CN109504789A

CN109504789A - 用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN109504789A
Application number: CN201811652597.2A
Authority: CN
Inventors: 薛峰; 凌南; 戴建君; 申进玲; 蒋原; 曾德新; 任建鸾; 郭晶晶; 汤芳
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-03-22

Abstract

本发明公开了一种用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用。所述的检测试剂包括：引物对，包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；以及，探针，其序列如SEQ ID NO：1所示；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。本发明实施例提供的检测试剂、试剂盒在应用于检测副溶血弧菌时，具有特异性高、稳定性好等特点。

Description

用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种副溶血弧菌的检测方法，特别涉及一种用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

致病菌(Pathogenic bacteria)是指能引起疾病的微生物。致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌，致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病，而条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。

基于核酸扩增方式的分子检测方法广泛应用于致病菌的检测，其中荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)通过定量检测微生物DNA来确定微生物数量的一种快速、敏感性高的检测方法，但是该方法存在无法区分微生物死活的弊端。由于死菌的DNA能稳定并长期存在于污染样本中，其同样可以作为扩展模板被核酸扩增方法所检测到。

叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide，PMA)的叠氮基团在光作用下脱去-N₂，并嵌入 DNA双链发生共价交联。PMA带有正电荷，活细胞完整的细胞膜可以阻止其进入，但可穿入死细胞和膜损伤细胞与DNA进行结合，在光诱导作用下可与其DNA发生不可逆的共价交联。游离的PMA与H2O反应生成羟胺，发生钝化反应，钝化的PMA对DNA无影响。利用PMA 这一特性，可以进行活菌检测。

近年来，PMA结合PCR对假阳性PCR结果进行鉴别的技术已有报道，尤其是对革兰氏阴性菌，但技术方面的加强和改进还有待进一步发展。比如在引物探针的特异性重复性以及在 PMA处理的效果上并不是特别理想。

目前检测致病菌的常见方法有：平板培养法、信使RNA检测法。但这些方法操作复杂，耗时较长，信使RNA检测具有不稳定性，拷贝数较低，检测灵敏性差，重复性差，同时在提取过程中易被DNA污染，容易造成假阳性或假阴性。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测试剂，其包括：

引物对，包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQID NO： 2、SEQ ID NO：3所示；以及

探针，其序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括所述的检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还包括PCR扩增反应所需的辅助试剂、叠氮溴化丙锭、脱氧胆酸钠。

本发明实施例还提供了一种产品，其应用于副溶血弧菌活菌检测方法，所述产品包括所述的检测试剂或所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：

提供含有金副溶血弧菌的待测样品；

以叠氮溴化丙锭对待测样品进行预处理；

提取经预处理后所获的副溶血弧菌活菌中的核酸；

利用所述的引物对及探针，通过PCR扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内副溶血弧菌活菌的定性或定量检测。

进一步的，所述的检测方法还包括：先以洗涤剂对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理，所述洗涤剂能够破坏副溶血弧菌死亡细胞的细胞膜从而提高细胞膜的渗透性。

进一步的，所述的检测方法还包括：先以浓度为大于0但小于0.5wt％的所述洗涤剂的溶液对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理。

进一步的，所述洗涤剂为脱氧胆酸钠。

进一步的，所述的预处理包括：将来源于待测样品的副溶血弧菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理。

本发明实施例还提供了一种产品，其应用于革兰氏阴性菌活菌检测方法，所述的产品包括针对所述革兰氏阴性菌设计的引物对和探针，针对不同的革兰氏阴性采用的引物对和探针的序列可以自行设计或采用现有已知序列，并且所述的检测方法包括：

提供含有革兰氏阴性菌的待测样品；

以浓度为大于0但小于0.5wt％的洗涤剂的溶液对待测样品进行处理，所述洗涤剂为脱氧胆酸钠；

将来源于待测样品的革兰氏阴性菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理；

提取经预处理后所获的革兰氏阴性菌活菌中的核酸；

利用引物对及探针，通过PCR扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内革兰氏阴性菌活菌的定性或定量检测。

与现有技术相比，本发明实施例提供的检测试剂、试剂盒在应用于检测副溶血弧菌时，具有特异性高、稳定性好等特点，本发明实施例提供的检测方法具有简单、高特异、高灵敏、快速的优点。

附图说明

图1是本发明一典型实施案例中一种副溶血弧菌活菌的检测方法原理图；

图2是本发明实施例6中针对鱼肉样品内副溶血弧菌活菌的测试结果。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

如下将结合附图对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明一典型实施方案之中，请参阅图1所示，一种副溶血弧菌活菌的检测方法可以包括样品的核酸染料孵育处理、光照处理、核酸提取、PCR(例如qPCR)反应等步骤，其原理主要为：如果待测样品中含有目标致病菌的游离核酸或者死菌，那么脱氧胆酸钠(SD)洗涤剂的处理增加了死菌细胞膜的通透性，使得叠氮溴化丙锭(PMA)能够高效的与目标致病菌的游离核酸或者死菌相接触，经光照处理使其与核酸稳定结合，同时由于叠氮溴化丙锭(PMA)不能进入活菌内部，对活菌核酸成分没有影响。而与叠氮溴化丙锭(PMA)结合后的DNA分子不能作为核酸扩增的模板，因此对处理样本提取核酸后的qPCR检测到的信号来自活菌成分，达到对目标致病菌活菌进行定性或定量检测的目的。

前述的检测方法对于其它细菌，特别是革兰氏阴性菌属的活菌检测也是适用的，只需将对应于副溶血弧菌的引物对、探针替换为对应于其它细菌的引物对、探针即可。

如下将结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的解释说明。

本发明的如下实施例所使用的引物对及探针如下：

利用Primer Premier 5.0软件根据副溶血弧菌全基因组(AB029915.1)序列中保守性强的区域进行设计。

所设计的引物对序列为：ToxR-F(对应第一引物)：5’-CCTAAGCCCGCTTTCTTCAG-3’；ToxR-R(对应第二引物)：5’-ACGGCTCTACGATCGTTTCT-3’。

所设计的探针为Taqman探针，探针3’末端连接有荧光淬灭基团TAMARA，5’末端连接有荧光报告基团FAM；探针序列为：5’-AGCCAGCTTCTGATAACAATGACGCCT-3’。

本发明实施例中所使用的荧光定量PCR扩增条件如下：

(1)反应体系体积为20μL，具体配比为：

(2)反应程序为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性5s，62℃退火34s，40个循环。

本发明如下实施例中的副溶血弧菌(如下亦称病原菌)活菌的检测方法可以包括如下步骤：

(1)预处理：使用脱氧胆酸钠(SD)处理样品，增加死菌细胞膜的通透性；

(2)添加染料：加入叠氮溴化丙锭(PMA)，使其与病原菌游离核酸或进入死菌内部与其核酸成分结合；

(3)光照处理：对PMA处理后的样品进行光照处理，消除病原菌游离核酸或死菌核酸成分对核酸扩增反应的影响；

(4)核酸提取：样品处理完成后，利用细菌DNA提取试剂盒提取样品中的核酸；

(5)检测分析：通过qPCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物，从而进行定性或定量分析。

本发明如下实施例中中待测样品的孵育温度为37℃。

本发明如下实施例中所采用的PBS缓冲液成分如下：取137mmol NaCl、2.7mmolKCl、 10mmol Na₂HPO₄和2mmol KH₂PO₄溶于水，调节pH至7.4，用水定容至1L。

实施例1

本实验的特异性试验包括排他性以及包含性实验，其中排他性实验中主要针对弧菌的在内的10株非目的弧菌以及其他29株常见细菌，包含性实验主要针对副溶血弧菌样品的分离株70 株(Li JJ，2016，Vibrio parahaemoliticus Strains of PandemicSerotypes Identified from Clinical and Environmental Samples from Jiangsu，China)。以上109株菌株来进行本实验的特异性实验的检测。将细菌用营养肉汤在37℃下培养过夜后，采用TIANamp bacteria DNA kit(Tiangen Biotech) 试剂盒，按操作说明提取处理后的DNA。所得DNA模板用于qPCR分析。实验结果表明，在排他性实验中，均为阴性结果，在包含性实验中，均为阳性结果。结果如表1所示

表1为副溶血弧菌ToxR基因的特异性试验检测结果

实施例2

本实施例采用平板菌落计数对脱氧胆酸钠(SD)分别对活菌进行了处理，优化其添加量；通过制备10％(wt/vol)脱氧胆酸钠(SD)储备溶液，用0.1％(wt/vol)的蛋白胨水溶解1g 脱氧胆酸钠(SD)粉末；设计了四个脱氧胆酸钠(SD)的添加比例分别为0wt％，0.02wt％，0.04wt％，0.08wt％，0.1wt％，0.5wt％。在浓度为5.0×10⁶cfu/mL添加脱氧胆酸钠后利用旋转振荡器中以180rpm和37℃条件温育30分钟，稀释涂平板，结果表明，当脱氧胆酸钠添加量为 0.1％时，脱氧胆酸钠(SD)对副溶血弧菌活菌有杀菌作用；当脱氧胆酸钠(SD)添加比例不超过0.08％时，脱氧胆酸钠(SD)不会影响副溶血弧菌活菌数量，结果如表2所示。

表2是经不同浓度脱氧胆酸钠处理后的副溶血弧菌活菌数

其中：NC为阴性对照。*表示与阴性对照比较有显著差异(P＜0.05)

**表示与阴性对照比较有非常显著差异(P＜0.01)。

实施例3

本实施例通过qPCR方法对PMA浓度进行了优化。设计了五个PMA的参考浓度分别为80，50，40，30，20，10μM，取相同浓度(5.0×10⁶cfu/mL)的副溶血弧菌活菌和死菌各1 mL，在无光条件下孵育5min，然后在有光条件(BLU-V System，Qiagen，Germany)下，光照强度为60，孵育3min，样品C_T值显著提高，结果如表2所示。

结合表3中的数据可知，终浓度为40μM的PMA处理方法对副溶血弧菌活菌的选择性检测更有利。

表3为经不同浓度PMA处理后在死菌和活菌条件下副溶血弧菌活菌检测结果

其中：NC为阴性对照，*表示与阴性对照比较有显著差异(P＜0.05)

***表示与阴性对照比较有极显著差异(P＜0.001)

实施例4

本实施例采用qPCR对脱氧胆酸钠(SD)分别对死菌进行了处理，优化其添加量，通过制备10％(wt/vol)SD储备溶液，用0.1％(wt/vol)的蛋白胨水溶解1g SD粉末。设计了四个脱氧胆酸钠(SD)的添加比例分别为0wt％，0.02wt％，0.04wt％，0.08wt％，0.1wt％，0.5wt％。在浓度为5.0×10⁶cfu/mL添加脱氧胆酸钠(SD)后利用旋转振荡器中以180rpm和37℃温育30分钟，PMA处理，PMA至终浓度为40μM，在无光条件下孵育5min并间隔振荡，然后在有光条件光照强度60，孵育5min。采用TIANamp bacteria DNA kit(Tiangen Biotech)试剂盒，按操作说明提取处理后的样品DNA。所得DNA模板用于qPCR分析。结果显示当脱氧胆酸钠(SD)添加量为0.02wt％以及超过0.1wt％时，脱氧胆酸钠(SD)对副溶血弧菌死菌处理效果更好。由于在脱氧胆酸钠浓度在大于0.1wt％时，对活菌有杀菌作用，所以选择脱氧胆酸钠的最终适合浓度为0.02wt％。结果如表4所示。

表4是经不同浓度脱氧胆酸钠处理后的副溶血弧菌死菌CT值

实施例5

本实施例通过qPCR方法比较SD-PMA-qPCR和PMA-qPCR的区别，设计6组实验，活菌的阴性对照，死菌的阴性对照，SD-PMA分别处理活死菌以及PMA分别处理活死菌，取相同浓度(5.0×10⁶cfu/mL)的副溶血弧菌活菌和死菌各1mL，SD-PMA处理组SD的处理浓度为0.02wt％，旋转振荡器中以180rpm和37℃温育30分钟，再进行PMA处理，使用40μM，在无光条件下培养5min后在有光条件(BLU-V System，Qiagen，Germany)下，光照强度为60，孵育3min。结果如表5所示。结合表5中的数据可知，PMA结合SD处理方法对副溶血弧菌活菌的选择性检测更有利。

表5为不同处理方法处理后在死菌和活菌条件下副溶血弧菌活菌检测结果

其中：NC为阴性对照，同一行不同字母的值表示差异显著(P＜0.05)。

实施例6

本实施例通过如下试验对鱼肉中副溶血弧菌活菌进行了检测验证；将已知数量的副溶血弧菌(死菌、活菌)添加到鱼肉中，600×g离心5min去除脂肪和肉组织，取上清液后12000×g离心5min，去除上层液体；菌体沉淀用无菌PBS缓冲液洗涤三次，加入PBS缓冲液和0.02wt％脱氧胆酸钠重悬，37℃孵育30min；向管中加入PMA至终浓度为40μM，在无光条件下孵育5 min并间隔振荡，然后在有光条件光照强度60，孵育，5min；同时将活菌菌悬液以相同方法处理但不添加PMA作为阴性对照；12000×g离心1min，采用TIANamp bacteria DNA kit(Tiangen Biotech)试剂盒，按操作说明提取处理后的样品DNA；所得DNA模板用于qPCR分析，结果显示在不添加PMA的阴性对照组中，5.0×10³cfu/mL和5.0×10⁴cfu/mL死菌组的C_T值分别为 32.96和29.99；在添加PMA组中，5.0×10⁶cfu/mL死菌组的C_T值达到33.68，表明经PMA处理后死菌DNA被完全清除，同时也表明本方法能去除死菌DNA的菌体数限量为5.0×10⁶ cfu/mL。

为了验证qPCR检测副溶血弧菌活菌的灵敏度，将5.0×10⁶cfu/mL终浓度的死菌添加到 (25g鱼肉+225mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水)的样品中，然后加入活菌至终浓度为5.0×10⁷～10¹ cfu/mL。图2中分别标记(7-1)，SD-PMA-qPCR结果表明最低检出限(LOD)为5.0×10¹ cfu/mL(见图2)。

本发明使用了可特异性识别致病菌基因序列的扩增探针和引物对，因而具有特异性高、稳定性好的特点，本发明提供的检测方法还具有简单、快速、灵敏的优点。

此外，本发明的检测方法还适用于其它革兰氏阴性菌活菌或其它细菌活菌的特异性快速检测，只需要针对目标菌设计特异性扩增引物和识别探针即可实现，这是本案发明人经大量实验后验证的。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

agccagcttc tgataacaat gacgcct 27

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cctaagcccg ctttcttcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

acggctctac gatcgtttct 20

Claims

1.一种检测试剂，其特征在于包括：

引物对，包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3所示；以及

探针，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。

3.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-2中任一项所述的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增反应所需的辅助试剂、叠氮溴化丙锭、脱氧胆酸钠。

5.一种产品，其应用于副溶血弧菌活菌检测方法，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的检测试剂或权利要求3或4所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：

提供含有副溶血弧菌的待测样品；

以叠氮溴化丙锭对待测样品进行预处理；

提取经预处理后所获的副溶血弧菌活菌中的核酸；

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述的检测方法还包括：先以洗涤剂对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理，所述洗涤剂能够破坏副溶血弧菌死亡细胞的细胞膜从而提高细胞膜的渗透性。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述的检测方法还包括：先以浓度为大于0但小于0.5wt％的所述洗涤剂的溶液对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理。

8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于，所述洗涤剂为脱氧胆酸钠。

9.根据权利要求5-7中任一项所述的产品，其特征在于，所述的预处理包括：将来源于待测样品的副溶血弧菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理。

10.一种产品，其应用于革兰氏阴性菌活菌的检测方法，其特征在于，所述的产品包括针对所述革兰氏阴性菌设计的引物对和探针，并且所述的检测方法包括：

提供含有革兰氏阴性菌的待测样品；

提取经预处理后所获的革兰氏阴性菌活菌中的核酸；