CN105986029B - 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 - Google Patents
一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105986029B CN105986029B CN201510234801.9A CN201510234801A CN105986029B CN 105986029 B CN105986029 B CN 105986029B CN 201510234801 A CN201510234801 A CN 201510234801A CN 105986029 B CN105986029 B CN 105986029B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- escherichia coli
- negative control
- bacteria
- food
- shigella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 36
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 31
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 26
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 claims abstract description 25
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 45
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 7
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 5
- 241001543254 Escherichia coli O18 Species 0.000 description 5
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 5
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 5
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 5
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 4
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 3
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 3
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 208000010227 enterocolitis Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 101150114988 invA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 108010060924 tetrathionate reductase Proteins 0.000 description 2
- 101150066357 ttrA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150027375 virA gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000202296 Delphinium Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001476742 Escherichia coli IS5 Species 0.000 description 1
- 101100500479 Hafnia alvei eaeA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710198693 Invasin Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 235000004240 Triticum spelta Nutrition 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 101150099477 ail gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 101150107911 eae gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099846 eaeA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 101150021607 rppH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082821 sacA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 101150070603 yadA gene Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鉴定猪源食源菌大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和小肠结肠耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌食源菌的液态芯片方法，该方法是以提取待测细菌DNA为模板，用SEQ ID NO.1‑12所示的6对引物进行多重PCR扩增，扩增产物在与微球杂交后在Luminex 200仪器上检测，根据检测数值判定结果。本发明利用所合成的引物建立的液态芯片方法，可以在一个检测体系中检测出5种不同的可致食物中毒的食源菌，与在动物性食品微生物检验中传统的分离培养后进行生化、血清学试验的3‑7天时间比仅需要18‑24小时左右，大大缩短了检测时间，节省了人力物力，用于动物性产品食源菌污染检测的高通量的方法，在猪源动物产品污染食源菌溯源方面有重要意义，为餐桌上的安全提供保障。
Description
技术领域：
本发明涉及一种液态芯片技术同时检测6种猪源食源菌的检测方法，主要涉及大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌6种常见食源菌的高通量的检测方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌对人和动物具有广泛的致病性，是污染猪肉产品并引食物中毒的主要的食源性细菌，在公共卫生上具有重要意义。据WHO估计全球每年因食用微生物污染的食物和水导致200万人死亡。这些食源菌不仅威胁着人和动物的健康，而且造成了巨大的经济损失；为此，我国将这几种细菌的检验列为食品微生物检验中要求检验的项目。
对于大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法，传统的检测方法包括增菌、生化鉴定、血清学鉴定等，所需检验时间长。由于动物产品的保质期短、食源菌存在数量少的特殊性质，传统的挑取选择平板上可疑菌落的检测方法可能漏检、错检。因此，建立高灵敏度和高特异性的检测方法是提高动物产品食源菌检测水平的重要措施。
食源性致病菌的检测方法有：GB 4789.12010《食品微生物学检验》中的培养微生物后进行生化和血清型鉴定的检测方法；利用抗原抗体原理的酶联免疫吸附、乳胶凝集试验等的检测方法。随着分子生物学技术的快速发展，PCR、实时定量PCR及芯片技术等以灵敏度高、检测时间少等优点被应用到食品致病菌的检测。如，张键等以小肠结肠炎的16s rRNA和ail基因为目的基因建立了多重PCR快速检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌；程晓艳等建立了同时检测副溶血弧菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的多重PCR检测方法；范红英等应用多重PCR建立了沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、绿脓杆菌和副溶血弧菌检测方法。Liu Jie等建立了可同时检测腹泻病人粪便中气单胞菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌、弧菌和耶尔森氏菌6种导致腹泻的病原菌的液态芯片检测方法,。
液态芯片（Luminex xMAP）技术是把聚苯乙烯小球用荧光染色的方法编码，通过调节两种荧光染料的配比获得100种具有不同特征的荧光谱的微球，每种微球共价交联上针对特定检测物的核酸探针，在检测时，带有特异性核酸探针的编码微球混合，加入微量检测样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合后，用Luminex 200仪器通过两束激光分别识别微球的编码和微球上报告分子的荧光强度进行分析。液态芯片技术有机地整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有高通量、高速度、准确性高、灵敏度高、重复性好、线性范围广、无需洗涤、操作简便等优点。
发明内容：
本发明对检测猪源动物产品大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌的液态芯片方法，是在其他研究成果基础上针对这几种属和种特异性基因设计出特异性引物建立的检测方法。该方法在一个孔内可以快速鉴定出大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌。
本发明根据这几种菌的种属特异性，分别设计了大肠埃希氏菌recA基因、O157侵袭基因eaeA基因，沙门氏菌连四硫酸盐还原酶ttrA基因，志贺氏菌广泛调控基因virA，小肠结肠炎耶尔森氏菌侵袭基因invA和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因nuc的特异性引物，其中每对引物的上游引物带有与特定微球结合的标签序列，下游引物带有生物素标记。用引物对这几种菌分别进行单菌种的PCR扩增和多菌种的多重PCR扩增后与混合微球杂交，杂交30 min后在Luminex 200仪器进行分析，建立了液态芯片检测方法。
1.
2.引物设计
根据研究目的，经过同源性比较，以大肠埃希氏菌属特异性基因复制酶基因recA、O157侵袭素基因eaeA，沙门氏菌连四硫酸盐还原酶ttrA基因，志贺氏菌广泛调控基因virA基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌侵袭素invA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因nuc分别设计引物，引物序列如下所示：
2．细菌DNA的提取
（1）水煮法提取：取经过增菌培养的培养基1 mL在12,000 rpm离心5 min，沉淀用500 μL无菌生理盐水洗1 次后用100 μL无菌超纯水重悬，煮沸10 min，冰浴10 min，12,000rpm离心5 min取上清。
（2）细菌基因组DNA小量试剂盒提取
3.PCR扩增目的基因片段
配制25 μL体系：2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2 μM），dNTPs 1 μL，DNA模板5 μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95 °C预变性15 min后，94 °C变性30 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，循环35次，72 °C延伸7 min，产物在4 °C保存。
4.微球杂交
取5 μL 扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6 μg/mL）混合，在37 °C孵育杂交25-30 min。
5.Luminex 200仪器检测
打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建一个批次（batch），点击运行（run）按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：大肠埃希氏菌Escherichia和O157的是阴性对照5倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。
6.特异性试验
选取大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌O18、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡球菌和单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒提取DNA模板进行液态芯片方法的检测。检测结果判定根据如下：Escherichia和O157的是阴性对照6倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。而单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒的数值应与阴性对照的相差不大。
7.广谱性试验
选取非O157大肠埃希氏菌分离株、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、汤普逊沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、小肠结肠炎耶尔森菌进行猪源食源菌液态芯片检测法鉴定，结果为：Escherichia的是阴性对照6倍和O157的是阴性对照6倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。
本发明利用所设计合成的引物用于猪源动物产品的微生物检测的液态芯片方法可以在一个体系中检测数种食源菌，在食品微生物检测中较传统的增菌分离培养后进行生化鉴定和玻片血清凝集试验的3-7天时间比，仅需要18-24 h，大大缩短了检测时间。
附图表说明
图1 猪源食源菌液态芯片法特异性检测结果
图2 猪源食源菌液态芯片法广谱性检测结果
图3 猪源食源菌液态芯片法在猪肉中的检测结果
8.具体实施方式
下面结合图表和具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1：
（1）无菌操作挑取胰蛋白大豆胨平板大肠埃希氏菌O18、大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌单菌落。无菌操作挑取单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌单菌落，收集细小病毒、圆环病毒细胞培养物抽提DNA模板。
（2）水煮法提取DNA模板：
大肠埃希氏菌O18、大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌和链球菌菌落分别用500 μL无菌生理盐水洗1 次后用100 μL无菌超纯水重悬，煮沸10 min，冰浴10 min，12,000 rpm离心5 min取上清。
细小病毒、圆环病毒用Qiagen病毒DNA提取剂盒提取DNA模板。
（3）PCR扩增目的基因片段：
配制25 μL体系：2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2 μM），dNTPs 1 μL，DNA模板2 μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95 °C预变性15 min后，94 °C变性30 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，循环35次，72 °C延伸7 min，产物在4 °C保存。
（4）微球杂交：
取5 μL 扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6 μg/mL）混合，在37 °C孵育杂交25-30 min。
（5）Luminex 200仪器检测：
打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：大肠埃希氏菌O157的读数为Escherichia和O157是阴性对照100倍以上，非O157大肠埃希氏菌O18的读数只有Escherichia数值高于阴性对照100倍以上，志贺氏菌的读数是Escherichia和shigella 数值阴性对照50倍以上；沙门氏菌的Sallmonella的数值是阴性对照30倍以上；小肠结肠耶尔森氏菌的Yersinina数值高于阴性对照90倍以上，金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值高于阴性对照200倍以上。而单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒的数值与阴性对照的相差不大。
实施例2
（1）无菌操作挑取非O157大肠埃希氏菌分离株、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、大肠埃希氏菌O157和小肠结肠炎耶尔森菌进行猪源食源菌液态芯片方法检测。
（2）水煮法提取DNA模板：
无菌操作挑取胰蛋白大豆胨平板上非O157大肠埃希氏菌分离株、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、大肠埃希氏菌O157和小肠结肠炎耶尔森菌分别用500 μL无菌生理盐水洗1次后用100 μL无菌超纯水重悬，煮沸10 min，冰浴10 min，12,000 rpm离心5 min取上清。
（3）PCR扩增目的基因片段：
配制25 μL体系：2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2 μM），dNTPs 1 μL，DNA模板2 μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95 °C预变性15 min后，94 °C变性30 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，循环35次，72 °C延伸7 min，产物在4 °C保存。
（4）微球杂交：
取5 μL 扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6 μg/mL）混合，在37 °C孵育杂交25-30 min。
（5）Luminex 200仪器检测：
打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：非O157大肠埃希氏菌分离株的读数只有Escherichia数值高于阴性对照8倍以上，志贺氏菌的读数是Escherichia和shigella 数值阴性对照30倍以上；沙门氏菌的Sallmonella的数值是高于阴性对照45倍以上，金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值高于阴性对照25倍以上，大肠埃希氏菌O157的读数为Escherichia 和O157是阴性对照50倍以上，小肠结肠耶尔森氏菌的Yersinina数值为高于阴性对照45倍以上。
实施例3：
（1）无菌操作称取4份25 g猪肉样品放入225 mL LB的无菌均质袋中均质1-2min，分别接种大肠埃希氏菌O18、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌后于37 °C培养14-16 h。无菌操作称取25 g猪肉样品1份放入225 mL含有新生霉素的志贺氏增菌肉汤的无菌均质袋中均质1-2min，接种志贺氏菌后于42 °C厌氧培养14-16 h。无菌操作称取25g猪肉样品1份放入225 mL 含有新生霉素的EC肉汤无菌均质袋中均质1-2min，接种O157大肠埃希氏菌后于37 °C培养14-16 h。
（2）水煮法提取DNA模板：取经过增菌培养的培养基3 mL在12,000 rpm离心5 min，沉淀用500 μL无菌生理盐水洗1 次后用100 μL无菌超纯水重悬，煮沸10 min，冰浴10 min，12,000 rpm离心5 min取上清。
（3）PCR扩增目的基因片段
配制25 μL体系：2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2 μM），dNTPs 1 μL，DNA模板2 μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95 °C预变性15 min后，94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸30 s，循环35次，72°C延伸7 min，产物在4 °C保存。
（4）微球杂交
取5 μL 扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6 μg/mL）混合，在37 °C孵育杂交25-30 min。
（5）Luminex 200仪器检测
打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：O157样本的Escherichia和O157的数值是阴性对照、空白对照10倍；O18的Escherichia数值高于阴性对照10倍，空白对照的80倍；志贺氏菌的Escherichia数值是阴性对照的2倍、空白对照的10倍，shigella的数值是阴性对照和空白对照的6倍；沙门氏菌的数值是阴性对照2倍、空白对照的7倍；小肠结肠耶尔森氏菌的数值高于阴性对照和空白对照的50倍；金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值是阴性对照40倍，空白对照的50倍。
序列表
<110>中国动物卫生与流行病学中心
<120>一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法
<160>12
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>大肠埃希氏菌（Escherichia.coli）
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>1
aactttctctctctattcttattt/ iSp C12/aatcggcgactctcacat 42
<210>2
<211>20
<212> DNA
<213>大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>2
tacggatctggttgatgaag 20
<210>3
<211>42
<212> DNA
<213>大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>3
atctcaattacaataacacacaaa/ iSp C12/tcacctggcagaatgtct 42
<210>4
<211>18
<212> DNA
<213>大肠埃希氏菌（Escherichia coli）O157
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>4
gtctgttgaccgcttgtt 18
<210>5
<211>42
<212> DNA
<213>沙门氏菌（Salmonella）
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>5
acactcatttaacactatttcatt/ iSp C12/gctacgactgcttgaacc 42
<210>6
<211>18
<212> DNA
<213>沙门氏菌（Salmonella）
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>6
gccttccacgacttcttc 18
<210>7
<211>43
<212> DNA
<213>志贺氏菌（Shigella）
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>7
tactacttctataactcacttaaa/ iSp C12/atgcctgaacaacgagtta 43
<210>8
<211>20
<212> DNA
<213>志贺氏菌（Shigella）
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>8
catgttatgtgcgatggtaa 20
<210>9
<211>43
<212> DNA
<213>小肠结肠耶尔森氏菌（Y.enterocolitiea）
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>9
ctacaaacacttaactttatcttt/ iSp C12/aggtgaatggtgagcaatt 43
<210>10
<211>18
<212> DNA
<213>小肠结肠耶尔森氏菌（Y.enterocolitiea）
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>10
gccgcataggatgatgtc 18
<210>11
<211>44
<212> DNA
<213>金黄色葡萄球菌（S.aureus）
<220>
<223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。
<400>11
atactttacaaacaaataacacac/ iSp C12/ggatggctatcagtaatgtt 44
<210>12
<211>19
<212> DNA
<213>金黄色葡萄球菌（S.aureus）
<220>
<223>引物5'端带有生物素标记
<400>12
ggatcttcagaaccacttc 19
Claims (1)
1.一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法，其特征在于，该方法用于非诊断目的，以提取的待测细菌DNA为模板，用SEQ ID NO.1-12的6对引物对大肠埃希氏菌O157、非O157大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色萄球菌进行多重PCR扩增，扩增产物在与微球杂交后在Luminex 200仪器上检测，根据检测数值判定结果，所述多重PCR扩增的引物序列为SEQ ID NO.1-12；
Luminex 200仪器检测数值中Escherichia高于阴性对照6倍或以上和O157的是阴性对照6倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Salmonella的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510234801.9A CN105986029B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510234801.9A CN105986029B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105986029A CN105986029A (zh) | 2016-10-05 |
| CN105986029B true CN105986029B (zh) | 2019-12-24 |
Family
ID=57040354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510234801.9A Expired - Fee Related CN105986029B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105986029B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109762941B (zh) * | 2019-02-14 | 2021-06-29 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286612A (zh) * | 2010-06-18 | 2011-12-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种致病微生物快速检测试剂盒 |
| CN104164510A (zh) * | 2014-08-20 | 2014-11-26 | 上海市农业科学院 | 利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法 |
-
2015
- 2015-05-11 CN CN201510234801.9A patent/CN105986029B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286612A (zh) * | 2010-06-18 | 2011-12-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种致病微生物快速检测试剂盒 |
| CN104164510A (zh) * | 2014-08-20 | 2014-11-26 | 上海市农业科学院 | 利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Novel fold of VirA, a type III secretion system effector protein from Shigella flexneri;JAMAINE DAVIS等;《Protein Science》;20081231;2167-2173 * |
| Rapid and simultaneous analysis of five foodborne pathogenic bacteria using multiplex PCR;Zheng Ping Guan 等;《Eur Food Res Technol》;20130619;627-637 * |
| 食源性致病菌快速检测试剂盒的研制与应用;姜彦君等;《中国食品学报》;20140113;224-230 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105986029A (zh) | 2016-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rohde et al. | FISHing for bacteria in food–A promising tool for the reliable detection of pathogenic bacteria? | |
| Hein et al. | Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: an alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project | |
| López-Campos et al. | Detection, identification, and analysis of foodborne pathogens | |
| El-Hadedy et al. | Identification of Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from Egyptian food by conventional and molecular methods | |
| Timms et al. | How accurately can we detect Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection? | |
| Cai et al. | Rapid detection and simultaneous genotyping of Cronobacter spp.(formerly Enterobacter sakazakii) in powdered infant formula using real-time PCR and high resolution melting (HRM) analysis | |
| Qin et al. | Multiplex real-time PCR coupled with sodium dodecyl sulphate and propidium monoazide for the simultaneous detection of viable Listeria monocytogenes, Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus and Salmonella spp. in milk | |
| Wei et al. | Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detection of 4 major bacterial pathogens in ducks | |
| CN103421898A (zh) | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN104212901A (zh) | 用于金黄色葡萄球菌耐药性检测的组合物 | |
| CN105936935B (zh) | 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒 | |
| Bailey et al. | Detection of Salmonella from chicken rinses and chicken hot dogs with the automated BAX PCR system | |
| Qin et al. | Rapid and specific detection of Escherichia coli O157: H7 in ground beef using immunomagnetic separation combined with loop-mediated isothermal amplification | |
| CN103993090B (zh) | 对普罗威登斯菌o31，o41，o42，o43和o50特异的核苷酸及其应用 | |
| CN106834500B (zh) | 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用 | |
| CN105986029B (zh) | 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法 | |
| CN104531860B (zh) | 一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用 | |
| JP5048622B2 (ja) | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー | |
| Batra et al. | Recombinase polymerase amplification-lateral flow assay (RPA-LFA) as a rapid and sensitive test for Escherichia coli O157: H7 detection in food and beverage: A comparative study | |
| CN108018365B (zh) | 一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的试剂盒及检测方法 | |
| KR101752274B1 (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
| AU2019100071A4 (en) | Pcr detection kit for rapidly identifying salmonella of specific serotypes | |
| CN107937584B (zh) | 一种肉品沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法 | |
| CN111621578A (zh) | 一种基于ru61_00441基因的德尔卑沙门氏菌恒温检测试剂盒及方法 | |
| JP5006607B2 (ja) | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191224 |