CN112725478A - 同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 - Google Patents
同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112725478A CN112725478A CN202110051070.XA CN202110051070A CN112725478A CN 112725478 A CN112725478 A CN 112725478A CN 202110051070 A CN202110051070 A CN 202110051070A CN 112725478 A CN112725478 A CN 112725478A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- salmonella
- upstream
- shigella
- escherichia coli
- clostridium welchii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims abstract description 37
- 241000607768 Shigella Species 0.000 title claims abstract description 37
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 title claims abstract description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract description 15
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract description 7
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 4
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 4
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 4
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010022653 Intestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 2
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 2
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150004203 plc gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 206010017982 Gastrointestinal necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010022714 Intestinal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 101150114988 invA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 101150021607 rppH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082821 sacA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 101150070603 yadA gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和大肠杆菌的四重PCR检测引物组，包含四对引物，分别是志贺菌上下游引物对分别是SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；沙门氏菌上下游引物对分别是SEQIDNO:3，SEQIDNO:4；魏氏梭菌A型引物对分别是SEQIDNO:5，SEQIDNO:6；大肠杆菌引物对分别是SEQIDNO:7，SEQIDNO:8。本发明针对鸡场常见的肠道致病菌建立的多重检测方法，检测准确性高，特异性好的基础上，还缩短了检测时间，提高了检测效率，更有利于在规模化养殖生产中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR检测引物组及试剂盒。
背景技术
大肠杆菌，魏氏梭菌，沙门氏菌，志贺氏菌这四种细菌都是鸡的肠道寄生菌。鸡大肠杆菌，主要寄生在鸡的上部肠道部位，感染后可引起鸡的腹泻。并会造成胚胎和幼雏的死亡，败血症，腹膜炎等并发症。魏氏梭菌又名产气荚膜梭菌，寄生在鸡的肠道部位，鸡感染了魏氏梭菌以后，可造成肠道出血，溃疡以及坏死。沙门氏菌在鸡肠道内感染后腹泻，排稀薄如白色浆糊状粪便，致肛门周围被粪便污染。鸡肠道感染志贺氏菌后会长生明显的脓血痢疾以及肠道出血。
在现在社会的发展中，养鸡模式普遍都是规模化养殖，在规模化养殖中过冷，过热或者鸡群的免疫力降低都会使鸡群肠道微生物群紊乱，极易造成肠道性致病菌的流行和散播。这些肠道性致病菌对鸡的消化和吸收造成影响，导致饲料转化率降低，生长速度迟缓，可带来较大的经济损失。
目前，有多个鸡源细菌多重PCR相关的检测方法报道，例如2020年公布的专利CN111534619A是关于鸡源大肠杆菌，沙门氏菌，巴氏杆菌的多重方法建立；2019年发布了一篇鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌多个细菌检测的CN201910677701.1专利；在2018年的CN201810317451.6这篇专利中是写了大肠杆菌，特异性巴氏杆菌，奇异变形杆菌这三种等，但是有关检测常见的禽源肠道致病性细菌相关的专利并不多。
发明内容
本发明的目的是建立一种能同时检测这几种常见感染率较高的禽源肠道致病菌的方法，试验结果表明此方法特异性强，灵敏度高，准确性好，有益于各养禽场应用以及推广。
首先，本发明提供四组同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR检测引物组，引物序列如下：
本发明还提供一种同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：
A液：
PCR反应液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、所述的志贺菌上下游引物各0.6μL，沙门氏菌上下游引物各0.7μL，魏氏梭菌上下游引物各0.6uL、大肠杆菌上下游引物各0.5uL，ddH2O3.3uL，其中引物对浓度均为10uM；
B液：
阳性质粒50μL；
C液：
100uL ddH2O作为阴性对照。
利用本发明提供的试剂盒，本发明还提供一种多重PCR检测方法包括如下步骤：
(1)核酸提取：
采用细菌提取试剂盒对基因的DNA核酸进行提取；
(2)多重PCR体系的配置：
总体系25μl：MIX12.5μl、大肠杆菌上下游引物各0.5μl、魏氏梭菌上下游引物0.6μl、沙门氏菌上下游引物各0.7μl、志贺氏菌上下游引物0.6μl、模板各1μlddH2O3.3μl；
(3)PCR反应程序：
94℃2min；98℃10s；64℃1min30s，30个循环；
(4)多重PCR特异性和灵敏度检测
将四种菌的靶标放入配置好的多重PCR体系中，从结果分析查看显示的条带并对比条带的大小与预期是否一致。在此基础上，检测多重引物的特异性，采用弯曲杆菌，副溶血弧菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，铜绿假单胞菌与四种目的基因同时扩增。灵敏度是用对原浓度的靶标梯度稀释10-1-10-7倍，根据结果图查看，并检测最低检测限的浓度。
(5)结果分析：
经2％的琼脂糖凝胶电泳分析(120V，15min)；目的条带大小与预期一致，通过实验中的引物扩增除了靶标能扩增出条带，其他菌都显示阴性。实验中所用引物特异性好，灵敏度实验从结果分析最低能检测到10-5倍。
为了提高其准确性的基础上，增强检测效率，本实验经过不断的优化检测条件(引物比列，退火温度)。不但将此方法建立成功，而且还能将传统的三步法，替换为两步法，大大缩减了检测的时间。
本发明的有益效果：
本发明针对鸡场常见的肠道致病菌建立的多重检测方法，在鸡场中我们可以发现志贺氏菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌这几种菌在肠道寄生是较为常见的。建立这几种菌的快速检测方法是从解决生产中出现的问题入手，具有很好的经济价值。
本发明选择志贺氏菌的ipah基因，沙门氏菌的inva基因，魏氏梭菌的plc基因，大肠杆菌的phoA基因来设计引物，通过综合考虑发夹结构，交叉引物二聚体，自我二聚体等这些因素影响，最终设计的引物之间同源关系较小，不易产生稳定的引物二聚体。
本发明不同于其他发明的三步法检测程序中的变性、退火、延伸三步法，而是采用二步法只需要进行变性、延伸两步法。在时间上两步法是比三步法更能节约检测时间。结果的准确性而言将两步法和三步法的扩增结果进行对比，二者的准确性，特异性一致，因而从养殖场的可利用角度分析。二步法较高的检测效率是更有利于在养殖场推广和利用。
附图说明
图1多重混合模板PCR扩增结果图；图1M：Marker，泳道1：志贺菌133bp+沙门氏菌423bp+大肠杆菌697bp+魏氏梭菌840bp。
图2多重PCR特异性实验电泳结果图；M：Marker2500，泳道1：志贺菌133bp+沙门氏菌423bp+大肠杆菌697bp+魏氏梭菌840bp；泳道2：志贺菌133bp；泳道3：423bp；泳道4:大肠杆菌697bp；泳道5:魏氏梭菌840bp；泳道6：弯曲杆菌；泳道7：副溶血弧菌；泳道8：金黄色葡萄球菌；泳道9：链球菌；泳道10：变形杆菌；泳道11：霍乱弧菌；泳道12：铜绿假单胞菌；泳道13：阴性对照。
图3：多重混合模板PCR敏感性电泳图；M：Marker2500，泳道1：(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道2：10-1倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道3：10-2倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道4：10-3倍(133bp，423bp，697bp，840bp)泳道5：10-4倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道6：10-5倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，最低检测限度22.5pg/mL。
图4：部分实际样本检测结果电泳图；M：Marker2500，泳道1：志贺菌133bp+沙门氏菌423bp+大肠杆菌697bp+魏氏梭菌840bp；泳道2：志贺菌133bp；泳道3：大肠杆菌697bp；泳道4：志贺菌133bp；泳道5：沙门氏菌423bp；泳道6：沙门氏菌423bp；泳道7：魏氏梭菌840bp：泳道8：沙门氏菌423bp；泳道9：志贺菌133bp；泳道10：大肠杆菌697bp；泳道11：魏氏梭菌840bp；泳道12：沙门氏菌423bp；泳道13：志贺菌133bp。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR检测引物组，包含四对引物，分别是志贺菌上下游引物对分别是SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；沙门氏菌上下游引物对分别是SEQIDNO:3，SEQIDNO:4；魏氏梭菌A型引物对分别是SEQIDNO:5，SEQIDNO:6；大肠杆菌引物对分别是SEQIDNO:7，SEQIDNO:8。
引物设计在NCBI数据库中根据志贺菌的(ipah)基因，沙门氏菌的(invA)基因，魏氏梭菌(plc)基因，大肠杆菌(phoA)基因提取相应的碱基序列。
引物序列信息如下：
实施例2混合模板PCR扩增
将志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的模板各取1μL放入混匀的体系中。从结果图1分析：结果图中显示的目标条带的结果和大小与预期的一致。为了后期临床实际样本检测做准备，对所建多重PCR方法的特异性进行验证。
实施例3混合模板多重PCR扩增特异性实验
利用本发明提供的引物和检测方法进行混合模板多重PCR扩增特异性实验，具体设计如下：
泳道1：志贺菌133bp+沙门氏菌423bp+大肠杆菌697bp+魏氏梭菌840bp；
泳道2：志贺菌133bp；
泳道3：423bp；
泳道4:大肠杆菌697bp；
泳道5:魏氏梭菌840bp；
泳道6：弯曲杆菌；
泳道7：副溶血弧菌；
泳道8：金黄色葡萄球菌；
泳道9：链球菌；
泳道10：变形杆菌；
泳道11：霍乱弧菌；
泳道12：铜绿假单胞菌；
泳道13：阴性对照。
结果见图2：只有志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的靶标检测结果显示阳性，多重特异实验中用到的弯曲杆菌，副溶血弧菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，铜绿假单胞菌结果显示为阴性。结果证明建立的多重PCR方法特异性良好。
实施例4敏感性实验
用nanodrop-2000测得志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的人工质粒浓度，并调整至10ng/ul，10倍稀释梯度后等体积混合作为模板，进行四重PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳，结果如图3所示，点样顺序从左至右依次为：
泳道1：(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道2：10-1倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道3：10-2倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道4：10-3倍(133bp，423bp，697bp，840bp)泳道5：10-4倍(133bp，423bp，697bp，840bp)，泳道6：10-5倍(133bp，423bp，697bp，840bp)。
从电泳结果可以看出，人工质粒的最低检出限为10-5稀释度，最低检测限度22.5pg/mL。
实施例5实际样品检测
样品是2020年2月-8月在淄博，平度，烟台养鸡场采集60份样品(病鸡的内脏和粪便)，采用本发明提供的检测方法对采集的60份样本进行检测，先提取核酸，再按照试剂盒中PCR程序进行扩增电泳，结果如图4所示。检测结果统计沙门氏菌13份，沙门氏菌和大肠杆菌混合感染15份，大肠杆菌9份，魏氏梭菌15份，志贺氏菌8份。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR检测引物组，其特征在于，包含四对引物，分别是志贺菌上下游引物对分别是SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；沙门氏菌上下游引物对分别是SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4；魏氏梭菌A型引物对分别是SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6；大肠杆菌引物对分别是SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8。
2.一种同时检测志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：
A液：
PCR反应液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、权利要求1所述的志贺菌上下游引物各0.6μL，沙门氏菌上下游引物各0.7μL，魏氏梭菌上下游引物各0.6uL、大肠杆菌上下游引物各0.5uL，ddH2O 3.3uL，其中引物对浓度均为10uM；
B液：
阳性质粒50μL；
C液：
100uL ddH2O作为阴性对照。
3.志贺菌，沙门氏菌，魏氏梭菌，大肠杆菌的四重PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)核酸提取：
采用细菌提取试剂盒对基因的DNA核酸进行提取；
(2)PCR体系的配置：
总体系25μl：MIX12.5μl、大肠杆菌上下游引物各0.5μl、魏氏梭菌上下游引物0.6μl、沙门氏菌上下游引物各0.7μl、志贺氏菌上下游引物0.6μl、模板各1μlddH2O3.3μl；
(3)PCR反应程序：
94℃2min；98℃10s；64℃1min30s，30个循环；
(4)观察结果：
经2％的琼脂糖凝胶电泳分析(120V)；观察在133bp处是否出现志贺菌相对应的条带，在423bp处是否出现沙门氏菌相对应的条带，在840bp处是否出现魏氏梭菌相对的条带，在697bp处是否出现大肠杆菌相对的条带。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110051070.XA CN112725478A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110051070.XA CN112725478A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112725478A true CN112725478A (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=75591633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110051070.XA Pending CN112725478A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112725478A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277170A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-04-05 | 重庆市计量质量检测研究院 | 一种检测十种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒 |
| CN114774564A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-07-22 | 湖南大圣宠医生物科技有限公司 | 检测牛腹泻病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 |
| CN115786546A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-03-14 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575637A (zh) * | 2009-05-27 | 2009-11-11 | 中国科学院南京土壤研究所 | 土壤中病原细菌的多重pcr检测方法 |
| CN105506104A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-20 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 多重pcr检测水产品中四种食源性致病菌的引物组及方法 |
| CN112080572A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-15 | 青岛英赛特生物科技有限公司 | 同时检测鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，魏氏梭菌a型的三重pcr引物组及试剂盒 |
-
2021
- 2021-01-14 CN CN202110051070.XA patent/CN112725478A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575637A (zh) * | 2009-05-27 | 2009-11-11 | 中国科学院南京土壤研究所 | 土壤中病原细菌的多重pcr检测方法 |
| CN105506104A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-20 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 多重pcr检测水产品中四种食源性致病菌的引物组及方法 |
| CN112080572A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-15 | 青岛英赛特生物科技有限公司 | 同时检测鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，魏氏梭菌a型的三重pcr引物组及试剂盒 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277170A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-04-05 | 重庆市计量质量检测研究院 | 一种检测十种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒 |
| CN114277170B (zh) * | 2022-02-17 | 2024-02-13 | 重庆市计量质量检测研究院 | 一种检测九种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒 |
| CN114774564A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-07-22 | 湖南大圣宠医生物科技有限公司 | 检测牛腹泻病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 |
| CN115786546A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-03-14 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112725478A (zh) | 同时检测志贺菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌的四重pcr检测引物组及试剂盒 | |
| CN108251548B (zh) | 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒 | |
| CN104946749B (zh) | 一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用型引物与探针以及试剂盒 | |
| CN105256048B (zh) | 口腔致病菌多重pcr检测引物组和探针组及其应用 | |
| CN110004240B (zh) | 基于rpa的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及其用途 | |
| CN110734994A (zh) | 用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒 | |
| CN110305975B (zh) | 一种快速检测鸡滑液囊支原体的rpa试剂盒及其用途 | |
| CN113186312B (zh) | 一种区分布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的分子标记 | |
| CN109706257B (zh) | 一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法 | |
| CN106801103B (zh) | 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法 | |
| CN108707695A (zh) | 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN110699470A (zh) | 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重pcr引物、试剂盒、应用和方法 | |
| CN116287337A (zh) | 共同检测ra和pm的引物探针组合物、方法及试剂盒 | |
| CN111719020B (zh) | 一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针 | |
| CN110129460B (zh) | 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法 | |
| KR20150059672A (ko) | 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법 | |
| CN105695579A (zh) | 一种快速检测副鸡禽杆菌的试剂盒 | |
| CN110157819B (zh) | 一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的lamp试剂盒 | |
| CN112899385A (zh) | 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用 | |
| CN107227378B (zh) | 检测拟态弧菌的rpa-iac引物及方法 | |
| JP2007075017A (ja) | Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出法 | |
| CN113493846B (zh) | 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN112538543B (zh) | 用于检测沙门氏菌属的特异性引物及其试剂盒 | |
| CN114606328B (zh) | 检测弯曲菌的引物组、探针及其试剂盒、应用与检测方法 | |
| CN111518929A (zh) | 牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重pcr快速诊断试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210430 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |