CN104164510A - 利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法 - Google Patents

利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，依据四种主要的食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌以及大肠杆菌O157：H7的保守区序列设计出适用于进行多重PCR的引物，用多重PCR技术检测农产品中的主要食源性致病菌，该检测方法特异性好，与8种相似菌种无交叉反应，扩增出的条带清晰，灵敏度也较高，检出限均可以达到103copies/ml，而且快速、方便。本发明设计的引物与多重PCR体系可制成适于快速检测食源性致病菌的试剂盒，利用此试剂盒可以大大地缩短时间，提高检测的效率。

Description

利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法。
背景技术
在我国，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌在环境中分布很广。然而，我国日常食用品检测标准多数只包括感官指标和理化指标，缺少微生物限量指标，在牛肉的食品卫生标准中只是规定了检测大肠杆菌菌群和沙门氏菌菌群计数检测，与国际标准要求差距很大。我国整体食品标准采用国际食品法典委员会(CAC)标准的只有12％，采用国际标准化组织食品技术委员会标准的只有40％，而且，在我国的国家标准中有80％为非强制性的推荐标准。
目前对与食品相关的食源性病菌的监测和疫情的确诊，主要采用病菌分离鉴定、血清学和分子生物学方法。
病菌分离鉴定：这种方法是最经典的病菌鉴定技术，比较可靠，但因为周期长，操作烦琐。
血清学方法：血清学诊断技术对于这些病的研究意义非常重大，目前实验室采用的有ELISA，HA/HI、琼扩等，多用于抗体检测，但这种检测方法只能针对单一血清型。HA/HI方法是目前检测的通用方法，但由于近年来重组菌株、变异株的出现，使得HI试验的交叉反应越来越明显，有时无法判定确切的血清亚型；另外，采用HI测定血清亚型，需要多个试验，操作烦琐；而且利用已知亚型血清无法检测出新的血清型，其应用受到了一定限制。琼扩试验(AGP)是利用抗原抗体在固体琼脂上可形成肉眼可见的沉淀线来判定样品中是否含有病菌或血清中是否有病菌抗体，此法虽然简单易行，但是敏感性稍差。间接免疫荧光试验也可应用于这些疾病的诊断，但是由于此种方法需要借助荧光显微镜，价格昂贵，只能局限于有条件的实验室，另外该方法存在较高的非特异性也使其应用受到了一定限制。
分子生物学诊断方法：为了提供有效的检测病原的方法，在过去的十几年，一系列的RT-PCR和实时RT-PCR已经被发展来检测不同的病原。然而，只有极少数方法用来同时检测几种病菌。比如多重PCR，但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差。
所有目前用的分子检测方法，尽管有用，但是，这些方法或者由于不能同时检测和定量样品中要检测的所有病原，或者因不够灵敏、不够简单，而不能在大规模的检测中应用。
进一步，高通量方法要面临污染的风险，这也是基于PCR方法所面临的共同问题。一些可利用的病原检测RT-PCR方法是基于多重PCR方法，来进行多个病原的检测，或者利用巢式PCR方法来增加灵敏度。这些方法的大部分用传统的凝胶电泳来检测扩增的病菌核酸。但这不适于大规模的常规检测。有人开发出酶联寡核苷酸吸附试验(PCR-ELISA)作为大规模扩增病菌核酸的检测系统，但样品必须仔细的处理，以避免PCR产品的污染。
传统食源性病原微生物定性、定量PCR检测技术每次只能对单一种的食源性病原微生物进行检测，而对于食源性病原微生物成分不明确的加工农产品中的食源性病原微生物成分，需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定，周期长，工作量大，成本高。在未来的加工农产品食源性病原微生物检测中，这两种检测技术已越来越不能胜任一次处理几种、十几种、几十种食源性病原微生物的特殊需要，尤其是大数量的加工农产品进入商品化生产时，需要有更有效的、快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，用多重PCR技术检测农产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌，该检测方法特异性好，与8种相似菌种无交叉反应，扩增出的条带清晰，灵敏度也较高，检出限均可以达到103copies/ml，而且快速、方便。
为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：
一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，包括：
1)查找食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的保守区序列；
2)针对待测食源性致病菌分别设计4组上下游引物对；
所述4组引物对的序列及相关参数为：
3)进行多重PCR反应；
多重PCR反应总体系为25～50μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；步骤2)的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；模板，0.25μl；余量为灭菌的去离子水；
4)将步骤3)的产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选地，所述多重PCR反应总体系为40μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；步骤2)的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；模板，0.25μl；余量为灭菌的去离子水。
进一步，所述的多重PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58.0～64.0℃退火40sec，72℃延伸30sec，35个循环。
优选地，所述退火温度为62.1℃。
本发明的另一个目的是提供一种快速检测食源性致病菌的试剂盒，包括：阳性对照物，所述阳性对照物为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的阳性对照质粒；阴性对照物PUC-18质粒；多重PCR反应体系，总体系为25～50μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；如前所述4种致病菌的上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；余量为灭菌的去离子水。
优选地，所述多重PCR反应体系，总体系为40μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；如前所述4种致病菌的上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；余量为灭菌的去离子水。
本发明的有益效果：
1.本发明利用多重PCR技术检测农产品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌，针对该四种常见的食源性致病菌的保守区设计4种引物对，本发明的4种引物对特异性强，能准确检测出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌，与8种相似菌种无交叉反应，各扩增片段在进行琼脂糖电泳时，可以彼此明显分开,条带清晰。
2.使用本发明的优化过的多重PCR反应体系和反应条件，可在同一反应体系中同时实现对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和肠出血性大肠杆菌的快速检测，准确判断所检样品是否被沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌或肠出血性大肠杆菌污染，可以大大地缩短检测时间，提高检测效率，灵敏度也较高，检出限均可以达到103copies/ml。
附图说明
图1为利用本发明的多重PCR体系检测人工污染猪肉样品的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108cfu/ml；泳道2为107cfu/ml；泳道3为106cfu/ml；泳道4为105cfu/ml；泳道5为104cfu/ml；泳道6为103cfu/ml；泳道7为阴性对照。
图2：为利用本发明的多重PCR体系检测沙门氏菌的特异性；
其中，M为2000bp的marker，1.沙门氏菌ATCC14028；2.克雷伯杆菌ATCC46114；3.藤黄微球菌ATCC9341；4.变形杆菌ATCC12453；5.肺炎链球菌ATCC27336；6.阪崎肠杆菌ATCC29544；7.福氏志贺氏菌CMCC51571；8.铜绿假单胞菌IQCC12625；9.腊样芽孢杆菌ATCC1220；10为阴性对照。
图3为利用本发明的多重PCR体系检测单增李斯特菌的特异性；
其中，M为2000bp的marker，1.为单增李斯特菌的PCR产物；2.克雷伯杆菌ATCC46114；3.藤黄微球菌ATCC9341；4.变形杆菌ATCC12453；5.肺炎链球菌ATCC27336；6.阪崎肠杆菌ATCC29544；7.福氏志贺氏菌CMCC51571；8.铜绿假单胞菌IQCC12625；9.腊样芽孢杆菌ATCC1220；10为阴性对照。
图4为利用本发明的多重PCR体系检测大肠杆菌O157：H7的特异性；
其中，M为2000bp的marker，1为大肠杆菌O157：H7的PCR产物；2.克雷伯杆菌ATCC46114；3.藤黄微球菌ATCC9341；4.变形杆菌ATCC12453；5.肺炎链球菌ATCC27336；6.阪崎肠杆菌ATCC29544；7.福氏志贺氏菌CMCC51571；8.铜绿假单胞菌IQCC12625；9.腊样芽孢杆菌ATCC1220；10为阴性对照。
图5为利用本发明的多重PCR体系检测金黄色葡萄球菌的特异性；
其中，M为2000bp的marker，1金黄色葡萄球菌的PCR产物；2.克雷伯杆菌ATCC46114；3.藤黄微球菌ATCC9341；4.变形杆菌ATCC12453；5.肺炎链球菌ATCC27336；6.阪崎肠杆菌ATCC29544；7.福氏志贺氏菌CMCC51571；8.铜绿假单胞菌IQCC12625；9.腊样芽孢杆菌ATCC1220；10为阴性对照。
图6为本发明的多重PCR体系的特异性检测结果；
其中，M为2000bp的Marker；1是沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、克雷伯杆菌；2是沙门氏菌、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌；3是单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌O157：H7；4是沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7；5是沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、藤黄微球菌、单增李斯特菌；6是沙门氏菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌；7是单增李斯特菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7；8是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、腊样芽孢杆菌；9是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、克雷伯杆菌；10是单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7；11是沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、变形杆菌、单增李斯特菌；12是沙门氏菌、肺炎链球菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌；13是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、藤黄微球菌；14是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、变形杆菌；15是沙门氏菌、腊样芽孢杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌；16是沙门氏菌、克雷伯杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌；17是单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7；18是沙门氏菌、单增李斯特菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌；19是沙门氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌；20-21为阴性对照组。
图7为利用本发明的多重PCR体系检测沙门氏菌的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108copies/ml；泳道2为107copies/ml；泳道3为106copies/ml；泳道4为105copies/ml；泳道5为104copies/ml；泳道6为103copies/ml；泳道7为102copies/ml，泳道8为阴性对照。
图8为利用本发明的多重PCR体系检测单增李斯特菌的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108copies/ml；泳道2为107copies/ml；泳道3为106copies/ml；泳道4为105copies/ml；泳道5为104copies/ml；泳道6为103copies/ml；泳道7为102copies/ml，泳道8为阴性对照。
图9为利用本发明的多重PCR体系检测大肠杆菌O157：H7的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108copies/ml；泳道2为107copies/ml；泳道3为106copies/ml；泳道4为105copies/ml；泳道5为104copies/ml；泳道6为103copies/ml；泳道7为102copies/ml，泳道8为阴性对照。
图10为利用本发明的多重PCR体系检测金黄色葡萄球菌的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108copies/ml；泳道2为107copies/ml；泳道3为106copies/ml；泳道4为105copies/ml；泳道5为104copies/ml；泳道6为103copies/ml；泳道7为102copies/ml，泳道8为阴性对照。
图11为利用本发明的多重PCR体系同时检测四种菌的灵敏度；
其中，M为2000bp的DNA marker，泳道1为108copies/ml；泳道2为107copies/ml；泳道3为106copies/ml；泳道4为105copies/ml；泳道5为104copies/ml；泳道6为103cfu/ml；泳道7为阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例与附图进一步详细描述本发明的技术方案。
本实施例中菌液的准备：将沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌菌液收集到1.5ml的离心管中待用，将金黄色葡萄球菌的菌液煮沸30-50min后离心取上清待用。
实施例1样品灵敏度的检测
1)制备猪肉匀浆液：取经国家标准检测证实不含有本研究所涉及的四种食源性致病菌的猪肉25克，切碎后加入225ml灭菌的生理盐水匀浆。
2)菌液培养：将单核增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中，在培养箱中37℃，220rpm振荡过夜培养，采用平板计数法进行菌落计数。
3)污染食品样品原样的获得：取四种经过夜培养的相同浓度的致病菌菌液各1ml加入到7ml猪肉匀浆液中，混合后作为污染食品样品原样。
4)多重PCR反应：用匀浆液作为稀释液将污染食品样品原样进行10倍倍比稀释，每个稀释度用试剂盒法分别提取基因组DNA，进行多重PCR扩增确定四种致病菌在猪肉中的检出限。
5)多重PCR反应体系：Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；模板各0.25μl；加入灭菌的去离子水至40μl。
6)反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，62.1℃退火40sec，72℃延伸30sec，35个循环。
7)产物检测：反应结束后取产物3μl进行琼脂糖凝胶电泳，并用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，观察反应结果。
结果：由图1可知，多重PCR同时检测人工污染猪肉中四种致病菌的灵敏度为103cfu/ml。
实施例2四种菌的单重PCR特异性检测
12种菌株：沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯杆菌、福氏志贺氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌、肺炎链球菌、腊样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌。
将本发明的食源性致病菌菌株沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌分别与上述其余8种菌株组合，进行单重PCR特异性检测，混合均匀后分别用菌液作为模板进行多重PCR扩增，并进行电泳检测。
多重PCR反应体系、反应条件及产物检测参照实施例1的步骤5)至步骤7)进行。
结果：分别用沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌的引物检测其特异性，由图2、图3、图4、图5可知，只有含有四种目的菌株的PCR体系扩增出了条带，其他菌株均没有条带出现，说明这四种菌引物的特异性良好。
实施例3四种菌的多重PCR特异性检测
12种菌株：沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯杆菌、福氏志贺氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌、肺炎链球菌、腊样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌。
取本发明的食源性致病菌菌株沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌中的任意3种与上述其余8种菌株中的1种组合成19个四种菌株组合，混合均匀后分别用菌液作为模板进行多重PCR扩增，并进行电泳检测。
多重PCR反应体系、反应条件及产物检测参照实施例1的步骤5)至步骤7)进行。
结果：如图6，该多重PCR具有较强的特异性，可用于同时检测本发明所涉及到的四种致病菌中的一种或几种。
实施例4四种菌的单重PCR灵敏度检测
用沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌10倍梯度稀释的菌液作为模板，进行多重PCR扩增，确定多重PCR单一致病菌的灵敏度。
多重PCR反应体系、反应条件及产物检测参照实施例1的步骤5)至步骤7)进行。
结果：由图7、图8、图9、图10可知，多重PCR检测单一致病菌的灵敏度均为103copies/ml。
实施例5四种菌的多重PCR灵敏度检测
用沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌10倍梯度稀释的菌液作为模板，进行多重PCR扩增，确定多重PCR同时检测四种致病菌的灵敏度。
多重PCR反应体系、反应条件及产物检测参照实施例1的步骤5)至步骤7)进行。
结果：由图11可知，多重PCR同时检测四种致病菌的灵敏度为103copies/ml。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，包括：
1)查找食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的保守区序列；
2)针对待测食源性致病菌分别设计4组上下游引物对；
所述4组引物对的序列及相关参数为：
3)进行多重PCR反应；
进行所述的多重PCR反应的总体系为25～50μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；步骤2)的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；模板，0.25μl；余量为灭菌的去离子水；
4)将步骤3)的产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中多重PCR反应的总体系为40μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；步骤2)的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；模板，0.25μl；余量为灭菌的去离子水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述的多重PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58.0～64.0℃退火40sec，72℃延伸30sec，35个循环。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的退火温度为62.1℃。
5.一种快速检测食源性致病菌的试剂盒，包括：阳性对照物，为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的阳性对照质粒；阴性对照物PUC-18质粒；多重PCR反应体系，总体系为25～50μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；如权利要求1所述的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；余量为灭菌的去离子水。
6.根据权利要求5所述的快速检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR反应体系，总体系为40μl，其中Tris-HCl，pH＝8.3，10mM；KCl，50mM；MgSO4，1.5mM；dNTP，0.2μM；如权利要求1所述的4组上下游引物各0.8μM；rTaq酶，2U；余量为灭菌的去离子水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105986029A (zh) * 2015-05-11 2016-10-05 中国动物卫生与流行病学中心 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法
CN106916894A (zh) * 2017-04-06 2017-07-04 吉林大学 一种多重pcr检测微生态活菌制剂中食源性致病菌的方法
CN114277170A (zh) * 2022-02-17 2022-04-05 重庆市计量质量检测研究院 一种检测十种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105986029A (zh) * 2015-05-11 2016-10-05 中国动物卫生与流行病学中心 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法
CN105986029B (zh) * 2015-05-11 2019-12-24 中国动物卫生与流行病学中心 一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法
CN106916894A (zh) * 2017-04-06 2017-07-04 吉林大学 一种多重pcr检测微生态活菌制剂中食源性致病菌的方法
CN114277170A (zh) * 2022-02-17 2022-04-05 重庆市计量质量检测研究院 一种检测十种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒
CN114277170B (zh) * 2022-02-17 2024-02-13 重庆市计量质量检测研究院 一种检测九种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒

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