszente Gruppen, (v) elektrochemische Gruppen, (vi) Nanopartikel, (vii) Gruppen zur Anheftung auf Oberflächen, (viii) Gruppen, welche eine direkte oder indirekte Nachweisreaktion mithilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Bindungsaffinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen ermöglichen, handeln kann.
15. Das Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 8 bis 14, welches zur direkten Quantifizierung der Keimzahlen von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae in einer Probe genutzt werden kann.
16. Das Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 8 bis 15, welches ein Verfahren zur Unterscheidung lebender gegenüber toter Bakterien beinhaltet, wobei das Verfahren i) auf in die Nukleinsäure interkalierenden Substanzen basiert und a) die Substanz Ethidiummonoazid-Bromid (EMA) ist; oder b) die Substanz Propidiummonoazid (PMA) ist; oder ii) auf der Aktivität von Nukleasen basiert, wobei die Nuklease c) eine Endonuklease ist, bevorzugt eine DNase, RNase A oder RNase III; oder d) eine Exonuklease ist.

Beispiele
Beispiel 1

Die Durchführbarkeit der spezifischen Amplifikation von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae mittels der erfindungsgemäßen Sequenzen wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR getestet. Genomische DNS wurde von je einem Stamm je Spezies isoliert, photometrisch quantifiziert, und auf definierte Anzahlen von Genomkopien (1 Genomkopie ≈ 5 Femtogramm DNS) geeicht. Es wurden die Stämme entsprechend Tabelle 2 mit je 0,25, 0,5, 1, 10, 100, 1.000, 10.000, 100.000 und 1.000.000 Genomkopien je PCR-Reaktion verwendet. Tabelle 2 – Liste der verwendeten Stämme in Beispiel 1

Stamm	Spezies	Serotyp	Ursprung
BCD 16250	Vibrio parahaemolyticus	unbekannt	Meerwasser, Spanien
BCD 10119	Vibrio vulnificus	unbekannt	Blutprobe, USA
BCD 16248	Vibrio cholerae	Serotyp O1 Serovar Inaba	Patient, Kairo, Ägypten

Je zu testender Probe wurde ein PCR-Mix mit 25 μl Reaktionsvolumen vorbereitet:
300 nM des Primers SEQ ID NO: 3
300 nM des Primers SEQ ID NO: 7
200 nM der Sonde SEQ ID NO: 6
als bevorzugte Kombination zum spezifischen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus. Die Auswahl ist exemplarisch aus den SEQ ID NOs: 1–9 getroffen, auch weitere Kombinationen eignen sich zum erfindungsgemäßen Nachweis.
300 nM des Primers SEQ ID NO: 10
300 nM des Primers SEQ ID NO: 13
200 nM der Sonde SEQ ID NO: 11
als bevorzugte Kombination zum spezifischen Nachweis von Vibrio vulnificus. Die Auswahl ist exemplarisch aus den SEQ ID NOs: 10–18 getroffen, auch weitere Kombinationen eignen sich zum erfindungsgemäßen Nachweis.
300 nM des Primers SEQ ID NO: 20
300 nM des Primers SEQ ID NO: 27
200 nM der Sonde SEQ ID NO: 22
als bevorzugte Kombination zum spezifischen Nachweis von Vibrio cholerae. Die Auswahl ist exemplarisch aus den SEQ ID NOs: 19–27 getroffen, auch weitere Kombinationen eignen sich zum erfindungsgemäßen Nachweis.
4 mM MgCl2 (Sigma Aldrich)
200 μM dATP, dTTP, dCTP, dGTP (Roche)
1 U FastStart^TM Taq DNA Polymerase (Roche)
PCR-Puffer 1 × konz. (Roche)
5 μl Probe
In diesem Ansatz waren die Sonde der SEQ ID NO: 6 am 5' Terminus mit FAM und am 3' Terminus mit BHQ1, die Sonde der SEQ ID NO: 11 am 5' Terminus mit HEX und am 3' Terminus mit BHQ1, die Sonde der SEQ ID NO: 22 am 5' Terminus mit ROX und am 3' Terminus mit BHQ2 modifiziert.
Die PCR-Ansätze wurden anschließend auf einem LightCycler^© 480 Gerät (Roche) folgendem Echtzeit-PCR-Protokoll unterzogen:

Denaturierung 1 Zyklus

95°C 5 Min

Amplifikation 45 Zyklen

95°C 15 Sek

58°C 30 Sek

72°C 30 Sek Fluoreszenzmessung

Elongation 1 Zyklus

72°C 5 Min

¹ Im Sinne der Definition der „stringenten Hybridisierungsbedingungen” dieser Anmeldung liegt die Hybridisierungstemperatur bzw. der Schmelzpunkt zwischen 55 und 70°C.
Die Ergebnisse in legen die sensitive Quantifizierbarkeit von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae mit dem beschriebenen Echtzeit-PCR-Verfahren dar. Der lineare Bereich der Quantifizierbarkeit von Vibrio parahaemolyticus und Vibrio cholerae liegt zwischen 0,25 bis mindestens 1.000.000 Genomäquivalenten. Der lineare Bereich der Quantifizierbarkeit von Vibrio vulnificus liegt zwischen 0,5 bis mindestens 1.000.000 Genomäquivalenten. Die Standardkurve des Nachweissystems für Vibrio parahaemolyticus weist dabei eine Steigung von –3,0994 (Amplifikationseffizienz von 107,3%) mit einem Bestimmtheitsmaß R² = 0,997 auf. Die Standardkurve des Nachweissystems für Vibrio vulnificus weist dabei eine Steigung von –3,1591 (Amplifikationseffizienz von 110,2%) mit einem Bestimmtheitsmaß R² = 0,995 auf. Die Standardkurve des Nachweissystems für Vibrio cholerae weist dabei eine Steigung von –3,1131 (Amplifikationseffizienz von 109,5%) mit einem Bestimmtheitsmaß R² = 0,998 auf.
Beispiel 2

Die Fähigkeit des in Beispiel 1 beschriebenen Multiplex-Echtzeit-PCR-Systems, alle bekannten Stämme der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, oder Vibrio cholerae nachzuweisen, wurde stichprobenartig untersucht. Eine in silico Analyse der öffentlich zugänglichen Genomsequenzen der drei Spezies auf der Datenbank des National Center for Biotechnology Information NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) mittels eines BLAST-Algorithmus ergab eine vollständige und spezies-spezifische Abdeckung bekannter Sequenzen durch die erfindungsgemäßen Primer und Sonden der SEQ ID NOs: 1–9, SEQ ID NOs: 10 18 und SEQ ID NOs: 19–27. Die zum Abgleich herangezogenen Sequenzen sind mit Stand vom 16.06.2015 in Tabelle 3 gelistet. Tabelle 3: Zur in silico Analyse mit BLAST herangezogene Sequenzen

Spezies	Assembly	Spezies	Assembly
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000328405.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000786845.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000430405.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000786855.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000430425.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000786865.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000568495.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000960645.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000154045.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000960655.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000388025.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000960665.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000500105.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_000975195.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000500755.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_001006105.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000510585.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_001006115.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000510605.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_001006125.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000516875.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_001006185.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000519365.1	Vibrio parahaemolyticus	GCA_001006195.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000519385.1	Vibrio vulnificus	GCA_000039765.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000519405.1	Vibrio vulnificus	GCA_000186585.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000521825.1	Vibrio vulnificus	GCA_000746665.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000522005.1	Vibrio vulnificus	GCA_000342305.2
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000522025.1	Vibrio vulnificus	GCA_000009745.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000522045.1	Vibrio cholerae	GCA_000016245.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000522065.1	Vibrio cholerae	GCA_000021605.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000524535.1	Vibrio cholerae	GCA_000021625.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000525005.1	Vibrio cholerae	GCA_000022585.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000558885.1	Vibrio cholerae	GCA_000166455.2
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000558905.1	Vibrio cholerae	GCA_000195065.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000558925.1	Vibrio cholerae	GCA_000250855.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000571915.1	Vibrio cholerae	GCA_000275645.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000582905.1	Vibrio cholerae	GCA_000765415.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000593285.1	Vibrio cholerae	GCA_000829215.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000593305.1	Vibrio cholerae	GCA_000963555.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000593325.1	Vibrio cholerae	GCA_000969235.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000593345.1	Vibrio cholerae	GCA_000969265.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000593365.1	Vibrio cholerae	GCA_000338075.1
Vibrio parahaemolyticus	GCA_000786835.1	Vibrio cholerae	GCA_000818865.1
		Vibrio cholerae	GCA_000967785.1

Zusätzlich wurde eine repräsentative Auswahl von 25–50 Stämmen je Spezies getroffen und hiervon die DNS nach Standardmethoden extrahiert. Tabelle 4 listet die Ergebnisse dieser Untersuchung, wobei der spezifische Nachweis von Vibrio parahaemolyticus im Fluoreszenzkanal FAM, der spezifische Nachweis von Vibrio vulnificus im Fluoreszenzkanal HEX und der spezifische Nachweis von Vibrio cholerae im Fluoreszenzkanal ROX erwartet wird. Tabelle 4 – Ergebnisse einer Testung von DNS-Extrakten von je 25 oder 50 repräsentativen Stämmen der Nachweis-Spezies mit dem Multiplex-Echtzeit-PCR-System aus Beispiel 1 (Inklusivität)
In allen Fällen wurde mit dem Nachweissystem für die jeweilige Spezies eine eindeutige PCR-Amplifikation (+) in dem dafür vorgesehenen Fluoreszenzkanal beobachtet. Es wurde keine PCR-Amplifikation (–) in nicht für den Nachweis vorgesehenen Fluoreszenzkanälen beobachtet. Das Verfahren ist somit für den umfassenden und spezifischen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae geeignet.
Beispiel 3
Die Möglichkeit einer Falschidentifizierung einer anderen Spezies als Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, oder Vibrio cholerae als eine der Nachweisspezies durch das in Beispiel 1 beschriebene Multiplex-Echtzeit-PCR-System wurde untersucht. Eine in silico Analyse wurde auf öffentlich zugängliche Nukleotidsequenzen der Datenbank des National Center for Biotechnology Information NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mittels des BLAST-Algorithmus „blastn” durchgeführt. Mit Datum zum 16.06.2015 wurde die Datenbank „Nucleotide collection (nr/nt)” durchsucht unter Wiedergabe von maximal 5000 Sequenzen. Im Ergebnis ist auszuschließen, dass eine der der von uns offenbarten Kombinationen der SEQ ID NOs: 1–27 in Tabelle 1 zu unspezifischer Amplifikation von anderen Spezies führen kann.
Dies wurde zusätzlich mittels Testung einer repräsentativen Auswahl von 55 Nicht-Zielspezies überprüft. Die DNS wurde nach Standardmethoden aus Reinkulturen dieser Spezies extrahiert. Tabelle 5 listet die Ergebnisse dieser Untersuchung, wobei der spezifische Nachweis von Vibrio parahaemolyticus im Fluoreszenzkanal FAM, der spezifische Nachweis von Vibrio vulnificus im Fluoreszenzkanal HEX und der spezifische Nachweis von Vibrio cholerae im Fluoreszenzkanal ROX erwartet wird. Tabelle 5 – Ergebnisse einer Testung von DNS-Extrakten 55 repräsentativer Nicht-Zielspezies mit dem Multiplex-Echtzeit-PCR-System aus Beispiel 1 (Exklusivität)
In allen Fällen wurde mit dem unter Beispiel 1 beschriebenen Nachweissystem keine PCR-Amplifikation (–) für eine der Nicht-Nachweisspezies über alle Fluoreszenzkanäle beobachtet. Das Verfahren ist somit für den spezifischen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae geeignet.
Beispiel 4
Verschiedene Lebensmittel wurden entsprechend ISO/TS 21872-1:2007 in ASPW angereichert. Proben wurden nach Ende der Anreicherungszeit entnommen und mit 5 × 10⁵ KBE/ml Vibrio parahaemolyticus dotiert. Von diesen Suspensionen wurde ein Volumen von 2 ml in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen in diesen Aliquoten wurden anschließend bei 70°C für eine Gesamtdauer von 10 Minuten abgetötet, hiervon jeweils 100 μl auf TCBS-Agar ausplattiert, und nach 24 Stunden Bebrütung bei 37°C das Ausbleiben bakteriellen Wachstums bestätigt.
Die DNS toter Zellen wurde durch Behandlung mit Ethidiummonoazid-Bromid (EMA) für das PCR-Verfahren unbrauchbar gemacht. Je dotierter, hitzebehandelter Probe aus den Lebensmittelanreicherungen wurden 500 μl entnommen, in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt, und per Zentrifugation bei 13.000 g für fünf Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 200 μl einer wässrigen 20 μg/ml EMA-Lösung aufgenommen. Die Gemische wurden für fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert, danach für weitere fünf Minuten eisgekühlt in 15–20 cm Abstand dem Licht einer 500 W Halogenlampe ausgesetzt. Die Zellen in den Gemischen wurden sodann erneut per Zentrifugation gesammelt, der Überstand verworfen, und das Pelltet abermals in 200 μl der wässrigen 20 μg/ml EMA-Lösung in Suspension gebracht. Hierauf folgte eine weitere Inkubation für fünf Minuten unter Lichtausschluss und fünf Minuten bei Lichteinwirkung. Die in den Gemischen enthaltenen Zellen wurden abermals über Zentrifugation für fünf Minuten bei 13.000 g in einer Mikrozentrifuge pelletiert, der Überstand verworfen. Schließlich wurden die Zellen für zehn Minuten in 200 μl Lysepuffer bei 95–100°C aufgeschlossen, um die DNS freizusetzten. DNS wurde auch aus Kontrollproben ohne EMA-Behandlung nach demselben Verfahren isoliert.
PCR-Mix und -Reaktionsbedingungen entsprachen den Angaben aus Beispiel 1. Die Ergebnisse für Proben mit abgetöteten Zellen sind in dargestellt. Die Ergebnisse für Proben mit lebenden Zellen sind in dargestellt.
Wie aus hervorgeht, verhindert die Behandlung mit EMA den Nachweis von DNS aus Zellen abgestorbener Vibrio parahaemolyticus. Während bei unbehandelten Proben deutliche Fluoreszenzkurven zu erkennen sind, bleibt die Amplifikation bei behandelten Proben aus. Im Gegensatz dazu ist der Nachweis von DNS aus Zellen lebensfähiger Vibrio parahaemolyticus kaum beeinträchtigt, wie aus hervorgeht. Die Verläufe der Fluoreszenzkurven von behandelten wie unbehandelten Proben zeigen nur minimale Unterschiede, was auf nahezu identische Amplifikation schließen lässt. Das erfindungsgemäße Nachweissystem lässt sich daher mit EMA basierten Methoden kombinieren, um einen sicheren und sensitiven Nachweis ausschließlich auf lebensfähige Zellen zu führen.

Zusätzlich wurde die EMA-Behandlung auf Anreicherungen von natürlich mit toten Vibrio kontaminierten Lebensmitteln getestet. Aus gewöhnlicher Handelsware wurden je eine Packung gekochter Muscheln, japanischer Aonori sowie chinesischer „Dim Sum” Teigtaschen mit Krabben gewählt, welche mit DNS bzw. toten Zellen einer oder mehrerer Spezies von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae kontaminiert waren. Eine repräsentative Menge dieser Lebensmittel wurde entsprechend ISO/TS 21872-1:2007 in ASPW angereichert, die DNS-Extraktion wie beschrieben sowohl mit als auch ohne EMA-Behandlung durchgeführt. Dass es sich tatsächlich um abgestorbene Zellen handelte, wurde mit einer Doppelbestimmung von 50 μl Anreicherung auf TBCS-Agar mit Bebrütung bei 37°C überprüft. Nach einer Bebrütungsdauer von 24 Stunden waren keine charakteristischen Kolonien nachzuweisen. Die Ergebnisse der Echtzeit-Multiplex-PCR auf die DNS-Extrakte sind in Tabelle 6 gelistet. Die EMA-Behandlung führte bei allen Proben zur Eliminierung der Amplifikation von toten Vibrio. Tabelle 6 – Inhibition der DNS-Amplifikation über Echtzeit-PCR in natürlich mit toten Zellen von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae belasteten Lebensmitteln. n. d. = nicht detektiert

Nachweis-Spezies:	Vibrio parahaemolyticus		Vibrio vulnificus		Vibrio cholerae
Echtzeit-PCR-Kanal:	FAM		HEX		ROX
	Cp-Wert		Cp-Wert		Cp-Wert
Lebensmittel	ohne EMA-Behandlung	mit EMA-Behandlung	ohne EMA-Behandlung	mit EMA-Behandlung	ohne EMA-Behandlung	mit EMA-Behandlung
Muscheln Aonori Dim Sum	31,26 31,78 32,93	n. d. n. d. n. d.	n. d. n. d. 40,09	n. d. n. d. n. d.	n. d. 35,92 n. d.	n. d. n. d. n. d.

Die Behandlung mit EMA nach dem beschriebenen Verfahren ist somit geeignet, die Amplifikation der DNS von toten Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae in Proben von Lebensmittelanreicherungen zu unterbinden.
Beispiel 5
Es wurde die Quantifizierbarkeit von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Echtzeit-PCR-System direkt in Lebensmittelproben evaluiert. Die DNS-Extraktion mit EMA-Behandlung erfolgte analog zu dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren.
Zunächst wurde ein Quantifizierungsstandard mit DNS-Extrakten erstellt, welche aus mit 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ und 10⁶ KBE/ml von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae dotierten ASPW-Suspension gewonnen wurden. Die so erhaltenen Eichkurven sind in dargestellt.
Die Ergebnisse in legen die sensitive Quantifizierbarkeit von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae in Realproben mit den beschriebenen Echtzeit-PCR- und EMA-DNS-Extraktionsverfahren dar. Der lineare Bereich der Quantifizierbarkeit von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae liegt zwischen 1 bis mindestens 10.000.000 KBE je Milliliter. Die Standardkurve der Quantifizierung für Vibrio parahaemolyticus weist dabei ein Bestimmtheitsmaß R² = 0,994 auf. Die Standardkurve des Nachweissystems für Vibrio vulnificus weist dabei ein Bestimmtheitsmaß R² = 0,991 auf. Die Standardkurve des Nachweissystems für Vibrio cholerae weist dabei ein Bestimmtheitsmaß R² = 0,997 auf.
Anhand der erhaltenen Standardkurven wurde Vibrio parahaemolyticus auf mit definierten Titern beimpften Garnelen (Litopenaeus vannamei) quantifiziert. Hierzu wurden die Bakterien mit neun Äquivalenten ASPW von der Lebensmittelmatrix abgeschwemmt, sodass die Bakterienkonzentration in der Abschwemmung einem Zehntel der ursprünglichen Kontamination entsprach (z. B. ein Ergebnis von 10 KBE/ml ≈ 100 KBE/g). Parallel dazu wurde Vibrio parahaemolyticus auf denselben beimpften Proben mit einem Titerverfahren (MPN-PCR) sowie einem Koloniehybridisierungsverfahren gemäß der im Bacteriological Analytical Manual (8th Edition, Revision A, 1998, Chapter 9: Vibrio) beschriebenen Verfahrensweisen quantitativ bestimmt. Für das Koloniehybridisierungsverfahren und das erfindungsgemäße quantitative Echtzeit-PCR-Verfahren wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt. Die MPN-PCR-Bestimmung wurde einmalig über einen 9-Röhrchen-Ansatz realisiert.

Wie Tabelle 7 zeigt, bestand eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse des quantitativen Ergebnisses des Echtzeit-PCR-Verfahrens zu den ermittelten Ausgangstitern sowie zu den Ergebnissen der anderen Verfahren. Die Quantifizierung über MPN-PCR wies dabei eine methodenspezifisch hohe statistische Unsicherheit mit breiten 95% Konfidenzintervallen auf. Bei geringen Ausgangtitern unterschätzten die Mittelwerte des MPN-Verfahrens die tatsächliche Bakterienzahl vermutlich aufgrund von Wahrscheinlichkeitseffekten. Die Bestimmung über Koloniehybridisierung versagte bei geringen Ausgangstitern, da sich Vibrio parahaemolyticus auf dem unselektiven Nähragar vermutlich nicht gegenüber der Begleitflora behaupten konnte. Das erfindungsgemäße Echtzeit-PCR-Verfahren hingegen erlaubte eine sehr genaue Titerbestimmung über alle relevanten Konzentrationsbereiche bis einschließlich 30 KBE/g. Tabelle 7 – Ermittlung der Keimzahl von Vibrio parahaemolyticus auf artifiziell kontaminierten Garnelen (Litopenaeus vannamei) mit verschiedenen quantitativen Verfahren. n. d. = nicht detektiert; OG = Obergrenze des 95% Konfidenzintervalls; UG = Untergrenze des 95% Konfidenzintervalls

Dotierung mit Vibrio parahaemolyticus	1000 KBE/g	250 KBE/g	30 KBE/g
Verfahren	Ermittelte KBE/g	Ermittelte KBE/g	Ermittelte KBE/g
Titerbestimmung über MPN-PCR	1100 (OG 4700/UG 260)	75 (OG 320/UG 18)	9,2 (OG 37/UG 2,3)
Koloniehybridisierung	1055 ± 235	200 ± 60	n. d.
Echtzeit-PCR	972 ± 19	240 ± 1	39 ± 1

Das erfindungsgemäße quantitative Echtzeit-PCR-Verfahren ist somit für die Lebendkeimzahlbestimmung von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae unter anderem auf Lebensmitteln geeignet. Es war dabei im Versuch den bestehenden Methoden überlegen. Die im Bereich der Lebensmittelanalytik relevanten Grenzwerte von 1000, 100 und sogar 30 KBE/g werden sicher erreicht, welches mit bisherigen Echtzeit-PCR-Verfahren nicht gewährleistet war.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Bacteriological Analytical Manual (8th Edition, Revision A, 1998, Chapter 9: Vibrio) [0133]

Claims

Ein Oligonukleotid als Primer oder Sonde zur spezifischen Detektion von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae, wobei i) das Oligonukleotid a) eine Teilsequenz einer der Sequenzen aus der SEQ ID NOs: 28–32 aufweist, wobei besagte Teilsequenz in mindestens 5 Stämmen aus Tabelle 4 auftritt; und b) zwischen 10–50 Nukleotide lang ist; ii) das Oligonukleotid c) eine Sequenz aufweist, welche unter spezifischen oder stringenten Bedingungen mit einem Oligonukleotid nach i) hybridisiert; und d) zwischen 10–50 Nukleotide lang ist; oder iii) das Oligonukleotid c) mindestens 70% Sequenzidentität mit dem Oligonukleotid nach i) aufweist, wobei die Sequenzidentität über Teilsequenzen von mindestens 10 Nukleotiden Länge bestimmt wird; und d) zwischen 10–50 Nukleotide lang ist; oder vi) das Oligonukleotid eine komplementäre Sequenz zu einem Oligonukleotid nach einer der Ausführungsformen i) bis iii) aufweist.
Ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, welches a) aus den SEQ ID NOs: 1–9 oder 10–18 oder 19–27 ausgewählt ist; b) eine Sequenz aufweist, welche unter spezifischen oder stringenten Bedingungen mit einem Oligonukleotid nach a) hybridisiert; c) mindestens 70% Sequenzidentität mit dem Oligonukleotid nach a) aufweist, wobei die Sequenzidentität über Teilsequenzen von mindestens 10 Nukleotiden Länge bestimmt wird; oder d) das Oligonukleotid eine komplementäre Sequenz zu einem Oligonukleotid nach einer der Ausführungsformen a) bis c) aufweist.
Ein Kit umfassend ein Primerpaar zum Nachweis der Spezies Vibrio parahaemolyticus, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 1–9, aufweist; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9, aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–9, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 1–9 oder deren Derivaten ergänzt wird.
Ein Kit umfassend ein Primerpaar zum Nachweis der Spezies Vibrio vulnificus, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 10–18, aufweist; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18, aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 10–18, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 10–18 oder deren Derivaten ergänzt wird.
Ein Kit umfassend ein Primerpaar zum Nachweis der Spezies Vibrio cholerae, wobei a) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 19–27, aufweist; oder b) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27, und einer Sequenz eines Derivats einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27, aufweist; oder c) das Primerpaar eine Kombination nach Tabelle 1, mit zwei Derivaten einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 19–27, aufweist; oder d) das nach a) bis c) gewählte Primerpaar durch zusätzliche Primer ausgewählt aus den SEQ ID NOs: 19–27 oder deren Derivaten ergänzt wird.
Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines oder mehreren Primerpaaren gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus oder Vibrio cholerae.
Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines oder mehreren Primerpaaren gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 zum Multiplex-Nachweis a) von Vibrio parahaemolyticus und Vibrio vulnificus; oder b) von Vibrio parahaemolyticus und Vibrio cholerae; oder c) von Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae; oder d) von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae.
Ein Kit, welcher a. ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2; b. ein Primerpaar gemäß Anspruch 3, 4 oder 5; oder c. mehrere Sequenzen in einer Kombination wie in Anspruch 6 oder 7 beschrieben, enthält.
Die Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder zur Unterscheidung von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae gegenüber artverwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Vibrio.
Ein Verfahren zur Amplifikation bakterieller Nukleinsäuren von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder ein Verfahren zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae in einer Probe, wobei A) die bakterielle Nukleinsäure in der Probe RNS oder DNS ist; und B) die bakteriellen Nukleinsäuren von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae oder ihre Teilsequenzen in einem Amplifikationsschritt mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Primern amplifiziert werden.
Das Verfahren von Anspruch 10, wobei die Primer im Amplifikationsschritt des Anspruch 10 Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 oder 2, ein Primerpaar gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 oder eine Kombination von Sequenzen wie in Anspruch 6 oder 7 genannt, darstellen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei eine Sonde zur spezifischen Detektion von Nukleinsäuren der Spezies Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae a) während eines Amplifikationsschrittes; und/oder b) in einem getrennten Detektionsschritt eingesetzt wird; wobei die Sonde in Schritt a) oder b) ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß Ansprüchen 1 und 2, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 3–8, SEQ ID NOs: 11 und 12, SEQ ID NOs: 15–17 und SEQ ID NOs: 20–26 bzw. die jeweiligen Derivate umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–12, welches zur direkten Quantifizierung der Keimzahlen von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und/oder Vibrio cholerae in einer Probe genutzt werden kann.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–13, welches ein Verfahren zur Unterscheidung lebender gegenüber toter Bakterien beinhaltet, wobei das Verfahren i. auf in die Nukleinsäure interkalierenden Substanzen basiert und die Substanz Ethidiummonoazid-Bromid (EMA) oder Propidiummonoazid (PMA) ist; oder ii. auf der Aktivität von Nukleasen basiert, wobei die Nuklease eine Endonuklease ist, bevorzugt eine DNase, RNase A oder RNase III; oder eine Exonuklease ist.