CN112210571B - 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用 - Google Patents

表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112210571B
CN112210571B CN202010883843.6A CN202010883843A CN112210571B CN 112210571 B CN112210571 B CN 112210571B CN 202010883843 A CN202010883843 A CN 202010883843A CN 112210571 B CN112210571 B CN 112210571B
Authority
CN
China
Prior art keywords
iss
ndv
newcastle disease
plasmid
pbr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010883843.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112210571A (zh
Inventor
杨锴
苗玲
薛玲
陈淑芳
牛志勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN202010883843.6A priority Critical patent/CN112210571B/zh
Publication of CN112210571A publication Critical patent/CN112210571A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112210571B publication Critical patent/CN112210571B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用，该系统是在BHK‑21 H6740细胞上转入转录质粒pBR‑Hd‑NDV‑Pm‑iss、辅助质粒pCI‑NP、pCI‑P、pCI‑L而形成。系统构建方法为：以新城疫LaSota病毒基因组cDNA、APEC的基因组为模板，经过扩增、酶切、连接等步骤制备转录质粒、辅助质粒，然后将转录质粒和辅助质粒转入BHK‑21 H6740。本发明适用于构建一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，该系统可用于研制表达APEC iss基因的重组NDV基因工程疫苗。

Description

表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、 其构建方法及应用
技术领域
本发明属于病毒遗传操作领域，涉及反向遗传学技术，具体地说是一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用。
背景技术
禽致病性大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(APEC)引起的禽类细菌性疾病，禽致病性大肠杆菌病发病率较高，各种禽类均可感染，尤其是鸡、火鸡和鸭，可引起受染禽类死亡率增加、产蛋率及生长率下降，造成严重的经济损失。
近年来，我国各地的禽致病性大肠杆菌病的发生和流行趋势越来越严重，抗菌药物的使用是目前治疗大肠杆菌病最主要、最有效的防治措施，但由于抗菌药物的长期、盲目使用，使细菌对药物的敏感性下降、耐药性增加，导致药物治疗效果不佳、药物残留问题突出；通过接种疫苗的方式防控禽大肠杆菌病的发生和流行，可以降低禽产品污染、改善食品安全问题，因而具有广阔的应用前景。
授权公告号为CN1293195C的中国发明专利公开了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统及其应用，但该专利公开的内容仅限于插入GFP外源基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统、应用该系统获救表达GFP重组病毒株；尽管该专利验证了该系统中插入的外源基因GFP在宿主细胞内得到了表达，但并未深入探索该系统中插入的外源基因能否引起机体免疫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统及其构建方法，该系统可用于研制表达APEC iss基因的重组NDV基因工程疫苗。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，该系统包括：转录质粒、三个真核表达辅助质粒和用于转入转录质粒、三个真核表达辅助质粒以表达APEC iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞；
所述转录质粒包括插入APEC iss基因的新城疫LaSota疫苗株基因组cDNA序列；
所述辅助质粒分别包括编码新城疫LaSota疫苗株的核蛋白NP、磷酸蛋白P以及大聚合酶蛋白L的cDNA序列。
作为本发明系统的限定：
表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统中，所述转录质粒为pBR-Hd-NDV-Pm-iss；所述辅助质粒为pCI-NP、pCI-P、pCI-L；所述表达APEC iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞为BHK-21H6740。
本发明的另一个目的是要提供表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，该构建方法包括依次进行以下步骤：
S1.构建转录质粒与辅助质粒：以新城疫LaSota弱毒疫苗株基因组cDNA、APEC的基因组为模板，设计引物，经扩增、酶切、连接、化学转化构建转录质粒；以新城疫LaSota弱毒疫苗株基因组cDNA为模板，设计引物，经扩增、酶切、连接、化学转化构建辅助质粒；
S2.将转录质粒和辅助质粒转入表达APEC iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞。
作为本发明构建方法的一种限定：
步骤S1辅助质粒的构建过程中，分别编码新城疫LaSota疫苗株的核蛋白NP、磷酸蛋白P以及大聚合酶蛋白L的cDNA序列位于T7启动子之后，并在序列前添加Kozak序列GCCACC用于增强基因表达。
作为本发明构建方法的另一种限定：
步骤S1中转录质粒的构建包括依次进行以下步骤：
①设计引物，以低拷贝质粒pBR322为骨架，构建转录载体pBR-Hd；
②设计引物，通过反转录扩增新城疫LaSota病毒cDNA各个片段，将各个片段依次连接至转录载体pBR-Hd，构建重组质粒pBR-Hd-NDV；
③设计引物在NDV全长基因组cDNA克隆P和M基因间3165位置突变Pme Ⅰ酶切位点，以与该位置所对应pE-B片段的cDNA为模板，经扩增、酶切、连接、化学转化制备得阳性克隆PE-BPm，然后将PE-BPm和pBR-Hd-NDV摇菌扩繁，提取质粒，制备重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm；
④设计引物，以APEC提取质粒为模板，经扩增、酶切、连接、化学转化制备得阳性克隆pE-iss，然后将pE-iss与pBR-Hd-NDV-Pm摇菌扩繁，提取质粒，制备转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss。
作为本发明构建方法的进一步限定：
步骤①构建转录载体pBR-Hd过程中，将新城疫LaSota病毒cDNA各个片段依次连接至转录载体pBR-Hd，得到15186nt的LaSota完整序列，构建过程中在引物引入点突变将13486bp处T突变为C，引入SacII酶切位点作为遗传标记。
作为本发明构建方法的更进一步限定：
步骤②构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中，新城疫LaSota病毒cDNA各个片段连接构建的cDNA序列连接在T7启动子之后，在T7终止子之前；在所述T7启动子之后添加用于增强转录的3个G碱基；在T7终止子之前编码自我剪切的核酸酶，所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎核酶HdvRz。
作为本发明构建方法的再进一步限定：
转录载体pBR-Hd、pBR-Hd-NDV及pBR-Hd-NDV-Pm构建过程中，PCR扩增体系为：5×TransStart FastPfu Buffer 5μL、2.5mM dNTPs 2μL、模板2μL、上下游引物各0.5μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5μL、ddH2O 14.5μL；扩增程序为：T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:120s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；
pBR-Hd-NDV-Pm-iss构建过程中，PCR扩增体系为：5×TransStart FastPfuBuffer 10μL、2.5mM dNTPs 4μL、模板2μL、上下游引物各1μL、TransStart FastPfu DNAPolymerase 1μL、ddH2O 31μL；扩增程序为：T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:60s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；
辅助质粒构建过程中，PCR扩增体系为：5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、2.5mM dNTPs 4μL、模板2μL、上下游引物各1μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μL、ddH2O 31μL；PCR扩增程序为：T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:70s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min。
作为本发明构建方法的再进一步限定：
步骤①构建转录载体pBR-Hd过程中，所用引物引物名称、引物序列为：
Hd-F：GATCCGCGCGACGCGTCGGGACTAGTCCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGG
Hd-R：AATTCCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGACTAGTCCCGACGCGTCGCGCG；
步骤②构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中，新城疫LaSota病毒cDNA各个片段扩增所用引物、引物序列为：
SaqA-F：CGACGCGTCGTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCCGTGA
SaqA-R：GGACTAGTCCCCATGGGCCCTTTTTAGCATT
SaqB-F：TAAAAAGGGCCCATGGTCGAG
SaqB-R：TCCCCGCGGGGAGGACTAGTCCGAGCTGCGGCCGCTGTTATTTG
SaqC-F：AACAGCGGCCGCAGCTCTGATAC
SaqC-R：GGCTTCTCTAACCCCGTCATCTTTG
SaqD-F：TACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATC
SaqD-R：TCCCCGCGGGGA TAGGACTCTTTGCGTATGTTTCT
SaqE-F：GCAAGCCCAAATATTGTTCTTAAG
SaqE-R：CAAAAATGCCGCGGGTTGTCG
SaqF-F：GGACTAGTCCATTCACCCGACAACCCGCGGCAT
SaqF-R：CATTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAAACAAAGATTTGGTGAATGAC；
步骤③构建重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm过程中，制备阳性克隆PE-BPm时所设计的引物名称、引物序列为：
PM-F：CCCAAGGTGTTTAAACCCAAGCGGCAATCCTCTCTCGCTTC
PM-R：GAGGATTGGTTTAAACAGAGTTGGACCTTGGGTCTG；
步骤④构建转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss过程中，制备得阳性克隆pE-iss时所设计的引物名称、引物序列为：
iss-F：TGGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCGCCACCATGCAGGATAATAAGATGAAAAAAATGTTATTTTCTGCCGCT
iss-R：TGGTTTAAACCTATTGTGAGCAATATACCCGGGCTTCCAGCGGAGTATAGA；
构建辅助质粒过程中，NP、P、L扩增所用引物、引物序列为：
NDV-NP-F：GGAATTCGCCACCATGTCTTCCGTATTTGATGAGT
NDV-NP-R：GCGTCGACTCAATACCCCCAGTCGGTGTCGTTAT
NDV-P-F：CGGAATTCGCCACCATGGCCACCTTTACAGAT
NDV-P-R：GCTCTAGATTAGCCATTTAGAGCAAGGCGCT
NDV-L1-F：GCTCTAGAGCCACCATGGCGAGCTCCGGTCCTG
NDV-L1-R：GTAGTCCCCGGGTCACCGATAT
NDV-L2-F：GCTCTAGAATATCGGTGACCCGGGGACTACT
NDV-L2-R：ATTTGCGGCCGCTTAAGAGTCACAGTTACTGTAATA T。
本发明还提供了一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的应用，该系统用于研制表达APEC iss基因的重组NDV基因工程疫苗。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：
(1)本发明表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统以新城疫LaSota弱毒疫苗株(NDV)作为载体，把外源基因iss导入NDV载体，使得外源基因在宿主细胞内得以表达，以刺激机体产生免疫应答，NDV作为一种负链RNA病毒，NDV在胞内复制时不会与宿主细胞基因组整合，因此以其作为载体制备的疫苗具有高度的安全性；
(2)本发明表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统中插入的外源基因为APEC的iss基因，iss基因编码的蛋白属于外膜蛋白的一部分，与细菌抗补体作用相关，因此基于表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统研制的基因工程疫苗具有良好的免疫原性；
(3)本发明表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，可用于研制表达APEC iss基因的重组NDV基因工程疫苗；
综上所述，本发明所研制的表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传系统能够制备表达Iss蛋白的基因工程疫苗；动物试验初步鉴定其具有较好的免疫原性，并对受试动物通过良好的保护效率。
本发明适用于构建一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，该系统可用于研制基因工程疫苗，用于防治禽致病性大肠杆菌感染导致的禽类疾病。
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
图1为转录载体pBR-Hd的凝胶电泳测试结果；
图2为重组质粒pBR-Hd-NDV构建模式图；
图3为重组质粒pBR-Hd-NDV的凝胶电泳测试结果；
图4为重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm构建模式图；
图5为转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss的凝胶电泳测试结果；
图6为辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L的凝胶电泳测试结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均采用现有的技术方法；
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到；
下述实施例中，所用材料、试剂来源：
新城疫LaSota弱毒疫苗株，购自杨凌绿方生物工程有限公司；
禽致病性大肠杆菌(具体为O78-Y115)，本实验室自主分离；
SPF鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；
LaSota株鸡胚尿囊液，接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔扩增3-4日后收集尿囊液，-80℃冻存备用；
PGEM-T载体，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；
pBR322载体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
pCI-neo载体，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；
pEASY-Blunt简易克隆试剂盒(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit)，购自北京全式金生物技术有限公司；
质粒提取试剂盒，购自北京康润诚业生物科技有限公司；
反转录试剂盒，购自美国英杰生命技术有限公司；
第一链cDNA合成试剂盒(EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix)，购自北京全式金生物技术有限公司；
DNA回收试剂盒，购自北京康润诚业生物科技有限公司；
8K DNA Marker，购自北京索莱宝科技有限公司；
2×Taq高保真酶预混液(2×Trans Taq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix)，购自北京全式金生物技术有限公司；
Phusionase 2×超保真预混液(Phusionase 2×Master Mix)，购自New EnglandBiolabs(美国)；
限制性内切酶，购自北京索莱宝科技有限公司；
T4 DNA连接酶，购自北京全式金生物技术有限公司；
Pfu高保真DNA聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)，购自北京全式金生物技术有限公司；
感受态细胞DH5α，购自北京索莱宝科技有限公司；
感受态细胞Trans5α，购自北京全式金生物技术有限公司；
感受态细胞HST08，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和理解本发明，并不用于限定本发明。
实施例1一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统及其构建方法
一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，包括转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss、辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L与表达APEC iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可细胞BHK-21 H6740，该系统按照以下步骤顺序进行：
S1、表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统中转录质粒、辅助质粒的构建
1.1转录载体pBR-Hd的构建
以pBR322载体(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)为基础，人工合成一条短链命名为Hd，与pBR322载体通过酶切位点连接，构建的转录载体命名为pBR-Hd，具体构建步骤如下：
pBR322质粒和Hd短链用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切后回收目的片段，将回收产物进行连接，回收产物16℃过夜连接之后，转化至感受态细胞Trans5α中，随后涂布于含有Apm抗性LB固体培养基中培养，挑取单菌落摇菌扩繁，提取质粒后进行双酶切鉴定，挑取鉴定正确的菌株即所需pBR-Hd；构建过程中所用体系如下：
PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer 5μL
2.5mM dNTPs 2μL
模板 2μL
F(上游引物) 0.5μL
R(下游引物) 0.5μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 14.5μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:120s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。
构建转录载体过程中所用引物
Figure BDA0002654954790000101
Figure BDA0002654954790000111
注：下划线斜体部分表示酶切位点序列；斜体部分表示保护性碱基序列；小写部分表示HdvRz核酶序列；加粗部分表示T7终止子序列pBR322/Hd酶切体系100μL：
pBR322/Hd 80μL
EcoR Ⅰ 2μL
BamH Ⅰ 2μL
Cutsmat Buffer 10μL
ddH<sub>2</sub>O 6μL
连接体系10μL：
pBR322 5.5μL
Hd-T7T 2.5μL
10×Buffer 1μL
T4 DNA Ligase 1μL
将构建所得的转录载体pBR-Hd经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，测试结果见图1，图中泳道1为提取pBR-Hd质粒，泳道2为该质粒经过EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切得到3986bp和155bp两条片段，与预期片段大小相符，即为目的片段，即转录载体pBR-Hd构建成功。
1.2重组质粒pBR-Hd-NDV的构建
根据测序所得NDV全基因序列进行分析，将病毒基因组分成6个片段进行克隆，分别命名为SeqA、SeqB、SeqC、SeqD、SeqE、SeqF。在NDV全基因3’端添加T7启动子，在5’端添加丁型肝炎核酶和T7终止子，于13486bp处同义突变出SacII作为遗传标记；用Primer5.0设计引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；将新城疫LaSota弱毒疫苗株(购自杨凌绿方生物工程有限公司)接种鸡胚尿囊腔进行扩增，并收集尿囊液，使用RNA提取试剂盒提取得到NDV病毒基因组，随后使用反转录试剂盒随机引物进行RT-PCR反应得到NDV病毒cDNA基因组；分别构建对应的中间质粒pE-A、pE-B、pE-C、pE-D、pE-E、pE-F，并利用不同片段间的酶切位点依次连接至pBR-Hd质粒，得到重组质粒pBR-Hd-NDV。
PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer 5μL
2.5mM dNTPs 2μL
模板 2μL
F(上游引物) 0.5μL
R(下游引物) 0.5μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 14.5μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:120s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。
构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中扩增所用引物
Figure BDA0002654954790000121
Figure BDA0002654954790000131
注：下划线斜体部分表示酶切位点序列；斜体部分表示保护性碱基序列；小写部分表示HdvRz核酶序列
pBR-Hd-NDV的构建模式如图2a、2b所示，具体构建过程如下：根据测序所得NDV全基因序列进行分析，将NDV全基因分为A、B、C、D、E、F六个片段后设计引物，进行PCR扩增；将A、B、C、D、E、F六个片段扩增产物分别切胶回收后将回收产物4μL与pEASY-Blunt SimpleCloning Vector 1μL轻轻混合并于37℃反应20min；将所得连接产物转化至Trans5α感受态细胞，37℃过夜培养，随后挑取单个菌落进行鉴定；鉴定正确的阳性克隆依次命名为pE-A、pE-B、pE-C、pE-D、pE-E、pE-F。
pBR-Hd与pE-F摇菌扩繁提取质粒，使用SpeⅠ/RsrⅡ限制性内切酶双酶切回收目的片段，随后16℃过夜连接，将所得连接产物转化至Trans5α感受态细胞，涂布于含有Amp抗性LB固体平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落进行鉴定；鉴定正确的阳性克隆命名为pBR-Hd-F。
按照阳性克隆pBR-Hd-F的具体构建步骤(区别仅在于所用酶切体系与连接体系不同，具体体系参数见下表)，将pBR-Hd-F与pE-A进行摇菌扩繁、酶切、连接、化学转化得到阳性克隆pBR-Hd-AF，以此类推依次连接pE-B、pE-D、pE-E、pE-C，构建得阳性克隆pBR-Hd-ABF、pBR-Hd-ABDF、pBR-Hd-ABDEF、pBR-Hd-NDV。
构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中酶切体系与连接体系参数表
Figure BDA0002654954790000141
将构建所得的重组质粒pBR-Hd-NDV进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，测试结果见图3，图中泳道1为提取pBR-Hd-ABDEF质粒，泳道2为pBR-Hd-NDV质粒，泳道3为pBR-Hd-NDV质粒经过MluⅠ单酶切得到约19.5kb条带，泳道4为pBR-Hd-NDV质粒经过NotⅠ和SpeⅠ酶切得到约16.3kb和3.2kb条带，泳道5为pBR-Hd-NDV质粒经过ApaⅠ和SpeⅠ得到约13.6kb和5.8kb条带；质粒经电泳检测与预期大小相符，酶切鉴定得到条带大小也与预期相符，即重组质粒pBR-Hd-NDV经过质粒电泳及酶切鉴定正确。
1.3重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm的构建
重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm的构建过程如图4构建模式图所示。首先设计引物在NDV全长基因组cDNA克隆P和M基因间3165位置突变Pme I酶切位点；以pE-B质粒为模板，用上游引物PM-F及下游引物B-R、上游引物B-F及下游引物PM-R分别进行PCR扩增，并将两个片段命名为BP1和BP2。
PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer 5μL
2.5mM dNTPs 2μL
模板 2μL
F(上游引物) 0.5μL
R(下游引物) 0.5μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 14.5μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:120s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。
构建重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm过程中扩增所用引物
Figure BDA0002654954790000151
Figure BDA0002654954790000161
注：斜体下划线部分表示酶切位点序列
在微型离心管中分别加入BP1回收产物各4μL与1μL pEASY-Blunt SimpleCloning Vector，轻轻混合，37℃反应20min；将反应产物转化进DH5α感受态细胞，并涂于含Amp抗性的LB固体培养基上；37℃过夜培养，挑取单个菌落进行鉴定，鉴定正确的阳性克隆命名为pE-BP1；同样方法制备阳性克隆E-BP2。
按照1.2步骤中阳性克隆pBR-Hd-F的具体构建步骤(区别仅在于所用酶切体系与连接体系不同，具体体系参数见下表)，将pE-BP1与pE-BP2进行摇菌扩繁、酶切、连接、转化得到阳性克隆pE-BPm，然后将pE-BPm与pBR-Hd-NDV进行摇菌扩繁、酶切、连接、转化得到pBR-Hd-NDV-Pm。
构建重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm过程中酶切体系与连接体系参数表
Figure BDA0002654954790000162
1.4转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss的构建
取10μL禽致病性大肠杆菌(具体为O78-Y115，本实验室自主分离：取病鸡组织，将采集所得病料划线接种于伊红美兰琼脂平板，于37℃培养16h后，形成的带金属光泽的紫黑色菌落即为禽致病性大肠杆菌)菌液在伊红美蓝培养基上划线，过夜培养，挑取单菌落接种于LB液体培养基摇菌扩繁，使用质粒小提试剂盒提取质粒；以O78-Y115提取的质粒为模板构建pE-iss，具体步骤参照1.3步骤中阳性克隆pE-BP1的构建过程，区别仅在于所用扩增引物、体系、延伸时间不同，具体见下表：PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
模板 2μL
F(上游引物) 1μL
R(下游引物) 1μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 31μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:60s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。
构建转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss过程中扩增所用引物
Figure BDA0002654954790000171
注：斜体下划线部分表示酶切位点序列，加粗下划线表示基因终止序列，下划线表示基因起始序列，加粗部分表示Kozak序列。
将pBR-Hd-NDV和pE-iss进行摇菌扩繁、酶切、连接、化学转化制备阳性克隆pBR-Hd-NDV-Pm-iss；具体过程参照1.2步骤中阳性克隆pBR-Hd-F的具体构建步骤，区别仅在于所用酶切体系与连接体系不同，具体体系参数见下表：
pBR-Hd-NDV酶切体系50μL：
pBR-Hd-NDV 20μL
Pme Ⅰ 1μL
CutSmart Buffer 5μL
ddH<sub>2</sub>O 24μL
pE-iss酶切体系50μL：
pE-iss 20μL
Pme Ⅰ 1.5μL
CutSmart Buffer 5μL
ddH<sub>2</sub>O 23.5μL
连接体系10μL：
pBR-Hd-NDV 6μL
pE-iss 2μL
10×Buffer 1μL
T4 DNA Ligase 1μL
图5为转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的测试结果，图中，泳道1和2为提取pBR-Hd-NDV-Pm-iss质粒，泳道3为质粒经过酶切得到约18.7kb、890bp和309bp三条条带，与预期相符，即构建正确。
pBR-Hd-NDV-Pm-iss的序列由北京六合华大基因科技有限公司测序，结果见序列表。
1.5辅助质粒的构建
将新城疫LaSota弱毒疫苗株(购自杨凌绿方生物工程有限公司)接种鸡胚尿囊腔进行扩增，并收集尿囊液使用RNA提取试剂盒提取得到病毒基因组，随后使用反转录试剂盒随机引物进行RT-PCR反应得到病毒cDNA基因组；设计引物扩增NP、P和L基因，并在序列前添加Kozak序列GCCACC用以增强真核基因翻译效率。
PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
模板 2μL
F(上游引物) 1μL
R(下游引物) 1μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 31μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3min；T2：94℃，t2:30s；T3：55℃，t3:30s；T4：72℃，t4:70s；T2-T4循环30次；T5：72℃，t5:10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；
NP、P、L扩增所用引物
Figure BDA0002654954790000191
注：引物5’端设有保护性碱基(倾斜字体)和酶切位点(下划线斜体)，并在上游引物的酶切位点后添加Kozak序列GCCACC(加粗字体)
扩增得到的片段分别与pCI-neo质粒(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)经过双酶切进行连接，转化得到的辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L；具体过程如下：pCI-neo摇菌扩繁提取质粒，和PCR扩增NP片段产物使用EcoRⅠ/SalⅠ限制性内切酶双酶切，回收目的片段，随后16℃过夜连接，将所得连接产物转化至Trans5α感受态细胞，涂布于含有Amp抗性LB固体平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落进行鉴定，鉴定正确的阳性克隆命名为pCI-NP；采用同样方法制备pCI-P、pCI-L。
将制备所得的辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L使用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，测试结果见图6，图中(NP)泳道1为提取pCI-NP质粒，泳道2为该质粒经过EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切得到约5.4kb和1.5kb两条片段，泳道3为PCR扩增NP基因鉴定；(P)泳道1为提取pCI-P质粒，泳道2为该质粒经过EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切得到约5.4kb和1.2kb两条片段，泳道3为PCR扩增P基因鉴定；(L)泳道1为提取pCI-L质粒，泳道2为该质粒经过Xba Ⅰ和Not Ⅰ酶切得到约5.4kb和6.5kb两条片段，质粒大小与酶切鉴定均与预期相符合，即构建正确。
辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L的插入的外源片段序列由北京六合华大基因科技有限公司测序，结果见序列表。
S2、将转录质粒和辅助质粒转入表达APEC iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞
转染BHK-21 H6740细胞系：用含血清不含双抗的细胞培养液重悬胰酶消化的BHK-21 H6740细胞，接种于6孔板，2mL/孔，细胞生长至70％-90％时进行质粒瞬时转染，瞬时转染过程如下：
1.在离心管里加入质粒(pBR-Hd-NDV-Pm-iss 5μg、pCI-NP 2μg、pCI-P 2μg、pCI-L1μg)和150μL Opti-MEMⅠ无血清培养基，轻轻混匀，制成质粒混合液，室温放置5min；
2.在另一个离心管中加入脂质体和150μL Opti-MEM Ⅰ无血清培养基，轻轻混合均匀，室温放置5min；
3.将脂质体稀释液加入到质粒稀释液中，轻轻混匀，室温放置20min，形成质粒-脂质体复合物；
4.用DMEM培养基洗3次细胞后将质粒-脂质体复合物加入到6孔板，将培养板轻轻地前后摇动，使混合物分散均匀，置37℃ CO2培养箱中培养6h；
5.弃掉质粒-脂质体复合物，加入2mL10％FBS MEM培养液(含血清含双抗细胞)，过夜培养。
鸡成纤维细胞的制备(CEFs)：
1.经照蛋检查后，选取血管清楚、活力正常的9日龄SPF鸡胚。用碘酊消毒蛋壳表面，再用75％酒精脱碘；
2.用无菌镊子打开气室部位蛋壳，用眼科镊撕破蛋壳膜和绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部取出，置于加有PBS的平皿中；
3.用眼科镊和眼科剪除去鸡胚头、爪及内脏，移到另一平皿中，用PBS冲洗3次；
4.将鸡胚剪成约2mm3的小块，用PBS洗3次；
5.用5mL移液器将组织块移入盛有37℃预热的0.25％胰酶的小三角瓶中，5mL/胚，置37℃水浴锅中消化30min；
6.吸弃胰酶，用PBS洗涤组织块1次；
7.加入5mL细胞生长液，用5mL移液器吹打30-40下，稍待沉降后，吸出细胞悬液至另一瓶中；
8.原瓶中再分批加入生长液吹打，直至组织块基本消散为止；
9.补加生长液至总量25mL/胚，取10mL细胞悬液置于培养皿中，静置37℃孵育，为病毒拯救做准备。
BHK-21细胞和CEFs细胞共培养：每100mm细胞培养皿的CEFs能铺2个转染孔，为了提高病毒拯救效率，在10％FBS MEM培养液中补充了5％的尿囊液和3mM的MgCl2，其具体过程如下：
1.用1mL PBS洗BHK-21 H6740细胞2次，用0.2mL EDTA-trypsin(胰蛋白酶)消化BHK-21 H6740直至细胞分离；
2.用1mL的10％FBS MEM培养液(含5％的尿囊液和3mM的MgCl2)重悬细胞，转移到100mm细胞培养皿中，加入3mL相同的营养液；
3.用4mL PBS洗CEFs细胞2次，用1mL EDTA-trypsin消化CEFs直至细胞分离；
4.用8mL的10％FBS MEM培养液(含5％的尿囊液和3mM的MgCl2)重悬细胞，加4mL重悬细胞至含BHK-21 H6740细胞的100mm细胞培养皿中共培养，使终体积为8mL(4mL的BHK-21H6740细胞，4mL的CEFs细胞)；用手轻摇共培养细胞，使其分布均匀，然后将其置于37℃培养箱中孵育3-4天；将细胞反复冻融3次之后收取上清，接种9-11日龄SPF鸡胚后收获的尿囊液经HA滴度测定试验结果呈阳性，不同鸡胚的HA介于28-10之间，NDV免疫血清血凝抑制试验呈阳性结果，所得重组病毒命名为rLa-APEC-iss。
依据RNA/DNA提取试剂盒使用说明书进行操作，提取rLa-APEC-iss病毒的RNA；参照步骤1.2重组质粒pBR-Hd-NDV的构建过程，使用随机引物合成第一链cDNA，分别扩增B片段和EF片段，并对PCR产物进行测序(B片段和EF片段序列由北京六合华大基因科技有限公司测序，结果见序列表)，结果表明B片段成功插入外源基因iss，EF片段显示NDV序列13486bp处T突变为C，即表明所得病毒为含有外源基因iss的重组病毒。
实施例2一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的应用
90只7日龄AA+肉鸡随机分成3组，每组30只，第1组每只鸡口服100μL生理盐水；第2组每只鸡肌肉接种100μL rLa-APEC-iss疫苗(每只106TCID50/mL)；第3组每只鸡肌肉接种1羽份LaSota疫苗。观察到3组雏鸡采食、饮水均正常，精神状况良好，无死亡；测定第2组接种重组病毒rLa-APEC-iss后鸡血清中的NDV和Iss抗体水平，结果如下表，可以看出接种重组病毒rLa-APEC-iss后，本组鸡的鸡血清中可以检测到NDV抗体的存在，且NDV抗体水平在第二周有升高；同时观察到接种重组病毒rLa-APEC-iss两周后，本组鸡的鸡血清中Iss抗体达到阳性水平(Iss抗体检测中当OD450值≥0.2时判为阳性，当OD450值＜0.2时判为阴性)，表明rLa-APEC-iss可使鸡产生抗体，具有良好的免疫原性。
鸡血清中NDV和Iss抗体水平
Figure BDA0002654954790000231
接种后14天，将3组鸡经左后胸气囊注射O78血清型APEC，攻毒后连续观察7天，统计结果见下表，可以看出，第2组接种重组病毒rLa-APEC-iss的AA+肉鸡死亡率仅为20％，明显低于第1组未接种疫苗AA+肉鸡和第3组仅接种LaSota疫苗的AA+肉鸡的死亡率；由此可知，接种APEC iss基因重组新城疫病毒基因工程疫苗可诱导肉鸡对禽致病性大肠杆菌病产生免疫应答，从而有效降低鸡死亡率。
免疫保护试验结果
组别 攻毒毒株 死亡率
第1组 APEC O78 86.67％
第2组 APEC O78 20％
第3组 APEC O78 83.33％
综上所述，基于本发明构建的表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统研制的基因工程疫苗，可有效防治禽致病性大肠杆菌感染导致的禽类疾病。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002654954840000011
Figure IDA0002654954840000021
Figure IDA0002654954840000031
Figure IDA0002654954840000041
Figure IDA0002654954840000051
Figure IDA0002654954840000061
Figure IDA0002654954840000071
Figure IDA0002654954840000081
Figure IDA0002654954840000091
Figure IDA0002654954840000101
Figure IDA0002654954840000111
Figure IDA0002654954840000121
Figure IDA0002654954840000131
Figure IDA0002654954840000141
Figure IDA0002654954840000151
Figure IDA0002654954840000161
Figure IDA0002654954840000171
Figure IDA0002654954840000181
Figure IDA0002654954840000191
Figure IDA0002654954840000201
Figure IDA0002654954840000211
Figure IDA0002654954840000221
Figure IDA0002654954840000231
Figure IDA0002654954840000241
Figure IDA0002654954840000251
Figure IDA0002654954840000261
Figure IDA0002654954840000271
Figure IDA0002654954840000281

Claims (9)

1. 一种表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统，其特征在于，该系统包括：转录质粒、三个真核表达辅助质粒和用于转入转录质粒、三个真核表达辅助质粒以表达禽致病性大肠杆菌 iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞；
所述转录质粒包括插入禽致病性大肠杆菌 iss基因的新城疫LaSota疫苗株基因组cDNA序列；
所述辅助质粒分别包括编码新城疫LaSota疫苗株的核蛋白NP、磷酸蛋白P以及大聚合酶蛋白L的cDNA序列；
其中，所述转录质粒为pBR-Hd-NDV-Pm-iss，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述辅助质粒为pCI-NP、pCI-P、pCI-L，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-4所示；所述表达禽致病性大肠杆菌 iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞为BHK-21 H6740。
2.权利要求1所述的表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，包括依次进行以下步骤：
S1. 构建转录质粒与辅助质粒：以新城疫LaSota弱毒疫苗株基因组cDNA、禽致病性大肠杆菌的基因组为模板，设计引物，经扩增、酶切、连接、化学转化构建转录质粒；以新城疫LaSota弱毒疫苗株基因组cDNA为模板，设计引物，经扩增、酶切、连接、化学转化构建辅助质粒；
S2. 将转录质粒和辅助质粒转入表达禽致病性大肠杆菌 iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株病毒复制许可的细胞。
3.根据权利要求2所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，步骤S1辅助质粒的构建过程中，分别编码新城疫LaSota疫苗株的核蛋白NP、磷酸蛋白P以及大聚合酶蛋白L的cDNA序列位于载体T7启动子之后，并在编码新城疫LaSota疫苗株的核蛋白NP、磷酸蛋白P以及大聚合酶蛋白L的cDNA序列前添加Kozak序列GCCACC用于增强基因表达。
4.根据权利要求3所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，步骤S1转录质粒的构建包括依次进行以下步骤：
① 设计引物，以低拷贝质粒pBR322为骨架，构建转录载体pBR-Hd；
② 设计引物，通过反转录扩增新城疫LaSota病毒cDNA各个片段，将各个片段依次连接至转录载体pBR-Hd，构建重组质粒pBR-Hd-NDV；
③ 设计引物在NDV全长基因组cDNA克隆P和M基因间3165位置突变PmeⅠ酶切位点，以与该位置所对应pE-B片段的cDNA为模板，经扩增、酶切、连接、化学转化制备得阳性克隆PE-BPm，然后将PE-BPm和pBR-Hd-NDV摇菌扩繁，提取质粒，经扩增、酶切、连接、化学转化制备得重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm；
④ 设计引物，以禽致病性大肠杆菌提取的质粒为模板，经扩增、酶切、连接、化学转化制备得阳性克隆pE-iss，然后将pE-iss与pBR-Hd-NDV-Pm摇菌扩繁，提取质粒，制备转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss。
5.根据权利要求4所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，步骤①构建转录载体pBR-Hd过程中，将新城疫LaSota病毒cDNA各个片段依次连接至转录载体pBR-Hd，得到15186nt的LaSota完整序列，构建过程中在引物引入点突变将13486bp处T突变为C，引入Sac II酶切位点作为遗传标记。
6.根据权利要求5所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，步骤②构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中，新城疫LaSota病毒cDNA各个片段连接重构的cDNA序列连接在T7启动子之后，在T7终止子之前；在所述T7启动子之后添加用于增强转录的3个G碱基；在T7终止子之前编码自我剪切的核酸酶，所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎核酶HdvRz。
7.根据权利要求6所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，构建转录质粒、辅助质粒过程中，
PCR扩增体系为：
5×TransStart FastPfu Buffer：5~10 μL
2.5 mM dNTPs：2~4 μL
模板：2μL
上游引物F：0.5~1μL
下游引物R：0.5~1μL
TransStart FastPfu DNA Polymerase:0.5~1 μL
ddH2O:14.5~31 μL
PCR扩增程序为：
T1：95℃，t1:3~5min；
T2：94℃，t2:30~40s；
T3：50~55℃，t3:30s；
T4：72℃，t4:60~120s；
T2- T4循环30次；
T5：72℃，t5:10min。
8.根据权利要求7所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的构建方法，其特征在于，
步骤①构建转录载体pBR-Hd过程中，所用引物引物名称、引物序列为：
Hd-F：GATCCGCGCGACGCGTCGGGACTAGTCCTCCTCGCGGTCC GACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGG
Hd-R： AATTCCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAA GGGGTTATGCTAGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGACTAGTCCCGACGCGTCGCGCG；
步骤②构建重组质粒pBR-Hd-NDV过程中，新城疫LaSota病毒cDNA各个片段扩增所用引物、引物序列为：
SaqA-F：CGACGCGTCGTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGA GAATCCGTGA
SaqA-R：GGACTAGTCCCCATGGGCCCTTTTTAGCATT
SaqB-F：TAAAAAGGGCC^CATGGTCGAG
SaqB-R：TCCCCGCGGGGAGGACTAGTCCGAGCTGCGGCCGCTGTT ATTTG
SaqC-F：AACAGCGGCCGCAGCTCTGATAC
SaqC-R：GGCTTCTCTAACCCCGTCATCTTTG
SaqD-F：TACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATC
SaqD-R：TCCCCGCGGGGA TAGGACTCTTTGCGTATGTTTCT
SaqE-F：GCAAGCCCAAATATTGTTCTTAAG
SaqE-R：CAAAAATGCCGCGGGTTGTCG
SaqF-F：GGACTAGTCCATTCACCCGACAACCCGCGGCAT
SaqF-R：CATTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCC ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGAC；
步骤③构建重组质粒pBR-Hd-NDV-Pm过程中，制备阳性克隆PE-BPm时所设计的引物名称、引物序列为：
PM-F：CCCAAGGTGTTTAAACCCAAGCGGCAATCCTCTCTCGCTTC
PM-R：GAGGATTGGTTTAAACAGAGTTGGACCTTGGGTCTG；
步骤④构建转录质粒pBR-Hd-NDV-Pm-iss过程中，制备得阳性克隆pE-iss时所设计的引物名称、引物序列为：
iss-F：TGGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCGCCACCATG CAGGATAATAAGATGAAAAAAATGTTATTTTCTGCCGCT
iss-R：TGGTTTAAACCTATTGTGAGCAATATACCCGGGCTTCCAGCG GAGTATAGA；
构建辅助质粒过程中，NP、P、L扩增所用引物、引物序列为：
NDV-NP-F：GGAATTCGCCACCATGTCTTCCGTATTTGATGAGT
NDV-NP-R：GCGTCGACTCAATACCCCCAGTCGGTGTCGTTAT
NDV-P-F：CGGAATTCGCCACCATGGCCACCTTTACAGAT
NDV-P-R：GCTCTAGATTAGCCATTTAGAGCAAGGCGCT
NDV-L1-F：GCTCTAGAGCCACCATGGCGAGCTCCGGTCCTG
NDV-L1-R：GTAGTCCCCGGGTCACCGATAT
NDV-L2-F：GCTCTAGAATATCGGTGACCCGGGGACTACT
NDV-L2-R：ATTTGCGGCCGCTTAAGAGTCACAGTTACTGTAATA T。
9.权利要求1所述表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的应用，其特征在于，该系统用于研制表达禽致病性大肠杆菌 iss基因的重组NDV基因工程疫苗。
CN202010883843.6A 2020-08-28 2020-08-28 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用 Active CN112210571B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010883843.6A CN112210571B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010883843.6A CN112210571B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112210571A CN112210571A (zh) 2021-01-12
CN112210571B true CN112210571B (zh) 2023-01-24

Family

ID=74058989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010883843.6A Active CN112210571B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112210571B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772887A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株
CN1772909A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用
CN103525774A (zh) * 2013-10-08 2014-01-22 扬州大学 表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫疫苗株rAI4-gB及其构建方法
CN104059942A (zh) * 2013-03-20 2014-09-24 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用
CN107557375A (zh) * 2017-07-14 2018-01-09 河北科星药业有限公司 tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用
CN108251548A (zh) * 2018-04-10 2018-07-06 中国农业科学院上海兽医研究所 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102546A1 (en) * 1998-02-12 2002-08-01 Nolan Lisa K. Nucleic acid encoding an avian E.coli iss polypeptide and methods of use
DK2414386T3 (en) * 2009-04-03 2016-02-22 Merial Ltd Birds of vaccines with newcastle disease virus vectors

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772887A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株
CN1772909A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用
CN104059942A (zh) * 2013-03-20 2014-09-24 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用
CN103525774A (zh) * 2013-10-08 2014-01-22 扬州大学 表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫疫苗株rAI4-gB及其构建方法
CN107557375A (zh) * 2017-07-14 2018-01-09 河北科星药业有限公司 tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用
CN108251548A (zh) * 2018-04-10 2018-07-06 中国农业科学院上海兽医研究所 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Milad Lagzian等.In vitro responses of chicken macrophage-like monocytes following exposure to pathogenic and non-pathogenic E. coli ghosts loaded with a rational design of conserved genetic materials of influenza and Newcastle disease viruses.《Vet Immunol Immunopathol》.2016,第176卷第5-17页. *
赵星.致禽肾脏、肠道病变大肠杆菌菌影疫苗的制备及免疫效果的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》.2018,D050-442. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112210571A (zh) 2021-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111575247B (zh) 一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用
CN105420261B (zh) 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
CN103266091B (zh) A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
CN108546302B (zh) 一种复合多表位表达盒、其组成的重组病毒及应用
WO2021051906A1 (zh) 一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法
CN110218706B (zh) 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用
CN112094824B (zh) 表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用
CN109321534A (zh) 一种重组基因viii型新城疫病毒弱毒株
CN110079541A (zh) 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
CN112011521A (zh) 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
CN105087645A (zh) M蛋白三氨基酸位点突变的猪用vsv病毒载体构建和应用
US11607448B2 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and its use in producing H7N9 subtype avian influenza vaccine
US11512117B1 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and recombinant H5N2 subtype avian influenza virus, vaccine and uses thereof
WO2021051907A1 (zh) 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法
CN112538464A (zh) 血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20及其构建方法和应用
CN112210571B (zh) 表达iss基因的新城疫LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统、其构建方法及应用
CN109295095A (zh) 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体
CN114574452B (zh) Hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的方法及用途
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN114292823A (zh) 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用
CN110904056B (zh) 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用
CN112546215A (zh) 血清4型禽腺病毒灭活疫苗及其制备方法和应用
CN117568288B (zh) 一种高效拯救禽冠状病毒的方法及其应用
CN109957550A (zh) 流感病毒的拯救方法及其组合物
CN113151193B (zh) 血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210112

Assignee: Hebei jianjiale duck industry Co.,Ltd.

Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023980042130

Denomination of invention: Reverse genetic operation system, construction method, and application of LaSota attenuated Newcastle disease vaccine strain expressing iss gene

Granted publication date: 20230124

License type: Common License

Record date: 20230918

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210112

Assignee: Shijiazhuang Huifeng Animal Health Products Co.,Ltd.

Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023980042236

Denomination of invention: Reverse genetic operation system, construction method, and application of LaSota attenuated Newcastle disease vaccine strain expressing iss gene

Granted publication date: 20230124

License type: Common License

Record date: 20230920

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210112

Assignee: HEBEI GREENLAND ANIMAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024980002521

Denomination of invention: Reverse genetic operation system for LaSota attenuated Newcastle disease vaccine strain expressing iss gene, construction method and application

Granted publication date: 20230124

License type: Common License

Record date: 20240305