CN108251548B - 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒 - Google Patents

禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，引物组包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA‑F和PhoA‑R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT‑F和KMT‑R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD‑F和AtpD‑R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA‑F和PETA‑R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA‑F和InvA‑R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC‑F和NuC‑R。

Description

禽致病性大肠杆菌等的多重PCR检测引物组、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法。
背景技术
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是危害养禽业的主要病原微生物。
禽致病性大肠杆菌感染禽类后，出现肝肿大、肠道粘膜出血和溃疡、心包发炎等症状，该菌血清型众多，存在广泛的耐药性,不易控制,由于防控过程中抗生素的大量使用，易造成禽产品中的药物残留,严重影响人体健康和导致公共卫生问题。
禽巴氏杆菌病又名禽霍乱，由多杀性巴氏杆菌引起。该病主要引发成年鸡出现急性败血性症状或传染性肺炎，具有较高的死亡率以及由此导致的生产性能低下等特点。
奇异变形杆菌是多发生于雏鸡，以肢体瘫痪和水样腹泻为主要特征的急性传染病。
绿脓杆菌主要危害10日龄内的雏鸡，以拉稀、呼吸困难、皮下水肿为特征，已成为威胁养鸡业发展的主要疾病之一。
沙门菌有2000多个血清型，部分血清型可以导致人和动物感染。由鸡白痢沙门菌所引起的称为鸡白痢，由鸡伤寒沙门菌引起的称为禽伤寒，沙门菌主要经卵传递，消化道、呼吸道和损伤的皮肤或粘膜感染，雏鸡发病率、死亡率最高。
金黄色葡萄球菌感染禽类后，病禽出现败血症、脐炎和关节炎等多种临床症状，该菌存在严重的多重耐药性，可通过皮肤外伤或黏膜破损而感染,也可以经呼吸道而感染。
目前对这些病原细菌的检测,主要依靠常规的细菌学培养方法,耗时长，操作繁琐，费时耗力。用于病原细菌检测的方法包括乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定法、核酸杂交和PCR技术等。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种或几种病原细菌。
多重PCR(Multiplex PCR)技术是基于常规PCR发展来的DNA片段扩增技术，可实现在同一反应体系中检测多种病原菌。
发明内容
为了解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA-F和PhoA-R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT-F和KMT-R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD-F和AtpD-R；特异性扩绿脓杆菌PETA基因的引物对PETA-F和PETA-R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA-F和InvA-R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC-F和NuC-R；
各个引物的核苷酸序列分别为：
PhoA-F，5’-GCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCC-3’；
PhoA-R，5’-TTGCAGGAAAAAGCCTTTCTCATTTT-3’；
KMT-F，5’-TTAACAGAGAGGTGAAAAATACCCCTA-3’；
KMT-R，5’-CTTTACGCTGATTAATATTGTGCTGAC-3’；
AtpD-F，5’-CTGGTGGCTCATTCATCT-3’；
AtpD-R，5’-ACAGTTAGGCGGTGGTAT-3’；
PETA-F，5’-TTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAG-3’；
PETA-R，5’-GAAGGTCTCCAGCGGCAGGTGGCAAGC-3’；
InvA-F，5’-AACCAGCAAAGGCGAGCAG-3’；
InvA-R，5’-CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG-3’；
NuC-F，5’-CCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAG-3’；
NuC-R，5’-TAAATATACGCTAAGCCACGTCCAT-3’。
本发明提供的引物组，还具有这样的特征：引物对PhoA-F和PhoA-R用于扩增的目的片段的大小为1001bp；引物对KMT-F和KMT-R用于扩增的目的片段的大小为755bp；引物对AtpD-F和AtpD-R用于扩增的目的片段的大小为509bp；引物对PETA-F和PETA-R用于扩增的目的片段的大小为363bp；引物对InvA-F和InvA-R用于扩增的目的片段大小为256bp；引物对NuC-F和NuC-R用于扩增的目的片段大小为155bp。
本发明的另一个目的是提供一种检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板；步骤2，制备特异性引物组，采用权利要求1或2中任意一项所述的引物组制备得到特异性引物组；步骤3，进行PCR扩增反应，基于步骤1得到的所述PCR模板，采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括所述引物组的PCR反应体系，然后采用该PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物；步骤4，进行电泳检测，对所述扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据所述电泳结果判定是否出现所述禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌或金黄色葡萄球菌。
本发明提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤3的PCR反应体系包括：2.5μL的10×反应缓冲液，0.125μL的浓度为8,000U/mL的Ex Taq聚合酶、2.5μL的浓度为2.5mM each的dNTP、2μL的浓度为25mM的Mg2+、1μL的所述PCR模板、10μL的超纯水，和所述引物组，在所述引物组中，引物对PhoA-F和PhoA-R的体积各为1.25μL，引物对KMT-F和KMT-R的体积各为0.5μL，引物对AtpD-F和AtpD-R的体积各位0.5μL，引物对PETA-F和PETA-R的体积各为1.0μL、引物对InvA-F和InvA-R的体积各为1.0μL、引物对NuC-F和NuC-R的体积各为1.0μL。
本发明提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：制备特异性引物组时，所述引物组中使用的各个引物的浓度为10μM。
本发明提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：所述预定PCR反应参数条件为94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
本发明提供的多重PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤4的具体过程为，向所述PCR扩增产物中加入5uL 6×loading buffer并混匀后得到混匀产物，取10uL所述混匀产物点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在120V电压下，电泳25min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果，根据电泳结果判断检测结果。
本发明还提供了一种根据上述的引物组在制备用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒中的应用。
本发明的还提供了一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：用于建立PCR反应体系的引物组，其中，所述引物组为上述的引物组。
本发明提供的多重PCR检测试剂盒，还具有这样的特征，其中，所述PCR反应体系为上述的多重PCR检测方法中建立得到的PCR反应体系。
本发明还提供了一种上述的多重PCR检测试剂盒在检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的中的应用方法，其特征在于：其中，采用上述的多重PCR检测方法进行所述检测。
发明作用与效果
本发明提供的提供的采用特定引物组的多重PCR检测方法，具有特异性强、敏感度高、检测时间短、操作简单、不需要贵重仪器、成本低等特点，有效地解决了在检测工作中使用其他技术手段时存在的问题，为快速准确地检测与鉴定禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌提供了有效的手段；同时该引物组还可以制备用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，此时，采用本发明提供的多重PCR检测方法，该多重PCR检测试剂盒就能快速准确地检测与鉴定禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌。
附图说明
图1-6为实施例1的PCR扩增产物的电泳结果；
图7为评价例1中特异性评价的试验结果；
图8为评价例2中最短检测时间评价的试验结果；
图9-20为评价例3进行反应灵敏性评价的试验结果。
具体实施方式
以下以对人工感染不同病原菌的三黄鸡进行多重PCR检测为例，结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1多重PCR检测方法
本实施例对6只7日龄三黄鸡，分别用禽致病性大肠杆菌(Avia n pathogenicEscherichia coli,APEC)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，绿脓杆菌(Pseudom onas aeruginosa)、沙门菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococ cus aureus)进行攻毒，攻毒24小时后，无菌采集攻毒鸡的血液、脾脏、肝脏和肾脏，分别采用多重PCR检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌，具体包括以下步骤：
步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板
无菌取攻毒三黄鸡的肝脏进行研磨，200目铜网过滤后，取滤液增菌4h后得到待检测细菌菌液作为PCR检测的模板。
步骤2，制备特异性引物组
利用禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌这6种病原菌鉴定的保守基因的全序列，设计12条引物。引物序列如表1：
Figure BDA0001624247350000081
根据设计的引物，使用浓度为10μM的各个引物，采用常规方法制备得到特异性引物组。
步骤3，进行PCR扩增反应
基于步骤1中得到的PCR模板，采用步骤2中的特异性引物组建立得到包括的引物组的PCR反应体系：取PCR管，分别加2.5μL的10×反应缓冲液，0.125μL的浓度为8,000U/mL的Ex Taq聚合酶、2.5μL的浓度为2.5mM each的dNTP、2μL的浓度为25mM的Mg2+、1μL的所述PCR模板、10μL的超纯水，步骤2中配制好的引物对PhoA-F和PhoA-R的体积各1.25μL，引物对KMT-F和KMT-R的体积各0.5μL，引物对AtpD-F和AtpD-R的体积各0.5μL，引物对PETA-F和PETA-R的体积各1.0μL、引物对InvA-F和InvA-R的体积各1.0μL、引物对NuC-F和NuC-R的体积各1.0μL，混匀，得到25μL的PCR反应体系。
然后采用上述PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物：预定PCR反应参数条件为94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
步骤4，进行电泳检测，
对步骤3中得到的扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据电泳结果判断是否出现禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌：
向PCR反应管中加入5uL 6×loading buffer并混匀后得到混匀产物，取10uL所述混匀产物点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在120V电压下，电泳25min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果。
图1-6为实施例1的PCR扩增产物的电泳结果。
其中图1为禽致病性大肠杆菌检测结果，图1中，M：2000bp；1～4泳道PCR模板大肠杆菌CFU分别为5×105、5×104、5×103、5×102；
图2为多杀性巴氏杆菌检测结果，图2中，M：2000bp；1～5泳道PCR模板多杀性巴氏杆菌CFU分别为6×106、6×105、6×104、6×103、6×102；
图3为奇异变形杆菌检测结果，图3中，M：2000bp；1～4泳道PCR模板奇异变形杆菌CFU分别为2.8×105、2.8×104、2.8×103、2.8×102；
图4为绿脓杆菌检测结果，图4中，M：2000bp；1～4泳道PCR模板绿脓杆菌CFU分别为8.6×105、8.6×104、8.6×103、8.6×102；
图5为沙门氏菌检测结果，图5中，M：2000bp；1～6泳道PCR模板沙门氏菌CFU分别为3.2×107、3.2×106、3.2×105、3.2×104、3.2×103、3.2×102；
图6为金黄色葡萄球菌检测结果，M：2000bp；1～5泳道PCR模板金黄色葡萄球菌CFU分别为5.6×106、5.6×105、5.6×104、5.6×103、5.6×102。
根据图1-6的电泳结果表明，运用本发明建立的方法，可以成功的从感染三黄鸡中检测到上述6种病原菌。
评价例1特异性评价
为验证本发明的特异性，分别对每种病原菌进行单独检测及混合检测。
图7为评价例1中特异性评价的试验结果。
如图7所示，图7中，M：2K；1-6泳道PCR模板分别是禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；7-14泳道PCR模板分别是隐孢子虫、球虫、新城疫病毒、禽流感病毒H5N8、禽流感病毒H9N2、隐孢子虫、柔嫩艾美尔球虫、传染性性法氏囊病毒。
结果表明本发明可以特异性检测每种菌及其混合物，而对球虫、隐孢子虫、新城疫、禽流感等病原的基因组检测均为阴性。说明实施例1中的引物组的特异性较强，采用其建立的多重PCR检测方法或检测试剂盒可以准确、快速、稳定、特异性地将禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌与其它菌区别开来。
评价例2最短检测时间评价
为验证本发明的最短检测时间，对本发明分别作了不同时间(即循环数：25、30、35)的反应。
图8为评价例2中最短检测时间评价的试验结果。
如图8所示，图8中，M：2K；1-2泳道PCR循环数为25；3-4泳道PCR循环数为30；5-6泳道PCR循环数为35。
结果表明PCR进行25个循环(约1小时15分钟后)，即可进行结果判断。
评价例3反应灵敏性评价
为验证本发明的灵敏性，分别倍比稀释上述6种菌的基因组及活菌数进行PCR检测。
图9-20为评价例3进行反应灵敏性评价的试验结果。
其中，图9-14分别为禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌对应的细菌液基因组的检测结果。
图9中，M：2000bp；1～9泳道PCR模板大肠杆菌基因组浓度分别为100ng、75ng、50ng、25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg。
图10中，M：2000bp；1～8泳道PCR模板多杀性巴氏杆菌基因组浓度分别为75ng、50ng、25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg。
图11中，M：2000bp；1～7泳道PCR模板奇异变形杆菌基因组浓度分别为50ng、25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg、250pg。
图12中，M：2000bp；1～10泳道PCR模板绿脓杆菌基因组浓度分别为100ng、75ng、50ng、25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg、100pg。
图13中，M：2000bp；1～7泳道PCR模板沙门氏菌基因组浓度分别为25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg、250pg。
图14中，M：2000bp；1～7泳道PCR模板金黄色葡萄球菌基因组浓度分别为25ng、12.5ng、7.5ng、2.5ng、1ng、500pg、250pg。
结果表明，DNA检出量为500pg。
图15-20分别为禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌对应的活菌的检测结果，结果表明，活菌检出量分别为大肠杆菌5×103个CFU(菌落形成单位)；多杀性巴氏杆菌为6×104个CFU；奇异变形杆菌为2.8×103个CFU；绿脓杆菌为8.6×103个CFU；沙门氏菌为3.2×103个CFU；金黄色葡萄球菌为5.6×103个CFU。
表明采用上述引物组建立的PCR反应体系最低可以检测出500pg的细菌基因组DNA、2.8×103个CFU细菌，说明实施例1中的引物组的敏感性较强，采用其建立的多重PCR检测方法可以灵敏地将禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌与其它菌区别开来。
实施例1的作用与效果
通过评价例1至评价例3可以看出，由于采用的引物组对相应的待检测菌液进行扩增，均可扩增到特异性条带，而其他细菌等对照样品均未扩增到条带，说明该引物组的特异性强，而用采用该引物组检测不同稀释度的基因组及活性菌，其最低检测敏感性可达到2.8×103个CFU细菌菌液及500pg细菌基因组DNA，说明该该引物组的灵敏性高，同时，进行检测时在PCR进行25个循环就能进行结果判断，说明通过对PCR反应体系的优化以及反应条件的调整，能达到快速完成对提及的6个菌的检测。所以实施例1提供的包括采用上述引物组的多重PCR检测方法对禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的检测与其他方法比较，具有特异性强、敏感度高、检测时间短、操作简单、不需要贵重仪器、成本低等特点，有效地解决了在检测工作中使用其他技术手段时存在的问题，为快速准确地检测与鉴定禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌提供了有效的手段。
同时该引物组还可以制备用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，此时，采用实施例1提供的多重PCR检测方法，该多重PCR检测试剂盒就能快速准确地检测与鉴定禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌。
另外，实施例1中，步骤1中以培养的待检测细菌的菌液为制备得到的PCR模板，作为本发明，还可以继续对步骤1中的菌液进行提取得到细菌粗提DNA为PCR模板。
本发明的范围不受具体实施方案的限制，实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR的引物组，其特征在于，包括：
特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对PhoA-F和PhoA-R；特异性扩增多杀性巴氏杆菌KMT1基因的引物对KMT-F和KMT-R；特异性扩增奇异变形杆菌AtpD基因的引物对AtpD-F和AtpD-R；特异性扩绿脓杆菌toxA基因的引物对toxA-F和toxA-R；特异性扩增沙门氏菌InvA基因的引物对InvA-F和InvA-R；特异性扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对NuC-F和NuC-R；
各个引物的核苷酸序列分别为：
PhoA-F，5’-GCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCC-3’；
PhoA-R，5’-TTGCAGGAAAAAGCCTTTCTCATTTT-3’；
KMT-F，5’-TTAACAGAGAGGTGAAAAATACCCCTA-3’；
KMT-R，5’-CTTTACGCTGATTAATATTGTGCTGAC-3’；
AtpD-F，5’-CTGGTGGCTCATTCATCT-3’；
AtpD-R，5’-ACAGTTAGGCGGTGGTAT-3’；
toxA-F，5’-TTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAG-3’；
toxA-R，5’-GAAGGTCTCCAGCGGCAGGTGGCAAGC-3’；
InvA-F，5’-AACCAGCAAAGGCGAGCAG-3’；
InvA-R，5’-CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG-3’；
NuC-F，5’-CCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAG-3’；
NuC-R，5’-TAAATATACGCTAAGCCACGTCCAT-3’。
2.权利要求1所述的引物组在制备用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测的方法包括以下步骤：
步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板；
步骤2，制备特异性引物组，采用权利要求1所述的引物组制备得到特异性引物组；
步骤3，进行PCR扩增反应，基于步骤1得到的所述PCR模板，采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括所述引物组的PCR反应体系，然后采用该PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物；
步骤4，进行电泳检测，对所述扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据所述电泳结果判定是否出现所述禽致病性大肠杆菌phoA基因、多杀性巴氏杆菌KMT1基因、奇异变形杆菌AtpD基因、绿脓杆菌toxA、沙门菌InvA基因或金黄色葡萄球菌nuc基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
步骤3的PCR反应体系包括：
2.5μL的10×反应缓冲液，0.125μL的浓度为8,000U/mL的ExTaq聚合酶、2.5μL的浓度为2.5mM each的dNTP、2μL的浓度为25mM的Mg2+、1μL的所述PCR模板、10μL的超纯水，和所述引物组，
在所述引物组中，引物对PhoA-F和PhoA-R的体积各为1.25μL，引物对KMT-F和KMT-R的体积各为0.5μL，引物对AtpD-F和AtpD-R的体积各位0.5μL，引物对toxA-F和toxA-R的体积各为1.0μL、引物对InvA-F和InvA-R的体积各为1.0μL、引物对NuC-F和NuC-R的体积各为1.0μL。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：
制备特异性引物组时，所述引物组中使用的各个引物的浓度为10μM。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：
所述预定PCR反应参数条件为94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：
步骤4的具体过程为，
向所述PCR扩增产物中加入5 uL 6×loading buffer并混匀后得到混匀产物，取10uL所述混匀产物点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在120V电压下，电泳25min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果，根据电泳结果判断检测结果。
8.一种多重PCR检测试剂盒，用于检测禽致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌，其特征在于，包括：
用于建立PCR反应体系的引物组，
其中，所述引物组为权利要求1所述的引物组。
9.根据权利要求8所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应体系包括：
2.5μL的10×反应缓冲液，0.125μL的浓度为8,000U/mL的ExTaq聚合酶、2.5μL的浓度为2.5mM each的dNTP、2μL的浓度为25mM的Mg2+、1μL的所述PCR模板、10μL的超纯水，和所述引物组，
在所述引物组中，引物对PhoA-F和PhoA-R的体积各为1.25μL，引物对KMT-F和KMT-R的体积各为0.5μL，引物对AtpD-F和AtpD-R的体积各为 0.5μL，引物对toxA-F和toxA-R的体积各为1.0μL、引物对InvA-F和InvA-R的体积各为1.0μL、引物对NuC-F和NuC-R的体积各为1.0μL。
10.根据权利要求9所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：制备特异性引物组时，所述引物组中使用的各个引物的浓度为10μM。
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