CN114277170B - 一种检测九种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒 - Google Patents

一种检测九种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物及试剂盒，所述引物的序列包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列。本发明建立的多重PCR检测方法只需要1次人工操作和1次PCR反应时间，降低了大量的人力成本和时间成本，且同时检测节省了重复检测同一个样品的试剂消耗，大量减少了试剂成本。

Description

一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学快速检测技术领域，具体涉及一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物及试剂盒。
背景技术
目前，我国开展食源性致病菌检测主要依靠传统的培养法，包括细菌培养、血清学、生化鉴定等过程，依据标准主要是GB 4789系列和GB8538。传统培养法检测时受微生物生长情况影响较大，并且其检测周期长，一般需要4-7天，操作也繁琐复杂，十分耗时耗力，已不能满足我国公共卫生突发事件应急检测的需要。
近年来，分子生物学技术发展十分迅速，致病菌检测标准在制定中从传统的培养方法逐渐转变为分子生物学方法，查阅目前现行标准，在致病菌检测中主要利用的分子生物学技术为传统聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术、实时荧光定量PCR技术、环介导恒温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术、数字微滴PCR技术等。分析其标准类别，发现使用分子生物学技术的标准基本都是行业标准、地方标准，而使用范围最广的国家强制性标准GB4789和GB8538，还是以传统的培养方法为主，仅在2017年实施的GB 4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》、GB 4789.12-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》、2020年实施的GB 4789.29-2020《食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》中用到传统PCR技术，GB 4789.42-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》中用到实时荧光定量PCR技术。这主要是由于实时荧光定量PCR技术、数字微滴PCR技术对实验室人员、仪器要求较高，检测成本也较高，限制了其在实验室大范围普及使用，而LAMP技术虽对仪器要求较低，但引物设计较为困难，往往需要设计几对GC含量合适，打分较高的优质引物组，在序列条件不是特别好的情况下，较难实现，大范围使用也存在困难。强制性标准中目前仅有GB 4789.42-2016利用实时荧光定量PCR技术，主要是因为病毒检测对实验室能力要求较高，具有这一能力的实验室在人员、仪器配置上本来就处于国内较高水平。而传统PCR技术相比于荧光定量PCR、数字微滴PCR等技术，操作简单，检测成本也较低，这也是近年来国家强制性标准逐渐使用这一技术的原因。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物，以解决现有技术常规食品微生物检测方法操作较为繁琐且耗时长的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物，所述引物的序列包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列。
本发明提供一种利用多重PCR同时快速检测九种食源性致病菌的方法，提取待检测产品基因组DNA作为模板，在引物存在下进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析即完成产品中食源性致病菌成分的检测；所述引物的序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列。
本发明提供一种检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒，采用上述检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物制备得到的试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明所建立的检测方法能够在同一个PCR反应体系中检测单增细胞增生李斯特菌、沙门氏菌属、克罗偌杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157：H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌10种食源性致病菌，检测效率较高、检测成本较低，且包含了目前我国食品安全监督抽查工作以及现行的食品安全国家标准涉及的食源性致病菌种类，与全国检验机构实际检测工作联系紧密，具有较大的推广应用价值。
2、本发明所建立的检测方法具有较高特异性，方法中引物对均经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，并经过特异性验证，能够很好的区分目标菌种和相近种属菌种，对供试菌种进行PCR检测，只有具有特异基因的致病菌菌株呈现阳性，其余均呈现阴性。
3、本发明所建立的检测方法具有较高灵敏性，通过十重PCR检测，单核细胞增生李斯特氏菌菌株的灵敏度为5.37×10-2ng/μL，金黄色葡萄球菌菌株的灵敏度为5.37×10- 2ng/μL，副溶血性弧菌菌株的灵敏度为8.85×10-1ng/μL，粪链球菌菌株的灵敏度为8.91×10-1ng/μL，产气荚膜梭菌的灵敏度为7.33×10-1ng/μL，沙门氏菌属菌株的灵敏度为7.10×10-1ng/μL，克罗诺杆菌属菌株的灵敏度为7.49×10-2ng/μL，志贺氏菌属菌株的灵敏度为6.04×10-2ng/μL，大肠埃希氏菌O157：H7菌株的灵敏度为7.20×10-2ng/μL，铜绿假单胞菌菌株的灵敏度为9.52×10-2ng/μL，该检测方法具有较高的灵敏性。通过人工污染样品评价实验发现，本发明涉及的10种致病菌在增菌后检测灵敏度均能达到10CFU/mL以上，且扩增条带清晰明显，扩增效果好，检测结果无假阴性和假阳性，结果准确、可靠、实用性较强。
4、本发明建立的多重PCR检测方法只需要1次人工操作和1次PCR反应时间，降低了大量的人力成本和时间成本，且同时检测节省了重复检测同一个样品的试剂消耗，大量减少了试剂成本。
附图说明
图1为采用自配体系进行多重PCR扩增结果，M：100bp Marker，泳道1-3：3个平行。
图2为采用2×多重PCR扩增试剂盒进行多重PCR扩增结果，M：100bp Marker，泳道1-3：3个平行。
图3为十重PCR扩增退火温度优化结果，M：100bp Marker，泳道1-8:分别是55.0℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63.0℃、64.3℃、65℃退火温度。
图4为退火温度为60℃、62℃时10对特异性引物分别扩增结果，A：M：50bp Marker，泳道1-11依次为60℃时大肠埃希氏菌O157：H7、粪链球菌、克罗诺杆菌属、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、空白对照结果，B：M：100bp Marker，泳道1-11依次为62℃时大肠埃希氏菌O157：H7、粪链球菌、克罗诺杆菌属、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、空白对照结果。
图5为不同引物终浓度的十重PCR扩增结果，M：100bp Marker，A-E：10重体系中加入浓度为10mM的引物体积一次为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL扩增条带，各2个平行。
图6为不同模板量的十重PCR扩增结果，M：100bp Marker，A-C：10重体系中加入模板DNA量依次为10ng、25ng、50ng扩增条带，各2各平行。
图7为不同琼脂糖凝胶浓度电泳结果，M：100bp Marker，A-C：琼脂糖凝胶浓度依次为1.5％、2.0％、2.5％各2各平行。
图8为十重PCR体系特异性验证第一组至第八组实验扩增结果，M：100bp Marker，A：第一组，B：第二组，C：第三组，D：第四组，E：第五组，F：第六组，G：第七组，H：第八组，各3平行。
图9为十重PCR体系中单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌灵敏度验证，M：50bp Marker，A：单核细胞增生李斯特氏菌，DNA模板浓度分别为53.7ng/μL、5.37ng/μL、5.37×10-1ng/μL、5.37×10-2ng/μL、5.37×10-3ng/μL，B：金黄色葡萄球菌，DNA模板浓度分别为53.7ng/μL、5.37ng/μL、5.37×10-1ng/μL、5.37×10-2ng/μL、5.37×10-3ng/μL，C：副溶血性弧菌，DNA模板浓度分别为88.5ng/μL、8.85ng/μL、8.85×10-1ng/μL、8.85×10-2ng/μL。
图10为十重PCR体系中粪链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌属灵敏度验证，A：M：100bp Marker，粪链球菌，DNA模板浓度分别为89.1ng/μL、8.91ng/μL、8.91×10-1ng/μL、8.91×10-2ng/μL、8.91×10-3ng/μL，B：M：50bp Marker，产气荚膜梭菌，DNA模板浓度分别为73.3ng/μL、7.33ng/μL、7.33×10-1ng/μL、7.33×10-2ng/μL，C：M：50bp Marker，沙门氏菌属，DNA模板浓度分别为71.0ng/μL、7.10ng/μL、7.10×10-1ng/μL、7.10×10-2ng/μL。
图11为十重PCR体系中克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌O157：H7、铜绿假单胞菌菌灵敏度验证，A：M：100bp Marker，克罗诺杆菌属，DNA模板浓度分别为60.4ng/μL、6.04ng/μL、6.04×10-1ng/μL、6.04×10-2ng/μL、6.04×10-3ng/μL、6.04×10-4ng/μL，B：M：50bp Marker，志贺氏菌属，DNA模板浓度分别为89.1ng/μL、8.91ng/μL、8.91×10-1ng/μL、8.91×10-2ng/μL、8.91×10-3ng/μL，C：M：100bp Marker，大肠埃希氏菌O157：H7，DNA模板浓度分别为72.0ng/μL、7.20ng/μL、7.20×10-1ng/μL、7.20×10-2ng/μL、7.20×10-3ng/μL、7.20×10-4ng/μL，D：M：50bp Marker，铜绿假单胞菌菌，DNA模板浓度分别为95.2ng/μL、9.52ng/μL、9.52×10-1ng/μL、9.52×10-2ng/μL、9.52×10-3ng/μL。
图12为十重PCR检测方法初步应用中第一组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图13为十重PCR检测方法初步应用中第二组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图14为十重PCR检测方法初步应用中第三组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图15为十重PCR检测方法初步应用中第四组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图16为十重PCR检测方法初步应用中第五组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图17为十重PCR检测方法初步应用中第六组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图18为十重PCR检测方法初步应用中第七组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图19为十重PCR检测方法初步应用中第八组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图20为十重PCR检测方法初步应用中第九组增菌前、后检测结果，M：100bpMarker，A、B依次为增菌前、后十重PCR反应检测结果，泳道1-4和5-8：菌液浓度均依次为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL。
图21为阳性对照电泳图，M：100bp Marker。
图22为试剂盒重复性、稳定性和保存期试验结果，M：100bp Marker，A：0号试剂盒十重PCR反应结果，泳道1-3为3次重复，B：1-1、1-2、1-3号试剂盒十重PCR反应结果，1-1、1-2、1-3为试剂盒编号，C：2-1、2-2、2-3号试剂盒十重PCR反应结果，2-1、2-2、2-3为试剂盒编号，D：3-1、3-2、3-3号试剂盒十重PCR反应结果，3-1、3-2、3-3为试剂盒编号。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
一、一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物
所述引物的序列包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列。本发明所针对的九种食源性致病菌包括李斯特菌、沙门氏菌属、克罗偌杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157：H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌10种食源性致病菌。
表1九种食源性致病菌多重PCR检测用引物组和目标基因
本发明所述用于快速检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物在制备用于快速检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒中的应用；或者在利用多重PCR快速检测九种食源性致病菌中的应用。
二、一种利用多重PCR同时快速检测九种食源性致病菌的方法
提取待检测产品基因组DNA作为模板，在引物存在下进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析即完成产品中食源性致病菌成分的检测；所述引物的序列为SEQ ID NO.1至SEQID NO.19所示的核苷酸序列。
1、引物合成
按照表1中的引物序列，在合成所有引物的寡聚核苷酸序列。
2、DNA模板提取
选择沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌作为建立检测方法的目标微生物，分别按照标准方法对九种微生物进行增菌培养，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA模板。
3、多重PCR检测体系建立
在确认多重反应体系中引物序列后，还需要从引物浓度、退火温度、模板量等方面分别进行优化。反应体系的配置如下：
Mix buffer 35μL，Taq酶1μL，引物量(10μM)各(0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL)，DNA模板量(10ng、25ng、50ng)，补充dd H2O至50μL。
多重体系的反应条件如下：
95℃预变性4min；95℃变性30s，55.0℃复性30s，55.7℃复性30s，56.9℃复性30s，58.8℃复性30s，61.1℃复性30s，63.0℃复性30s，64.3℃复性30s，65℃复性30s，72℃延伸1min共35个循环；最后72℃延伸10min。
4、多重PCR产物分析和结果判定
十重PCR产物由于目的条带较多，琼脂糖凝胶的浓度对结果影响十分大，浓度太低，跑胶时间较短，会导致10个条带无法分开；浓度太高，会延长跑胶时间，但时间太久会导致小片段DNA降解，从而影响实验结果，本发明对琼脂糖凝胶浓度进行优化：核酸染料浓度(10μL/100mL)，电泳液浓度(1×TAE)，PCR扩增产物上样量(25μL)以及电泳条件(电压220V，时间约40min)，琼脂糖凝胶浓度(1.5％，2％，2.5％)，进行电泳，根据片段大小对照表1判定扩增目标基因的情况。
5、检测体系的验证
针对已经建立的九种食源性致病菌的多重PCR检测方法进行特异性验证和灵敏度验证。
特异性验证：采用优化好的反应体系和反应条件，以重庆市计量质量检测研究院收集的菌株DNA为模板(其中斯氏李斯特菌ATCC 35967、伊氏李斯特菌ATCC 19119、英诺克李斯特菌CICC 10417、威氏李斯特菌CICC 21672、格氏李斯特菌CICC 21670、马红球菌ATCC6939、表皮葡萄球菌CICC 10294、创伤弧菌CICC21615、恶臭假单胞菌CICC21624、鸡肠球菌CICC24240、铅黄肠球菌CICC10433、生孢梭菌CICC10385为非目标菌)，加入10对特异性引物进行十重PCR扩增，以验证该反应体系的特异性，依据现行标准中各类样品需检测的致病菌类型组合，特异性验证实验分组如下：
第一组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第二组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第三组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第四组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157：H7的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第五组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第六组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第七组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、克罗诺杆菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第八组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。结果表明阴性对照和非目标菌株无非特异性条带扩增，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开，能够进行九种目标菌的检测。
灵敏度验证：采用优化好的反应体系和反应条件，于十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，再分别加入表2中的10株菌株DNA各稀释度为模板，分别于十重PCR体系中验证各个单一菌种的检测灵敏度。
表2灵敏度验证用菌株编号和名称
菌株编号 菌株名称
ATCC 19115 单核细胞增生李斯特氏菌
CICC 21600 金黄色葡萄球菌
CICC 21617 副溶血性弧菌
ATCC 29212 粪链球菌
ATCC 13124 产气荚膜梭菌
CICC 21482 肠炎沙门氏菌
CICC 21544 阪崎克罗诺杆菌
CICC 21534 福氏志贺氏菌
CICC 21530 大肠埃希氏菌O157：H7
ATCC 27853 铜绿假单胞菌
通过十重PCR检测，单核细胞增生李斯特氏菌菌株的灵敏度为5.37×10-2ng/μL，金黄色葡萄球菌菌株的灵敏度为5.37×10-2ng/μL，副溶血性弧菌菌株的灵敏度为8.85×10- 1ng/μL，粪链球菌菌株的灵敏度为8.91×10-1ng/μL，产气荚膜梭菌的灵敏度为7.33×10- 1ng/μL，沙门氏菌属菌株的灵敏度为7.10×10-1ng/μL，克罗诺杆菌属菌株的灵敏度为7.49×10-2ng/μL，志贺氏菌属菌株的灵敏度为6.04×10-2ng/μL，大肠埃希氏菌O157：H7菌株的灵敏度为7.20×10-2ng/μL，铜绿假单胞菌菌株的灵敏度为9.52×10-2ng/μL，该检测方法具有较高的灵敏性。
6、十重PCR检测方法的应用与评价
为验证建立的多重PCR检测方法的实用性和准确性，选取人工污染的不同基质样品进行测试实验，进一步验证该多重PCR方法检测的灵敏度。
人工污染分组：
第一组：
基质：牛肉干，污染菌株：ATCC 19115单核细胞增生李斯特氏菌、CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21530大肠埃希氏菌O157：H7。
第二组：
基质：海苔，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21617副溶血性弧菌。
第三组：
基质：巧克力，污染菌株：CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第四组：
基质：面包，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第五组：
基质：椰汁，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第六组：
基质：鸡精，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21534福氏志贺氏菌。
第七组：
基质：奶粉，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21544阪崎克罗诺杆菌。
第八组：
基质：矿泉水，污染菌株：ATCC 29212粪链球菌、ATCC 13124产气荚膜梭菌、ATCC27853铜绿假单胞菌。
第九组：
基质：牛肉干，污染菌株：ATCC 19115单核细胞增生李斯特氏菌、CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21530大肠埃希氏菌O157：H7、ATCC 29212粪链球菌、ATCC 13124产气荚膜梭菌、ATCC 27853铜绿假单胞菌、CICC 21617副溶血性弧菌、CICC 21544阪崎克罗诺杆菌、CICC 21534福氏志贺氏菌。
人工污染方法：将表2中10株菌株在相应的培养条件下培养24h，挑取菌落于无菌水中制成菌悬液，使用PCA培养基在相应的培养条件下培养48h，对菌悬液进行计数。
计数后，依据每株菌的计数结果，用无菌水稀释菌悬液，10株菌分别稀释至106、105、104、1034个浓度，每个稀释度分别加入1mL到含有10g基质的肠道增菌液肉汤中，肠道增菌液按照菌液量的不同加入不同体积，第一组加入86mL，第二组加入87mL，第三组加入89mL，第四组加入88mL，第五组加入88mL，第六组加入87mL，第七组加入87mL，第八组加入87mL，第九组加入80mL，增菌前和增菌后(好氧，36℃，18h)分别吸取1mL提取DNA，随后用十重PCR体系进行扩增。
第九组实验中，除选择肠道增菌液肉汤增菌外，还选择缓冲蛋白胨水(BPW)、7.5％氯化钠肉汤、LB肉汤、改良EC肉汤(mEC+n)、3％氯化钠碱性蛋白胨水、营养肉汤(NB)、志贺氏菌增菌液、肠道增菌液分别对10株菌的4个浓度进行增菌。
通过人工污染样品评价实验发现，本发明涉及的10种致病菌在增菌后检测灵敏度均能达到10CFU/mL以上，且扩增条带清晰明显，扩增效果好。
本发明还提供一种检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒，采用上述用于快速检测九种食源性致病菌多重PCR检测用引物制备得到的试剂盒。所述用于快速检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒还包括所述试剂盒包括2×Multiplex PCR MasterMix、Taq酶、阳性质控模板、去离子水。
三、实施例应用
1、引物特异性验证
本发明以表3中的菌株DNA为模板，分别加入10对引物进单重PCR扩增，以验证引物的特异性。
表3 10种食源性致病菌及其近缘种菌株
单重PCR反应体系：10×PCR buffer2.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，10mmol/L的dNTP 0.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，dd H2O补充至50μL。
单重PCR反应条件：95℃预变性5min，进入PCR循环：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳条件：琼脂糖凝胶浓度为1.5％，电泳液浓度为1×TAE，取8-15μLPCR扩增产物进行分析，DNA Marker(分子量：100bp、50bp)，电压220V，时间约20min。
根据所设计的10对特异性引物对供试菌种进行PCR检测，结果表明1株单核细胞增生李斯特氏菌菌株、7株沙门氏菌属菌株、7株克罗诺杆菌属菌株、4株志贺氏菌属菌株、1株金黄色葡萄球菌菌株、1株副溶血性弧菌菌株、1株大肠埃希氏菌O157：H7菌株、1株铜绿假单胞菌菌株、1株粪链球菌菌株、5株产气荚膜梭菌种均扩增出目的条带，而其它阴性对照菌株均未扩增出明显的目的条带，结果表明所设计的10对引物具有高度特异性。
2、扩增产物测序
利用筛选的10对特异引物分别进行单重PCR扩增，并进行凝胶电泳验证后，将其产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司代为测序。
PCR产物测序结果通过BLAST与目的基因进行序列对比，相似率均达到98％以上。结果表明该扩增产物与目标基因序列高度一致，均成功扩增到目的基因的目的片段。
3、单重PCR反应退火温度筛选
用筛选得到的引物组，设置温度梯度进行单重PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳分析，选择条带清晰的退火温度，确定为单重PCR的最佳退火温度。退火温度依次为55.0℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63.0℃、64.3℃、65℃。
由梯度PCR扩增结果可以看出，单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157：H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌的特异引物在55.0℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63.0℃、64.3℃、65℃8个退火温度下均能扩增出目的条带，但铜绿假单胞菌56.9℃时条带最亮，扩增效果最好，副溶血性弧菌在55-63℃下扩增差异不明显，在64.3℃、65℃时条带明显变暗，其余菌株在8个退火温度下扩增效果无明显差异，固后续单重PCR检测灵敏度实验的退火温度以及十重PCR检测条件优化的初始退火温度均选择57℃。
4、引物灵敏度验证
以表2中的10株菌株DNA为模板，用dd H2O进行10倍梯度稀释，并进行相应的单重PCR体系扩增，验证各体系灵敏度。
通过PCR检测，单核细胞增生李斯特氏菌菌株的灵敏度为5.37×10-6ng/μL，金黄色葡萄球菌菌株的灵敏度为5.37×10-4ng/μL，志贺氏菌属菌株的灵敏度为6.04×10-6ng/μL，副溶血性弧菌菌株的灵敏度为8.85×10-3ng/μL，铜绿假单胞菌菌株的灵敏度为9.52×10- 6ng/μL，粪链球菌菌株的灵敏度为8.91×10-7ng/μL，产气荚膜梭菌的灵敏度为7.33×10- 6ng/μL，沙门氏菌属菌株的灵敏度为7.10×10-3ng/μL，克罗诺杆菌属菌株的灵敏度为7.49×10-7ng/μL，大肠埃希氏菌O157：H7菌株的灵敏度为7.20×10-3ng/μL。
5、十重PCR体系建立
以单核细胞增生李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157：H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌10种致病菌DNA为模板,使用筛选到的特异引物进行十重PCR反应，并对退火温度和反应体系进行优化，具体步骤如下：
(1)自配体系
从单重PCR开始，依次逐级增加至十重PCR反应，PCR反应体系为10×PCR buffer5.0μL，正反引物终浓度均为10μM，10mmol/L的dNTP 1.0μL，5U/μL的Taq酶1.0μL，DNA模板均为1.0μL，25mmol/L的Mg2+3μL，补充dd H2O至50μL。
(2)使用2×多重PCR扩增试剂盒
从单重PCR开始，逐级增加至10重PCR反应，PCR反应体系为2×Multiplex PCRMaster Mix 25μL，10μmol/L的正反引物各0.5μL，5U/μL的HS Taq DNA酶1μL，DNA模板均1.0μL，补充dd H2O至50μL。
使用自配体系进行多重PCR时，最多仅能扩增到五重条带，结果见图1，继续增加DNA模板无法扩增出其余条带；使用2×多重PCR扩增试剂盒进行多重PCR时，在体系中可顺利扩增出十重目的条带，见图2。
(3)退火温度进行优化
将十重PCR的退火温度设计梯度PCR，退火温度依次为55.0℃、、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63.0℃、64.3℃、65℃，选出最佳退火温度，除退火温度外的PCR反应条件为：95℃预变性4min后，进入PCR循环：95℃变性30s，梯度退火温度复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。设置55.0℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63.0℃、64.3℃、65℃的退火温度梯度进行十重PCR扩增，扩增结果如图3，结果显示优化的8个退火温度均能扩增出十重条带，且条带均比较清晰，这与单重体系退火温度优化实验结果一致。
为验证扩增的十重条带均为特异性条带，无非特异扩增，在十重体系中加入10对特异性引物，分别对表2中每个菌株DNA模板进行扩增。分别使用上述梯度PCR优化中的60℃、62℃作为十重PCR扩增退火温度，扩增结果见图4(A、B)，可见退火温度为60℃时，在扩增粪链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌DNA模板时出现非特异扩增，特异性较差，在62℃作为退火温度时，10对特异性引物均只针对加入的模板扩增出特异性条带，无非特异扩增，62℃可作为十重PCR扩增体系的退火温度。
(4)引物浓度优化
固定加入的模板浓度(50ng/μL)和加入量(1.0μL)，10对引物(浓度10μmol/L)分别选择0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL，根据扩增条带的明暗和引物二聚体情况判断最佳引物浓度。
不同引物终浓度的十重PCR扩增结果见图5，由图5(A)可知，引物浓度为10μM加入0.1μL时，无法完全扩增出10个目的条带，由图5(B)可知，加入引物0.2μL时，可扩增出十个条带，但条带较模糊，由图5(C-E)可知，加入引物0.3-0.5μL时均可扩增出清晰的目的条带，并且引物二聚体情况均不明显。因此本发明的多重体系在引物浓度为10μM时加入0.3-0.5μL的引物均有很好的扩增效果。
(5)模板量优化
为确定最佳反应体系，固定引物浓度和加入量，对反应体系重要影响因素-模板浓度进行优化，十个模板DNA的加入量分别选择10ng、25ng、50ng，根据扩增条带的明暗程度判断最佳模板量。
每对浓度10μM的引物各加0.5μL，不同模板量的十重PCR扩增结果见图6，由图6(A)可知，每个模板加入10ng时，可扩增出十个条带，但分子量较低的条带稍模糊，由图6(B、C)可知，每个DNA模板量分别加入25ng、50ng均可扩增出清晰的产物条带。因此本发明体系中模板DNA量不低于10ng时均可扩出十重产物条带。
(6)琼脂糖凝胶电泳条件优化
十重PCR产物由于目的条带较多，琼脂糖凝胶的浓度对结果影响十分大，浓度太低，跑胶时间较短，会导致10个条带无法分开；浓度太高，会延长跑胶时间，但时间太久会导致小片段DNA降解，从而影响实验结果，本发明通过固定核酸染料浓度(10μL/100mL)，电泳液浓度(1×TAE)，PCR扩增产物上样量(25μL)以及电泳条件(电压220V，时间约40min)，选择不同琼脂糖凝胶浓度(1.5％，2％，2.5％)，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选出最佳琼脂糖凝胶浓度。
结果见图7，由图7(A-C)可知，相同电压条件，琼脂糖凝胶浓度越大条带分离越开，条带也越清晰，且在跑胶时间内，所有条带未发生降解。因此，在本发明中均采用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳。
(7)十重PCR体系特异性验证
以本发明中菌株DNA为模板(其中斯氏李斯特菌ATCC 35967、伊氏李斯特菌ATCC19119、英诺克李斯特菌CICC 10417、威氏李斯特菌CICC 21672、格氏李斯特菌CICC 21670、马红球菌ATCC 6939、表皮葡萄球菌CICC 10294、创伤弧菌CICC21615、恶臭假单胞菌CICC21624、鸡肠球菌CICC24240、铅黄肠球菌CICC10433、生孢梭菌CICC10385为非目标菌)，加入10对特异性引物进行十重PCR扩增，以验证该反应体系的特异性，依据现行标准中各类样品需检测的致病菌类型组合，特异性验证实验分组如下：
第一组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第二组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第三组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第四组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157：H7的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第五组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第六组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第七组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、克罗诺杆菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
第八组：十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，仅加入粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的DNA和本发明中非目标菌DNA为模板，进行十重PCR反应。
本发明中的12株非目标菌均未出现特异性条带，并且第一组至第八组的实验结果表明，十重PCR反应均只扩增了加入的目标菌特异性条带，无非特异扩增，故验证本发明的多重PCR体系具有特异性，能够进行10种目标菌的检测。具体结果见图8(A-H)。
(8)十重PCR体系灵敏度验证
采用优化好的反应体系和反应条件，于十重PCR体系中同时加入10对特异性引物，再分别加入表2中的10株菌株DNA各稀释度为模板，分别于十重PCR体系中验证各个单一菌种的检测灵敏度。
通过十重PCR检测，单核细胞增生李斯特氏菌菌株的灵敏度为5.37×10-2ng/μL，见图9(A)；金黄色葡萄球菌菌株的灵敏度为5.37×10-2ng/μL，见图9(B)；副溶血性弧菌菌株的灵敏度为8.85×10-1ng/μL，见图9(C)；粪链球菌菌株的灵敏度为8.91×10-1ng/μL，见图10(A)；产气荚膜梭菌的灵敏度为7.33×10-1ng/μL，见图10(B)；沙门氏菌属菌株的灵敏度为7.10×10-1ng/μL，见图10(C)；克罗诺杆菌属菌株的灵敏度为7.49×10-2ng/μL，见图11(A)；志贺氏菌属菌株的灵敏度为6.04×10-2，见图11(B)；大肠埃希氏菌O157：H7菌株的灵敏度为7.20×10-2ng/μL，见图11(C)；铜绿假单胞菌菌株的灵敏度为9.52×10-2ng/μL，见图11(D)。
(9)十重PCR检测方法的初步应用与评价
食品种类较多，检测基质也较多，不同基质对于细菌的培养以及DNA提取均会产生不同的影响，本发明为验证建立的多重PCR检测方法的实用性和准确性，选取人工污染的不同基质样品进行测试实验，进一步验证该多重PCR方法检测的灵敏度。
1)人工污染分组如下：
第一组：
基质：牛肉干，污染菌株：ATCC 19115单核细胞增生李斯特氏菌、CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21530大肠埃希氏菌O157：H7。
第二组：
基质：海苔，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21617副溶血性弧菌。
第三组：
基质：巧克力，污染菌株：CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第四组：
基质：面包，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第五组：
基质：椰汁，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌。
第六组：
基质：鸡精，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21534福氏志贺氏菌。
第七组：
基质：奶粉，污染菌株：CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21544阪崎克罗诺杆菌。
第八组：
基质：矿泉水，污染菌株：ATCC 29212粪链球菌、ATCC 13124产气荚膜梭菌、ATCC27853铜绿假单胞菌。
第九组：
基质：牛肉干，污染菌株：ATCC 19115单核细胞增生李斯特氏菌、CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21530大肠埃希氏菌O157：H7、ATCC 29212粪链球菌、ATCC 13124产气荚膜梭菌、ATCC 27853铜绿假单胞菌、CICC 21617副溶血性弧菌、CICC 21544阪崎克罗诺杆菌、CICC 21534福氏志贺氏菌。
2)人工污染方法
将表2中10株菌株在相应的培养条件下培养24h，挑取菌落于无菌水中制成菌悬液，使用PCA培养基在相应的培养条件下培养48h，对菌悬液进行计数。
计数后，依据每株菌的计数结果，用无菌水稀释菌悬液，10株菌分别稀释至106、105、104、103 4个浓度，每个稀释度分别加入1mL到含有10g基质的肠道增菌液肉汤中，肠道增菌液按照菌液量的不同加入不同体积，第一组加入86mL，第二组加入87mL，第三组加入89mL，第四组加入88mL，第五组加入88mL，第六组加入87mL，第七组加入87mL，第八组加入87mL，第九组加入80mL，增菌前和增菌后(好氧，36℃，18h)分别吸取1mL提取DNA，随后用十重PCR体系进行扩增。
第九组实验中，除选择肠道增菌液肉汤增菌外，还选择缓冲蛋白胨水(BPW)、7.5％氯化钠肉汤、LB肉汤、改良EC肉汤(mEC+n)、3％氯化钠碱性蛋白胨水、营养肉汤(NB)、志贺氏菌增菌液、肠道增菌液分别对10株菌的4个浓度进行增菌。
通过人工污染样品评价实验发现，本发明涉及的10种致病菌在增菌后检测灵敏度均能达到10CFU/mL以上，且扩增条带清晰明显，扩增效果好，但增菌前，不同基质中的肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、产气夹馍梭菌灵敏度均不能达到10CFU/mL，灵敏度较低，见图12-20。固本发明建立的十重PCR检测方法需对食品进行前增菌处理，才能满足检验需要，避免漏检。
6、十重PCR检测试剂盒组装
表4十重PCR检测试剂盒组成
序号 产品组成 规格
1 Mix buffer 35μL/管×10
2 阳性质控 15μL/管×10
3 HS Taq酶(5U/μL) 15μL/管×1
4 ddH20 500μL/管×1
Mix buffer包含2×Multiplex PCR MasterMix、引物对(本发明设计的10对特异性引物)，阳性质控包含10株菌株基因组DNA(浓度均为50ng/μL，分别为ATCC 19115单核细胞增生李斯特氏菌、CICC 21600金黄色葡萄球菌、CICC 21617副溶血性弧菌、ATCC 29212粪链球菌、ATCC 13124产气荚膜梭菌、CICC 21482肠炎沙门氏菌、CICC 21544阪崎克罗诺杆菌、CICC 21534福氏志贺氏菌、CICC 21530大肠埃希氏菌O157：H7、ATCC 27853铜绿假单胞菌)。
7、十重PCR检测试剂盒的操作和结果判断
(1)样本制备：取增菌液(肠道增菌液肉汤)1mL于1.5mL离心管中，采用商品化基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。
(2)反应体系配制：从试剂盒中取出试剂放在4℃冰盒里缓慢融化，融化后加入Taq酶1μL，加入提取的DNA模板(DNA量大于10ng)，补充ddH2O至50μL。阳性对照、阴性对照、空白对照体系分别加入与提取模板等量的阳性对照、阴性对照和dd H2O，再补充ddH2O至50μL。
(3)反应条件：预变性95℃4min；变性95℃30s，复性62℃30s，延伸72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
注：洗脱缓冲液TE提前预热65℃提取效果更好，菌液处理建议采用溶菌酶处理，具体方法为：向菌体沉淀加入200uL溶菌酶溶液(50mg/ml)，振荡至菌体彻底悬浮，37℃处理2h，其余均同试剂盒方法。
(4)结果分析
琼脂糖凝胶电泳：对十重PCR扩增产物进行电泳分析，使用2.5％琼脂糖凝胶，且胶块的长度不小于10cm。电压一般采用200-220V、电泳时间40-50min，推荐使用条带大小间隔100bp的DNA Marker，阳性对照电泳图如图21。
(5)结果判定：根据100bp Marker、阳性对照、阴性对照、空白对照判断条带大小，进而确定致病菌种类，具体见下表：
表5
8、试剂盒重复性、稳定性和保存期试验
试验方法：
试剂盒0：冻存前进行十重PCR检测；
试剂盒1-1、1-2、1-3：-20℃冻存30d，进行十重PCR检测；
试剂盒2-1、2-2、2-3：-20℃冻存60d，进行十重PCR检测；
试剂盒3-1、3-2、3-3：-20℃冻存90d，进行十重PCR检测。
由实验结果知，不同储存时间的试剂盒均扩增出十个目标条带，且条带亮度无明显变化，见图22，本发明组装的试剂盒的重复性好，稳定性好，可在-20℃条件下稳定保存3个月以上。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市计量质量检测研究院
<120> 一种检测十种食源性致病菌多重PCR检测用引物及试剂盒
<130> 01
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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Claims (8)

1.一种检测九种食源性致病菌多重PCR检测引物，其特征在于，所述引物的序列由SEQID NO.1至SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列组成。
2.一种利用多重PCR同时快速检测九种食源性致病菌的方法，其特征在于，提取待检测产品基因组DNA作为模板，在引物存在下进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析即完成产品中食源性致病菌成分的检测；所述引物的序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；所述方法为非疾病诊断治疗目的。
3.根据权利要求2所述利用多重PCR同时快速检测九种食源性致病菌的方法，其特征在于，进行电泳的条件为：核酸染料浓度为10μL/100mL；电泳液浓度为1×TAE；PCR扩增产物上样量为25μL；电泳的电压为220V；时间为40min；琼脂糖凝胶浓度分别为1.5%、2%、2.5%。
4.一种检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，采用权利要求1所述检测九种食源性致病菌多重PCR检测引物制备得到的试剂盒。
5.根据权利要求4所述检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒还包括2×Multiplex PCR MasterMix、Taq酶、阳性质控模板、去离子水。
6.根据权利要求4所述检测九种食源性致病菌的多重PCR试剂盒在利用多重PCR同时检测九种食源性致病菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，多重PCR的升温程序为95℃预变性4min；95℃变性30s，55.0℃复性30s，55.7℃复性30s，56.9℃复性30s，58.8℃复性30s，61.1℃复性30s，63.0℃复性30s，64.3℃复性30s，65℃复性30s，72℃延伸1min共35个循环；最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，多重PCR反应体系如下：Mix buffer为35μL；Taq酶为1μL；引物量为10μM，各为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL；DNA模板量分别为10ng、25ng、50ng；补充dd H2O至50μL。
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