CN110079541A - 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段，然后进行分段克隆，再使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段组装到质粒载体上，筛选获得含有该冠状病毒全长cDNA的感染性克隆。其有益效果在于，本发明首次利用中低拷贝的质粒载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆，为冠状病毒的感染性克隆的构建开辟了新途径，该方法解决了冠状病毒载体选择困难和病毒大基因组在细菌中不稳定的问题，阳性克隆率高，且获得的反向遗传疫苗株克隆具有完整性、传代稳定性和感染性，拯救效率高，为研究冠状病毒的致病机理和开发新型疫苗等提供了有效工具。

Description

一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用。
背景技术
反向遗传学技术是通过构建病毒感染性分子克隆，在DNA水平上进行分子操作，从而研究病毒的结构与功能的方法，由于冠状病毒基因组较大，很难有合适的载体能够容纳如此庞大的基因组来获得病毒。因此冠状病毒基因组的研究一直局限于温度敏感突变株、缺陷病毒以及利用靶向RNA同源重组技术构建的重组病毒，其中靶向RNA同源重组技术是最早用于冠状病毒反向遗传学研究的技术，后来出现了基于痘苗病毒载体和细菌人工染色体(BAC)的冠状病毒反向遗传操作技术，BAC载体具有容量大(理论300kB)，拷贝低(1～2拷贝/E.coli)的特点。目前已报道基于BAC载体构建成功的冠状病毒感染性克隆包括TGEV、SARS-CoV、HCoV-OC43、MERS-CoV和FIPV。然而BAC载体的缺点也是显而易见的，由于拷贝数太低，需要培养大量菌液。BAC提取工作量较大。
对于中低拷贝的质粒载体的冠状病毒感染性克隆，目前还没有构建成功的报道。除了质粒载体容量的原因，最主要原因在于冠状病毒基因组较大并且含有对于E.coli具有毒性的序列，其基因组cDNA克隆在大肠杆菌中不稳定，经常造成一些片段的突变或丢失，并且随着质粒拷贝数的增加，这种不稳定性更加明显。因此限制了中低拷贝的质粒在冠状病毒感染性克隆上的应用。
鸡传染性支气管炎是一种因传染性支气管炎病毒造成的高度接触性、急性及病毒性的呼吸道疾病。临床上的主要症状是打喷嚏、咳嗽及啰音、肾炎、产蛋率及蛋品质下降等症状。且感染不同日龄或者不同种类的家禽引发的影响不同，主要导致呼吸系统、肾脏、生殖系统等方面的疾病的发生，引发的死亡率较高，从而造成很大的经济损失。
传染性支气管炎病毒(IBV)是较为典型的冠状病毒，具有囊膜，是目前已知的RNA病毒中基因组最大的单股正链RNA病毒。该病毒结构蛋白包括核衣壳蛋白，纤突蛋白、小膜蛋白和膜蛋白。由于IBV的RNA聚合酶缺乏校正功能，且纤突蛋白的多变性，并且其基因组复制方式极易发生重组，导致IBV极易发生变异，从而产生新的毒株、基因型或血清型。目前世界范围内报道的IBV毒株至少可以分为30种基因型或血清型。其中Mass型主要包括M14、H52和H120。
鸡传染性支气管炎的防制主要为疫苗接种，传统疫苗在安全性、有效性以及成本等方面都存在一定的缺陷，已经研究的基因工程疫苗中亚单位疫苗免疫效果不如传统疫苗，利用基因工程技术的活载体疫苗在表达外源抗原上具有灵活的可操作性，而且能够有效地传递抗原，但目前作为疫苗活载体只有小RNA病毒，例如，新城疫病毒载体和猪繁殖与呼吸综合征病毒载体。
发明内容
本发明针对于以上问题，提供一种利用中低拷贝的质粒载体构建冠状病毒感染性克隆的方法，克服了现有技术中冠状病毒cDNA在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统方法酶切连接效率低，拯救率低的问题，克服了传统方法不能获得完整全基因组的问题，所述方法包括以下步骤：
S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；
S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法包括酶切或PCR扩增；
S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；
S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；
S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；
S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7 RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒的反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。
本发明所述构建冠状病毒感染性克隆方法，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段进行分段克隆，避免了病毒大序列在细菌中毒性和不稳定的问题，同时也克服了常规质粒载体容量小难以承载冠状病毒大序列的问题，其次，使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段一次组装到中低拷贝的质粒载体上，经过筛选，能获得该冠状病毒的反向遗传株的即为含有全长cDNA的感染性克隆。
其中，步骤S3中丁型肝炎核酶的作用是：辅助切割以产生精确的病毒基因组3’末端。
标记片段的意义在于区分原病毒株和克隆毒株，无义突变是确保突变后所表达的蛋白或呈现的功能不受影响，从而保障克隆毒株的完整性和感染性。
上述方法中所涉及的同源重组的操作视为公知，常见的方法为在目标载体上添加与目的基因相同序列的同源臂，在细胞内重组酶的作用下，发生同源重组。本发明中的同源重组特指重组酶RecE/T介导的。
进一步，步骤S5中所述目标质粒载体为线性载体p15A-cm，所述同源重组所使用的感受态工程菌为GBdir E.coli。
进一步，所述步骤S5中阳性克隆的筛选温度为20～30℃。
进一步，所述步骤S6还包括辅助质粒的构建，所述辅助质粒包含表达核衣壳蛋白的基因。
cDNA在细胞内转染的过程，需要表达核衣壳蛋白来稳定及保护病毒基因组以获得完整的病毒毒株。
本发明同时提供一种所述构建冠状病毒感染性克隆方法在制备鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆中的应用。
进一步，所述冠状病毒为传染性支气管炎病毒的疫苗株。
本发明也提供一种鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
SS1：提取鸡传染性支气管炎病毒疫苗株的RNA，转录获得cDNA；
SS2：以步骤SS1所述cDNA为模板，扩增包含T7启动子和鸡传染性支气管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四个片段，以基因合成的pUC47-HDVR-T7 ter为模板，扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7 terminator)的片段E；
SS3：将线性质粒pBR322为模板，与步骤SS2中A、B、C、D四个片段分别同源重组，得到分别包含A、B、C、D片段的重组质粒；
SS4：选取步骤SS3所得包含D的重组质粒，将其中部分碱基做无义突变，记为突变片段载体pDt；
SS5：以质粒p15A-cm-ccdB为模板，扩增得到用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm，酶切步骤SS3和SS4中重组质粒，获取A、B、C和Dt片段，将片段A、B、C、Dt、E和线性载体p15A-cm共转入感受态细胞GBdir E.coli中，抗性筛选获得阳性克隆；
SS6：以步骤SS1所得cDNA为模板，扩增得到的N基因再与质粒pVAX1同源重组，构建得到表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N；
SS7：将步骤SS6所述表达N基因的质粒载体pVAX1-N与步骤SS5所得感染性克隆共转染BSR-T7/5细胞，能拯救获得鸡传染性支气管炎病毒反向遗传株的感染性克隆即为含有该鸡传染性支气管炎病毒全基因组的感染性克隆。
N基因是指编码N蛋白的基因，N蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白之一，为病毒的核衣壳的组成蛋白。N蛋白3个碱性氨基酸区域的基本特征可能有利于其与病毒核酸的结合，以便包裹核酸，且含有核定位和核输出信号调节胞质与胞核动态运输过程，使病毒基因组RNA易于装配入病毒粒子内部。在感染细胞中，N蛋白是表达量最高的病毒蛋白之一，也具有很好的免疫原性，能够诱导机体产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效应。此外，N蛋白在冠状病毒反向遗传系统中对于增强病毒拯救效率是必不可少的。
进一步，所述鸡传染性支气管炎病毒疫苗株为H120。
本发明同样保护一种由上述方法得到的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。
本发明亦保护一种所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆在制备载体疫苗中的应用。
应用于研发新型疫苗时，可以通过删除或替换毒力基因或复制非必须基因并同时引入分子标记在短时间内迅速研制出相应疫苗。并且本发明所得鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆还可作为疫苗载体，插入或替换所需要的抗原基因，同时预防作用多种疾病。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
根据Genbank公布三个全基因序列(包含5’-UTR、3’-UTR及Ploy(A))：FJ888351、FJ807652和GU393335，将H120全基因序列分成4段进行分段克隆至含有同源臂的pBR322载体上，形成pBR322-H120A～D，相邻两段间含有50-70bp重叠区域作为重组同源臂。5’端第一段H120-A在克隆过程中通过PCR添加T7启动子。各片段克隆需进行酶切鉴定及测序验证序列正确性，然后通过酶切获得四片段DNA(H120-A～D)。以质粒pUC57-HDVR-T7ter为模板PCR扩增含有基因组3’同源臂的HDVR-T7ter序列作为H120感染性克隆第5段序列。利用RED/ET重组技术将H120-A～D、HDVR-T7ter和含有同源臂的线性载体p15A六段序列，在E.coli中实现组装，形成感染性克隆p15A-cm-T7 promotor-H120 genome-HDVribozyme-T7terminator。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
本发明首次利用中低拷贝的质粒载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆，为冠状病毒的感染性克隆的构建开辟了新途径，该构建方法避免了病毒大序列在细菌中不稳定的问题，同时也克服了质粒载体容量小难以承载大序列的问题，本发明所提供的方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传疫苗株克隆具有完整性、传代稳定性和感染性，拯救效率高，为研究病毒的致病机理，开发新型疫苗等提供了有效工具。
获得病毒的感染性克隆后就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入等手段来研究RNA病毒的基因复制和表达，RNA的自发重组和诱导重组病毒与宿主的相互作用如病毒在细胞间的传递机制等，此外，也可进行抗病毒策略研究还可用于构建新的病毒载体。
利用反向遗传学构建疫苗比以往传统的传代弱毒疫苗速度要快，在疫情爆发时可在短时间内获得相应疫苗；同时，在免疫动物后，便于将野毒感染和疫苗免疫区分开来。
附图说明
图1为H120全基因四片段及克隆线性载体pBR322 PCR扩增结果，其中，1-4：H120A-D片段；5-8：A-D片段克隆线性载体；M1：DNA Marker DL10,000；M2：DNA Marker DL5,000。
图2为H120感染性克隆组装五片段及线性载体制备，其中，M：DNA Marker DL10,000；1-4：pBR322-H120 A～D muta经限制性内切酶XhoI酶切；5：片段E；6：线性载体p15A-cm。
图3为p15A-H120酶切分析，其中(A)p15A-H120酶切分析SnapGene软件预测，1：Bstz17I和PstI双酶切；2：Bstz17I、PstI和XhoI三酶切；M：DNA Marker DL5,000。(B)p15A-H120酶切，1-3：Bstz17I和PstI双酶切；4-6：Bstz17I、PstI和XhoI三酶切；M：DNA MarkerDL5,000。
图4为pVAX1-H120N酶切鉴定，其中(A)pVAX1-H120 N酶切SnapGene软件预测，1：XhoI和HindIII双酶切；M：DNA Marker DL5,000。(B)pVAX1-H120N酶切，1-3：XhoI和HindIII双酶切；M：DNA Marker DL5,000。
图5为rH120 F5 RT-PCR鉴定，其中1-3：rH120 F5 S1、M、3ab；4-6：母本病毒H120株S1、M、3ab；7：空白对照；M：DNA Marker DL2,000。
图6为rH120 F5和母本病毒H120株3ab基因PCR测序比对。
图7为rH120 F5和母本病毒H120 M蛋白Western-blotting检测。
图8为IBV rH120 F5病毒粒子负染透射电镜照片。
图9为10 rH120 F5和母本病毒H120在SPF鸡胚的生长曲线。
图10为质粒pBR322-kanR-amp-ccdB-rpsLneo结构示意图。
图11为质粒p15A-cm-ccdB结构示意图。
图12为质粒pUC47-HDVR-T7 ter结构示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下是实施例中所使用的载体、菌体、细胞和毒株。
鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120株(Genebank登录号分别为FJ888351、FJ807652、GU393335)、呼吸型强毒株M41(DQ834384)购自中国兽医药品监察所。
SPF鸡胚(9～11日龄)与2日龄SPF鸡购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。
表达T7 RNA聚合酶的金黄仓鼠肾细胞(BSR-T7/5 cell)购自南京科佰生物有限公司。
真核表达载体pVAX1载体购自Invitrogen公司，E.coli DH5α感受态为上海唯地生物公司产品，pBR322-kanR-amp-ccdB-rpsLneo(结构见图10)、p15A-cm-ccdB(结构见图11)，表达重组蛋白RecE/RecT的GBdir E.coli购自Gene Bridges。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
鸡传染性支气管炎病毒IBV-H120感染性克隆的构建
1)引物及基因合成
根据H120感染性克隆设计序列及拯救策略设计线性载体扩增引物、点突变引物、辅助质粒构建引物及鉴定检测引物等。引物及基因由华大基因合成(表1)。
表1本研究所用引物
Table 3.1 Nucleotide sequences of oligos used in this work
注：斜体加粗序列为T7启动子，加下划线序列为限制性内切酶识别位点
2)鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120的RNA提取
鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120种毒尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，接种后48h收获剩余鸡胚的尿囊液，于-80℃冻存。取200μL H120株尿囊液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量抽提试剂盒说明书提取病毒RNA，提取获得的RNA。
3)第一链cDNA制备
以提取的H120株RNA为模板，按照TAKARA第一链cDNA合成试剂盒(Primescript II1st Strand cDNA Synthesis Kit)说明书制备cDNA。
4)病毒基因组分段扩增及线性载体制备
第一链cDNA为模板，采用表1中的引物H120-A-F/R、H120-B-F/R、H120-C-F/R、H120-D-F/R进行PCR扩增包含T7启动子和H120全基因的A、B、C、D四个片段。
以基因合成的pUC47-HDVR-T7 ter(结构见图12)为模板，采用H120-E-F/R进行PCR扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7terminator)的片段E。
以质粒pBR322-kanR-amp-ccdB-rpsLneo为模板，采用表1中的引物pBR322-A-F/R、pBR322-B-F/R、pBR322-C-F/R、pBR322-D-F/R进行PCR扩增用于克隆A、B、C、D四个片段的线性载体。
扩增参数为98℃2min；98℃10s；55℃5s；72℃，60s；扩增35个循环；最后于72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并用凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR产物，并测定核酸浓度。
结果见图1，A段5’端含有T7启动子，D段3’端有polyA，相邻片段间有100bp-130bp同源臂，A、B、C和D片段大小分别为6947bp，7783bp，7213bp和6128bp。同时扩增克隆克隆片段的线性载体pBR322-A、pBR322-B、pBR322-C和pBR322-D，大小均为2195bp。线性载体5’端和3’端含有对应克隆片段60-75bp同源臂。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示各片段大小与预期一致。
5)电转感受态制备与转化
制备使用GBdir E.coli感受态，制备过程中需要用L-阿拉伯糖诱导RecE/RecT重组蛋白。制备的感受态置于冰上，立即使用。
将制备的H120全基因片段(A、B、C、D)及对应的线性载体(pBR322 for H120A、pBR322 for H120B、pBR322 for H120C、pBR322 for H120D)分别加入至刚制备好的感受态中，混匀，转移至1mm电击杯中，电转参数1350V，10μF，600Ohms。电转完成后立即加入1mlSOC培养基至电击杯中，将菌体重悬并转移至2ml离心管中，将菌液放置于37℃，260rpm振摇培养60min完成重组及抗性复苏。将菌液放置于离心机中，600rpm离心1min沉淀菌体，吸弃大部分上清液，保留200μl上清并吹打重悬，全部涂布于Kana平板，将平板放置于37℃培养，先正置1h后倒置培养12-16h。
6)重组质粒的筛选与鉴定
挑取菌落，置于600μl Kana液体培养基中，37℃，260rpm振摇培养4h后进行菌液PCR初步鉴定，阳性菌液连续划线培养两次并挑选单菌落进行菌液PCR鉴定，阳性菌液接种于200ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，260rpm振摇培养12小时，按质粒大提试剂盒低拷贝质粒方案抽提质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送华大基因公司进行测序。
7)定点突变与分子标记
设计定点突变引物3a-muta-F/3a-muta-R和3b-muta-F/3b-muta-R使3a基因90G→A(Ala30Ala)，3b基因159T→A(Ala53Ala)。以构建的质粒pBR322-H120D为模板，按照定点突变试剂盒One Tube Mutagenesis Kit(艾德莱)说明书进行两次碱基点突变。每次反应产物转化电转感受态E.coli GBdir，复苏后全部涂布于Kana平板，37℃培养12-16h，挑菌振摇培养，菌液送华大基因公司进行测序，测序引物为H120-3ab-F/R。两个位点均发生突变为正确质粒，菌液继续接种于200ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，260rpm振摇培养12小时，按质粒大提试剂盒低拷贝质粒方案抽提质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送华大基因公司进行测序验证。测序正确质粒命名为pBR322-H120D muta，测定核酸浓度，置于-20℃冻存。
8)感染性克隆p15A-cm-H120组装
以质粒p15A-cm-ccdB为模板，采用表中的引物p15A for H120-F/R进行PCR扩增用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm。构建成功的重组质粒pBR322-H120A、pBR322-H120B、pBR322-H120C和pBR322-H120D muta经限制性内切酶XhoI酶切得到A、B、C和D片段，片段E以pUC57-HDVR-T7 ter为模板，表1中HDV-T7ter-F/R为引物PCR扩增获得。上述PCR产物及酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并用凝胶回收试剂盒回收和纯化目的片段，并测定核酸浓度。
制备诱导表达RecE/RecT重组蛋白的GBdir E.coli电转感受态，将片段A、B、C、D、E和线性载体p15A-cm各500ng加入感受态中并按设定的RED/ET电转程序进行电转及复苏，将菌液经离心沉淀全部涂布于含有氯霉素的LB平板，并放置于25℃培养24h。
挑取菌落，置于600μl含有氯霉素的LB液体培养基中，25℃，260rpm振摇培养8h后进行菌液PCR初步鉴定，阳性菌液连续划线培养两次并挑选单菌落进行菌液PCR鉴定，鉴定结果如图2，阳性菌液接种于50ml含有氯霉素的LB液体培养基中，25℃，260rpm振摇培养24小时，按质粒小量提取试剂盒低拷贝质粒方案抽提质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定，见图3酶切鉴定正确的质粒送华大基因公司进行测序。质粒酶切及测序验证正确的菌液取2ml接种于200mL含有氯霉素的LB液体培养基25℃，260rpm振摇培养24小时，按去内毒素质粒大量提取试剂盒低拷贝质粒方案抽提质粒，测定核酸浓度，置于-20℃冻存。
9)辅助质粒pVAX1-H120N构建
以质粒pVAX1为模板，引物pVAX1-Linear-F/R进行PCR扩增制备线性载体，并在线性载体5’端与3’端添加25bp目的基因同源臂，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，经限制性内切酶DpnI消化清除质粒模板。以H120cDNA为模板，引物pVAX1-H120N-F/R进行PCR扩增N基因。上述酶切产物及PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，见图4，并用凝胶回收试剂盒回收和纯化目的片段，并测定核酸浓度。线性载体pVAX1与N基因组装按SeamlessAssembly Cloning Kit(Clone Smarter，USA)说明书操作配制体系，50℃反应30min。反应产物取5ul，转化DH5α感受态(唯地生物)，转化产物经复苏后涂布于含有卡那霉素的LB平板，并放置于37℃培养12-16h。
挑取菌落，置于600μl含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养4h后进行菌液PCR鉴定，阳性菌液送华大基因公司进行测序。测序验证正确的菌液接种于200mL含有卡那霉素的LB液体培养基37℃，220rpm振摇培养16小时，按去内毒素质粒大量提取试剂盒抽提质粒，测定核酸浓度，置于-20℃冻存。
10)病毒拯救
转染前一天将BSR-T7/5细胞传代至六孔板。当细胞生长至80％左右时将培养基换成2％血清，不含青链霉素及G418的GMEM培养基。
转染按照脂质体转染试剂Lipofectamine 3000 Reagent(invitrogen)说明书操作。
细胞培养48小时后，将培养皿置于-80℃冷冻，常温融化，冻融两次破碎细胞，10,000×g离心5min，收获细胞上清命名为rH120 F0。细胞上清经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚，37℃孵化。接种后24小时观察鸡胚并弃去死亡鸡胚，继续孵化至48h收获鸡胚尿囊液并继续鸡胚接种传代，如此盲传5代并收获第5代鸡胚尿囊液命名为rH120 F5，经0.22μM滤膜过滤后分装保存于-80℃。
实验例1
拯救病毒检测
1)RT-PCR检测
取200μL rH120 F5株病毒液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量抽提试剂盒说明书提取病毒RNA，提取获得的RNA溶于40μL RNase-free TE buffer，取10μL RNA按Recombinant DNase I(RNase-free)(Takara)说明书清除DNA。以上述RNA为模板，表3.1中引物IBV-S1-F/R、IBV-M-F/R和H120-3ab-F/R按一步法RT-PCR试剂盒PrimeScript OneStep RT-PCR Kit Ver.2说明书扩增S1、M和3ab基因。RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察见图5，并送华大基因公司测序，测序结果见图6。
2)M蛋白Western blotting检测
将rH120 F5和母本H120病毒液接种至细胞培养六孔板单层CK细胞，37℃吸附2h后换成2％血清的DMEM培养基，细胞置于37℃，5％CO2培养箱培养48h，收获细胞总蛋白，Western blotting检测IBV M蛋白。
如图7所示，rH120 F5和母本病毒H120株感染的CK细胞总蛋白中都可以检测到25kD特异性IBV M蛋白。
3)病毒的超速离心纯化及电镜观察
收集含有IBV rH120 F5的鸡胚尿囊液300ml，进行病毒的超速离心纯化、磷钨酸负染和透射电镜观察。
观测到病毒粒子(图8)，病毒粒子近似于圆形，直径介于100-200nm，呈近圆形，有囊膜，囊膜表面有松散均匀排列的纤突(Spike)。
实验例2
拯救病毒的生物学特性
1)rH120病毒生长情况测定
将rH120 F5病毒液及母本病毒H120毒用生理盐水稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各30枚，102EID50/胚。分别于接种后6h，12h，24h，36h和48h各收获5枚鸡胚的病毒尿囊液，混合后分装，置于-80℃冻存。
(图9)结果显示：rH120 F5病毒增殖趋势与母本毒株H120基本一致，rH120 F5总体滴度略低于母本毒株H120，病毒滴度差异不显著(p＞0.05)，并且在48h与母本毒株H120基本相同。说明rH120 F5与母本毒株H120一样，高度适应鸡胚。
实验例3
1)rH120病毒对鸡胚致病力
将rH120 F5病毒液及母本病毒H120用生理盐水稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各20枚，102EID50/胚。接种后连续7天每天观察并记录鸡胚死亡情况，第7天解剖未死亡鸡胚并观察鸡胚病变。
结果表明10日龄SPF鸡胚接种rH120 F5或H120后3d开始出现鸡胚死亡，6d全部死亡。说明rH120 F5和H120高度适应鸡胚，对鸡胚致病力基本一致。
2)rH120病毒对鸡致病力及免疫保护
将40只2日龄SPF鸡随机分成4组，每组10只，置于负压隔离器中饲养，自由饮水采食。其中2组为实验组分别通过滴鼻方式每只鸡接种103.5EID50(100μL)rH120 F5或母本病毒H120，第三组接种100μL灭菌PBS作为非免疫攻毒对照组，第四组作为健康对照。接种后每天观察鸡只状态。接种后14天，实验组及非免疫攻毒对照组所有鸡只通过滴鼻方式攻毒呼吸型IBV强毒株M41，104.5EID50/只。攻毒后每天观察实验鸡发病与死亡情况，对死亡鸡及时进行剖检观察。攻毒后14天，对所有鸡进行扑杀鸡并剖检观察大体病变。
结果显示，免疫组接种rH120 F5或H120后，鸡只精神状态良好，采食量和饮水量没有变化，呼吸正常，未出现传支特异性临床症状与病理变化。滴鼻攻毒后，免疫组接种rH120F5或H120后，鸡只精神状态及采食饮水量正常，没有传支临床症状。而非免疫攻毒对照组所有鸡只表现为精神沉郁、采食、饮水下降，咳嗽、眼睛湿润，羽毛蓬乱、喜蹲伏，攻毒后14d，死亡率30％。可见rH120 F5和母本毒株H120相同，对SPF雏鸡安全，并能保护雏鸡抵抗呼吸型强毒M41的攻击。
拯救病毒rH120经鉴定，生物学特性与母本病毒H120一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；
S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法为PCR扩增；
S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；
S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；
S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；
S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。
2.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，步骤S5中所述目标质粒载体为线性载体p15A-cm，所述同源重组所使用的感受态工程菌为GBdir E.coli。
3.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述步骤S5中阳性克隆的筛选温度为20～30℃。
4.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述步骤S6中辅助质粒包含表达核衣壳蛋白的基因。
5.一种权利要求1～4任意一项所述构建冠状病毒感染性克隆方法在制备鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆中的应用。
6.一种鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
SS1：提取鸡传染性支气管炎病毒疫苗株的RNA，转录获得cDNA；
SS2：以步骤SS1所述cDNA为模板，PCR扩增包含T7启动子和鸡传染性支气管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四个片段，以基因合成的pUC47-HDVR-T7 ter为模板，扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7 terminator)的片段E；
SS3：将线性质粒pBR322为模板，与步骤SS2中A、B、C、D四个片段分别同源重组，得到分别包含A、B、C、D片段的重组质粒；
SS4：选取步骤SS3所得包含D的重组质粒，将其中部分碱基做无义突变，记为突变片段载体pDt；
SS5：以质粒p15A-cm-ccdB为模板，扩增得到用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm，酶切步骤SS3和SS4中重组质粒，获取A、B、C和Dt片段，将片段A、B、C、Dt、E和线性载体p15A-cm共转入感受态细胞GBdir E.coli中，抗性筛选获得阳性克隆；
SS6：以步骤SS1所得cDNA为模板，扩增得到的N基因再与质粒pVAX1同源重组，构建得到表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N；
SS7：将步骤SS6所述表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N与步骤SS5所得阳性克隆共转染BSR-T7/5细胞，能成功拯救获得鸡传染性支气管炎病毒反向遗传株的阳性克隆即为含有该鸡传染性支气管炎病毒全基因组的感染性克隆。
7.根据权利要求6所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法，所述鸡传染性支气管炎病毒疫苗株为H120。
8.一种利用权利要求6或7所述构建方法得到的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。
9.一种权利要求8所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆在制备载体疫苗中的应用。
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