CN110777156A - 一种iapv感染性克隆的构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IAPV感染性克隆的构建方法和应用。一种IAPV感染性克隆，其制备步骤是：(1)IAPV病毒BJ2株基因序列的分段合成；(2)IAPV病毒感染性克隆的组装与构建。本发明通过荧光定量试验、免疫印迹试验、毒理实验，药物抑制，活体蜜蜂喂毒等实验证明：本发明所构建的IAPV病毒感染性克隆可以拯救出具有与IAPV野生型病毒感染蜜蜂相同症状的病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选等方面具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种IAPV感染性克隆，还涉及一种IAPV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的报告病毒在抗病毒药物筛选中的应用。
背景技术
蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)于2007年才在以色列被分离鉴定。该病毒可感染各个发育时期的蜜蜂个体(卵、幼虫、蛹、成蜂)和蜂群各级型蜜蜂(工蜂、雄蜂和蜂王)。自在以色列发现此病毒后，在世界各地均发现广泛存在，近年来发现也流行于亚洲地区，尤其是我国蜂群冬季流行较为普遍，已成为危害我国冬季蜂群损失最为严重的病害之一，甚至有的地区其蜂群感染率高达96％。其典型发病症状为:患病蜜蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤，逐渐麻痹抽搐死亡。病症与ABPV相似，并且其生物学和系统发育学特性都与ABPV和KBV非常接近，同时与ABPV和KBV核酸序列还有65％和75％的同源性。目前为止，实际生产中主要采用蜂群健康管理及其它化学试剂疗法预防IAPV，尚无特效抗IAPV感染的有效药物。为了减少该病毒的感染与发生，药物研发及昆虫病毒学家开展了深入的研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对以色列急性麻痹病毒的药物，研发新型抗病毒生物制剂提供理论依据。
IAPV病毒属于双顺反子病毒属，双顺反子病毒属病毒基因组为一条正义单链RNA，可以直接作为模板(mRNA)进行病毒蛋白的翻译。典型的双顺反子RNA病毒基因组具有2个不重叠的开放阅读框(open reading frames，缩写为ORFs)，且在基因组两侧各有一个UTRs。基因组5′端有一个小基因连接蛋白(genome-linked virus protein，缩写为VPg)，3′端连接一个Poly A尾，二者具有维持基因组稳定和防护RNA分子降解的功能。2个ORFs之间的非翻译区被称为间隔区(intergenic region，缩写为IGR)。基因组近5′端和近3′端的2个ORFs分别编码合成非结构蛋白(non-structural protein)和结构蛋白(capsid protein)前体，然后进入位于5′端UTRs区和IGR区内的内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysites，缩写为IRES)进行RNA基因组的翻译。
反向遗传学主要是针对RNA病毒研究的一项有效工具，是一种体外拯救病毒的有效方法。正常情况下是在质粒中构建通过PCR技术得到的全基因组序列，采用体外转录的手段获得该病毒全基因组RNA全长，将此RNA转染到合适细胞或相应活体能够拯救出具有致病性的病毒，此病毒的质粒称为感染性克隆。通过感染性cDNA克隆，研究人员可以在基因水平对病毒基因组进行各种修饰，通过其病毒的表型来判断对病毒的毒力的影响，从而深入研究病毒的感染特点与致病机制。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒的众多难题。目前，已有许多RNA病毒的全长感染性克隆被报道，包括很多昆虫的RNA病毒，但是还未见有报道关于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的感染性克隆。
发明内容
本发明提供一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆的构建方法，以及该感染性克隆在抗病毒药物筛选方面的应用。本发明所构建的蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆将为深入开展蜜蜂病毒的复制、致病特点、包装机制等基础理论研究以及药物研发、功能评价等应用研究提供有效的技术平台，为保护蜜蜂健康提供有力的技术支撑。
本发明的目的在于提供一种IAPV病毒感染性克隆pACYC-IAPV，其序列为SEQ IDNO.1所示，其中1～640：IAPV-5’UTR序列；641～6493：IAPV病毒非结构蛋白序列；6494～6676：IAPV-IRES序列；6677～9599：IAPV病毒结构蛋白以及3’UTR序列；9600～13235：pACYC177序列；13236～13252：T7启动子序列。
本发明还有一个目的在于提供了一种IAPV病毒感染性克隆的构建方法，根据本发明提供的方法，构建IAPV-BJ2病毒株感染性克隆,并将体外转录的RNA注射到蜜蜂体内，通过荧光定量PCR和免疫印迹实验，可以验证IAPV病毒在蜜蜂体内可以增值并具致病性。
本发明最后一个目的在于提供了一种IAPV病毒感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用。利用IAPV病毒感染性克隆所拯救出的IAPV病毒对蜜蜂进行感染实验，通过饲喂抗病毒药物，从而计算蜜蜂死亡率可知道药物对病毒的抑制情况。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明的设计思路为：
以低拷贝的载体pACYC177为对象，将IAPV的基因组通过同源重组的方法插入到pACYC177中，同时在病毒5’端非编码区上游引入T7RNA聚合酶的启动子序列，因此IAPV感染性克隆基因组的顺序为：T7-5’UTR-IAPV-3’UTR。此外，T7启动子可以线性化的DNA为模板，在体外高效的转录获得病毒RNA，体外转录出的RNA注射蜜蜂后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。
本发明上述IAPV感染性克隆的构建方法，其步骤如下：
1)IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成
合成IAPV全长基因组的cDNA：选择IAPV-BJ2病毒株序列，GenBank:MG599488.1；分成三个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7+基因组1-3823nt序列(T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸组成的核苷酸片段)，片段2为基因组3804-6873(自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段),片段3为基因组6855-9599nt+A序列(自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列组成的核苷酸片段)；T7启动子序列如SEQ ID NO.2所示，A序列如SEQ ID NO.3所示，三个片段分别用高保真酶通过PCR的方式并进行胶回收得到，经过DNA测序鉴定为正确序列。
2)含有病毒基因组的IAPV cDNA感染性克隆的构建
(1)IAPV基因组片段将片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177，引物pACYC1905F的序列为SEQ ID NO.4，引物IA6820-P1580R的序列为SEQ ID NO.5，，通过同源重组将片段1和片段2连接到载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-6.8k；
(2)IAPV基因组全长pACYC-IAPV的拼接：用引物IAPV6840R和引物pACYC1580R通过反向PCR线性化载体pACYC-6.8k，引物IAPV6840R的序列为SEQ ID NO.6，引物pACYC1580R的序列为SEQ ID NO.7，通过同源重组将片段3连接到线性化的载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有IAPV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-IAPV；
IAPV感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的IAPV病毒，其步骤是：
1，通过以pACYC177-IAPV质粒为模板，用引物T7-13FL/IAPV9613R,引物为SEQ IDNO.8，SEQ ID NO.9所示进行PCR扩增，通过dpnI酶(购自北京全式金公司)消化质粒后用PCR产物回收试剂盒(购自康为世纪公司)进行PCR产物纯化。利用HiScribeTM T7 Quick HighYield RNA Synthesis Kit(购自NEB公司)，按照试剂盒说明进行体外转录得到IAPV的RNA。
2，体外转录得到的IAPV RNA利用微量注射器注射4-5ugRNA到蜜蜂体内，并在感染后收集死亡的蜜蜂，保存于-80℃冰箱，并计算死亡率。
IAPV感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是：
本发明选择两种对病毒有抑制作用的药物：人参皂苷和月桂叶提取物来检测这两种药物对IAPV的抑制作用：
1，人参皂苷对IAPV的抑制作用：在培养瓶中饲养25只刚出房的蜜蜂，在33℃，50％湿度情况下，向每只蜜蜂注射IAPV病毒液，然后将含有人参皂苷的50％的糖水饲喂蜜蜂，人参皂苷的浓度分别为100ug/ml,50ug/ml,10ug/ml,每天观察蜜蜂死亡情况并记录死亡率。
2，月桂叶提取物对IAPV的抑制作用：在培养瓶中饲养25只刚出房的蜜蜂，在33℃，50％湿度情况下，向每只蜜蜂注射IAPV病毒液，然后将含有月桂叶提取物的50％的糖水饲喂蜜蜂，月桂叶提取物的浓度分别为100ug/ml,50ug/ml,10ug/ml,每天观察蜜蜂死亡情况并记录死亡率。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
1、本发明制备的蜜蜂病毒感染性克隆可以高效获得正确的病毒RNA，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。
2、由于蜜蜂病毒现尚无有效的细胞培养系统，因此，感染性克隆成为有力的研究工具。而验证其感染性克隆的毒力的，就只能依靠将感染性克隆饲喂或注射给健康的蜜蜂，从而使蜜蜂产生此病毒具有的症状，进而验证其致病性。此操作也能够直观的反应病毒的毒力，是将反向遗传学技术与活体动物感染结合起来，对病毒在体内的致病性进行验证，观察其发展过程，为研究者提供了广阔的应用前景。
3、通过药物抑制试验，证明本发明中的蜜蜂病毒感染性克隆是有效的，与传统的药物筛选相比，不仅有着明显的灵敏度和高效率，还可以用于高通量筛选抗病毒药物，可同时对多种药物抗病毒效果进行快速检测，缩短药物研发周期，是研发出特异性抗蜜蜂病毒药物的有效工具。
因此，以本发明为基础，将为深入开展蜜蜂病毒的复制机理与致病机理，抗病毒药物筛选和药物作用机制等方面具有广泛的应用价值，因此具有十分重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1为含有病毒基因组的蜜蜂病毒cDNA感染性克隆的构建示意图
图2为人参皂苷组计算所得死亡率曲线及饲喂过程中蜜蜂存活情况
图3为桂叶提取物组计算所得死亡率曲线及饲喂过程中蜜蜂存活情况
具体实施方式
本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
实施例1、蜜蜂IAPV病毒感染性克隆的构建
蜜蜂IAPV病毒感染性克隆的构建方法，其步骤是：
1，IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成：
构建带有IAPV全长基因组的cDNA感染性克隆：选择IAPV-BJ2病毒株序列，GenBank:MG599488.1；分成三个片段进行基因合成，这三个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7+自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸序列(T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸组成的核苷酸片段)，片段2为自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸序列(自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段),片段3为自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸序列的末端与A序列连接获得的片段(自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列组成的核苷酸片段)；片段1中的T7为启动子，序列如SEQ IDNO.2所示，位于病毒基因组5’UTR之前，是为了保证构建的cDNA在体外转录得到基因组RNA,片段3中的A序列是为了提高引物GC含量引入的，A序列如SEQ ID NO.3所示，位于病毒3’UTR之后。三个片段分别用高保真酶(购于美国NEB公司)通过PCR的方式并进行胶回收(购于康为世纪公司)得到，经过DNA测序鉴定为正确序列。
2)含有病毒基因组的IAPV cDNA感染性克隆的构建
(1)IAPV基因组片段将片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和引物IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177(购于北京华越洋公司)，引物pACYC1905F的序列为SEQ ID NO.4，引物IA6820-P1580R的序列为SEQ ID NO.5，，通过同源重组试剂盒(购于南京诺唯赞公司)将片段1和片段2连接到线性化的pACYC177载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109(购于北京全式金公司)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR的鉴定反应体系为2×buffer MIX:10ul,水：7ul，引物(5’-CTGGAAATGGCTATGCTCTGATGG-3’)1ul，引物(5’-GCCGATGAAGTATCCTGAGCC-3’)1ul，总体系20ul。扩增条件为：94℃5min，94℃30s,55℃30s,72℃2min,72℃5min,4℃10min,25个循环；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-6.8k；
(2)IAPV基因组全长pACYC-IAPV的拼接：用引物IAPV6840R和引物pACYC1580R通过反向PCR线性化载体pACYC-6.8k，引物IAPV6840R的序列为SEQ ID NO.6，引物pACYC1580R的序列为SEQ ID NO.7，通过同源重组将片段3连接到线性化的载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109(前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定；PCR的鉴定反应体系为2×buffer MIX:10ul,水：7ul，引物(5’-GACACCCTCATCAGTGCCAACA-3’)1ul，引物(5’-GGTGTCGAGGAGGACTTGAC-3’)1ul，总体系20ul。扩增条件为：94℃5min，94℃30s,55℃30s,72℃2min,72℃5min,4℃10min,25个循环；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有IAPV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-IAPV。
实施例2、IAPV病毒感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的病毒
1，病毒基因组的PCR扩增及纯化：以pACYC-IAPV质粒为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，反应体系为2×buffer MIX:25ul,水：19ul，引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGACTTTTATGTCCCTACGTACAATTTTCGCCGAAATT-3’(序列8))1ul，引物(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTAAATTTACCTAATTCGAAAATTTTG-3’(序列9))1ul，总体系50ul。扩增条件为：98℃30s，98℃8s,63℃20s,72℃6min,72℃10min,4℃10min,32个循环.反应结束后，向每管中加入1ul dpnI酶(购自北京全式金公司),37℃反应1小时。然后利用PCR产物纯化试剂盒(购自康为世纪公司)进行PCR产物纯化，并测浓度。
2，RNA的体外转录：取上一步纯化的DNA为模板，按照说明书的要求将其体外转录成RNA，使用Thermo NanoDrop2000测定RNA的浓度，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，检测体外转录得到的RNA有明显主带后，于-80℃保存备用。
3，感染健康蜜蜂：将4.5ug体外转录的IAPV通过微量注射器注射到蜜蜂背板里，之后放入培养箱(购自宁波江南仪器厂)中饲养，饲养条件：33℃，湿度50％，每天观察注射IAPV后死亡情况并收集死亡个体。
4，荧光定量试验及免疫印迹试验：收集的死亡蜜蜂通过RNA提取试剂盒和蛋白提取试剂盒(购自北京天漠生物公司)进行RNA和蛋白抽提，通过反转录试剂盒(购自康为世纪公司)得到cDNA，并利用荧光定量试剂盒(购自kapa公司)计算病毒拷贝数，大概是对照组的108倍。同时通过WESTERN BLOT实验，证明感染IAPV并死亡的蜜蜂提取的蛋白中含有病毒衣壳蛋白VP4。
实施例3、IAPV病毒感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是：
一、人参皂苷对蜜蜂病毒的抑制作用
取新出房蜂，每只笼子放入30只蜜蜂，室内饲养24h(温度33℃，湿度：50％),饲喂质量体积分数为50％的糖水。24h后，取出死蜜蜂，并捉蜜蜂使笼中蜜蜂数量均为25只。然后，先将蜜蜂放入4℃冰箱中冻15min,然后将蜜蜂取出放置冰上，然后通过背板注射的方式进行感染，每只注射完后用DEPC处理水清洗针头。共4组，每组25只，每只注射量为4.5ug，4组分别为：1.空白组，2.注射PBS，饲喂糖水组，3.注射IAPV，饲喂糖水组，4.注射IAPV，饲喂100ug/ml的人参皂苷(购买自北京京哲永兴生物公司)组。每组做两个平行试验，注射后正常饲养(温度33℃，湿度：50)，每天统计死亡蜜蜂并取出冻存。
结果如图2所示，计算所得死亡率曲线及饲喂过程中蜜蜂存活情况。
二、桂叶提取物对蜜蜂病毒的抑制作用
取新出房蜂，每只笼子放入30只蜜蜂，室内饲养24h(温度33℃，湿度：50％),饲喂质量体积分数为(0.5g/ml)的糖水。24h后，取出死蜜蜂，并捉蜜蜂使笼中蜜蜂数量均为25只。然后，先将蜜蜂放入4℃冰箱中冻15min,然后将蜜蜂取出放置冰上，然后通过胸部注射的方式进行感染，每只注射完后用DEPC处理水清洗针头。共4组，每组25只，每只注射量为(5ug)，4组分别为：1.空白组，2.注射PBS，饲喂糖水组；3.注射IAPV，饲喂糖水组；4.注射IAPV，饲喂100ug/ml的桂叶提取物(购买自北京京哲永兴生物公司)组。
每组做两个平行试验，注射后正常饲养(温度33℃，湿度：50％)，每天统计死亡蜜蜂并取出冻存。
结果如图3所示，计算所得死亡率曲线及饲喂过程中蜜蜂存活情况
以上两种药物均是已报道的对病毒生长有抑制作用的药物，但对蜜蜂病毒是否抑制尚不明确，通过人工感染的方式并统计蜜蜂的死亡率，可确定药物是否对病毒进行了抑制。且灵敏度更强，检测效率更高。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 一种IAPV感染性克隆的构建方法与应用
<130> WHOI190099
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13252
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gggactttta tgtccctacg tacaattttc gccgaaatta gcgatataat ttcaaaaccg 60
tttcgcggcg cctgagcagc ctttccaatg gtaggagcgt cgatcccccg tatggagtgg 120
agaatataag gctcagctag gatgacacgc ctgtacactg tcgacattag ttaagttgca 180
attacacgtc tgttgccgaa gaaaccattt tagtcaactg attatgattt ttgtataatg 240
acaaacagtg atgaactgta taactcatca acaacaaaac ggattacgaa cctatttgta 300
actatcttga tcgaagtcta gtagatcccc aatatagccc tgaaaagctt gagggatggg 360
atagctctat aaatagacgt gaggctttaa atcctgataa gtacattacc tgagaattcc 420
tccttttgga gtttgaattt atataagtta gtaccaatag ttaatatcat ttaagtatgt 480
tattatcgct gaaggcatgt atttcggata ataacctcta cattgatata taaactatat 540
gcaagtctcg gtggatattg cgttatggtc gcagttaacc tgtagcttat atattcctgt 600
gtcggagcag tggtaatgga gccggacaat ttcgccaaaa atgtttactt ctcaacaaaa 660
taataaaatc accaaacaac ccgcccccct ttcttatctt gcaagtatgc gagcaatgac 720
tgtggacgaa gagcaagaat attttcttac tctaaagtct gtagaaagag ctcaaatact 780
gaagatggtt tatgtggacc aaattgattt cgttatttta catcaagata tcaattgtat 840
tggttttaca ttgaccatag tagataagga tgaaagaacg aaggacctcg agtattttga 900
tcttaattgc gagcattatg aaaatttata tgacgcatta atggattccg aattttctaa 960
aacctggttt acattgttgc taaaatatat tgattatgct ccaattagta tgaacagtcg 1020
aggaatgccc cgctcagaga ccatctgtgt ttcaaaacac tggtggtatg agttgtatag 1080
gattggattc ttaaataagt tatatcgatg tggtgactgg gatagtattt tgcttctcct 1140
ttcaggagat attgaagaaa acccaggacc cgttgagatg tcttataagg aatcttgtag 1200
acagaagaga atgaagaaac gcgtttctaa gacttatgag gaaattaaaa tgcagcagca 1260
tattgataga atcaataatg aagagaaacg tgcacatatg acgaaaccac gcaagttaaa 1320
ggatttgatt gaagttgaaa tgcaaggaat gtttaattgg actgaagaaa gggaaatctt 1380
gaagagtact gcatttaaat tcaatcattc aatggaccga gcgaatcata ttatggataa 1440
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agcgaaattc tttgggtcaa taagtgttat tgatgtttgt atagatatta ttagtgcttt 1560
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agtggatatg ccagaagttg atccttcaat tttattgcaa cccggtgtta tagtaagtgc 1800
aatcttttta gttttaagtg tagtttttac taaaacactc ccaagtaaga ctggtgttga 1860
ggcgatgtta aagaggactg gagaactagg gcgctctgca aagggcatca tggatcttaa 1920
tacagttctt aatacatcag taacctcaat gcttgaatac tttggagtac atactttagg 1980
attaagacaa gaagctgaac ttcaagttct tgtagaaggt tataaaacct ggtgcgatga 2040
agttgcggct ttagtaggac ataagattaa tatggatggt acttttgatg gaagaagtat 2100
tgttgaagat gttatgagag atacaaagga aatccaacgt gtagagaatc tctacaaacg 2160
tggattggaa atttctcgta atattgcaga catgaaactt ccaacaaaat taaccattag 2220
ttttaataca cacatgagat acttgactga agttttcaaa gcagtagaca catctggtgc 2280
ttttggaaat aaaccccgaa ctcaacctgt agttatttgg ctatatggtg agtctggagt 2340
tggtaagtca ggtatgacat ggcctctagc cgtagatctt aataatagtt tagtagataa 2400
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ttcaacatct aatcctaatc ctgaattcat ggaattaata cgcacagcta atatagctcc 2580
ttatccttta catatggccc atttagaaga taaacgcaaa actaaattta catctaaagt 2640
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aggatactca aagactaaag gatgcatggt aagacgcttg gataaggatt tggttaagaa 2820
gaagactgga gacatatgtt caacagaatg ttatttagta gacttggtta atcccgaaac 2880
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aagtcgatca aaacgacctg aacaaaaaca tgacaagtgc cctgaattgg aatttgaaga 3060
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tcgtcttcaa gagatgattg agagttgcca aggagctgtg tatgatgcct atggtaaaac 3180
cgtatacatt tctaagttgg cttttgaatt agcccctctt gaatatgaga aacaaatgga 3240
aagaatttca gagatgagat tttatcagaa aatggcaagt ggtgttgtat accttcgtca 3300
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aaaggaccac ccttggacaa tagtagctgg agttctagga accttcattg gtattctcac 3420
cattgttggt ttctggaaat ggctatgctc tgatggacag aagaagaaac aggcaattaa 3480
gcgtcatttt attaatactg gatatacact tattatacct gaacgagaat tgaacaaatt 3540
ctgggagttg gatgaaactc ttgatttacg tagaatgcct gtaaatcaaa tagaggaaca 3600
tcttgcccta ctactgaagc cgcgtcatcg cgtggtttta gtacctaaag ccactaagta 3660
tataataagt ttagtagata atcacgccaa actgacagag aagattattc ttataactgc 3720
taataggtat gtgttttata aaaatcaaaa ttatgaattg gtgtttggag aattgaatca 3780
attcttcgaa aaagacccag aatctcttgt aaatactcct aaggttgaag cttttgcttc 3840
tgctgatttg agtacttaca aaaataggac cccagttgtg atcgaagcac agacatctgg 3900
agataatgtg actcttaaac aacaaaaggt taaagtaatt gaagcaaaaa catctaccga 3960
tgaagctact ttgaaacaac aaaaacctat tgttatagag gcacagtctt ctggtgattg 4020
tgtgacccga aaacaacaag tacaacgagt gattgaagca tttgcaagta gtgatgctgt 4080
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tacaatgcag atgtggaaag atcaagttgc tcaacgattg ataaccaatc gtgtattgac 4200
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actttttgtt cgttcaaatt tgatgctagt acctggacat cttcttggat tcattgctga 4320
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ctttccaaaa tttgtttgtc aacattctga tttagttaag catttccaaa atgccgaatc 4500
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tggtaaattt ttatcaacac tcattgaatg tgatcgagtg gaggcttatg ataggcctta 4620
tacgctgaat gattctcaga aaggacaata tattctacgt caaggcttag aatatgcaat 4680
gcccacgact aatggtgatt gtggttcgcc gcttatcatt aatgaaaccc aagttttgag 4740
gaaaattgct ggtattcatg tagctggagc tacaactggc aaagcctatg ctgagtctat 4800
aactcaaaaa gatcttgagc gagcatttac taaaatagat gtaagcatgc agatccaatt 4860
ggatttggat tcaacattgg atttctcaaa acccgaaccc aaattacctt ctggtactga 4920
atttggtcct gaagatctca gcttttgtga ccttcccgcc ctaaaaatgt taccagttgg 4980
taaactttct gaatccttat tcgaacctgg caagacggat ataaggccct ctttggtaca 5040
tggtcaaatt agtgacataa aaacaaaacc agcctattta cgtaatgtaa ttaaggatgg 5100
agatttagtt aatatgaaac ataaaaatct gatgaaatgt gctatggata caccctatat 5160
cgataaggac atgattgatg aggcatatca gttaaccaaa tctgtttggc taaaaggtat 5220
gagagatgaa ttgaagaagg ttctcactta tgaagaagct atttgtggtt ctgaagtgag 5280
tgagtacatt tcttcaataa atcgaagtag ttcccctgga tatccttgga ttaaggatag 5340
aacaaaagga actaaaggaa aacaaggctg gtttggatct gaaggagaat atattcttaa 5400
tgaagatgtt agactagccg ttcaacggcg aattcaggca gctcgtgaag gaaaacgatt 5460
acctgtaatg tgggttgata cattgaaaga tgagcgtcga cctattgaaa aagttaatca 5520
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ttatttgggc tttatagctc atttgatgga aaatcgaatt actaatgagg tgtccattgg 5640
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taaagttatt gcaggtgatt tttcaacttt tgatggatca ctgaatgtat gtattatgga 5760
aaaatttgca gatttagcga atgagtttta tgatgatgga aaagaaaata atctgatcag 5820
acacgtgttg ttgatggatg tgtacaactc tgtacatatc tgcaatgact ctgtgtatat 5880
gatgacacac agccaaccct ctggaaatcc tgcaacgact ccgcttaatt gcttcattaa 5940
tagcatggga ttgcgaatgt gtttcgcaat ttgtgctaag aatgcaggtg taaagatgac 6000
aatgaaagat tttggtaagc atgtttccat ggtctcttat ggagatgaca atgtcataaa 6060
cttcagtgat gaagtatgtg aatggtataa catggaaact attgctaaag cttttgaaac 6120
ccttggattc acctatactg atgaacttaa gggcgtaaat ggcgaagtac caaaatggcg 6180
atcaattaag gatgtgcagt atttaaaacg taagtttaga tatgatgaac aacggaaggt 6240
ttgggaagcc ccactttgta tggacacaat tcttgagatg ccaaactggt gtcgaggagg 6300
acttgacatt caagaaggta caaaattgaa ttgtgaaaat gcaattatgg agctttccat 6360
gcatgaagag agcgttttca atacttggtc taaaataatt gaccgagcat atgcaaatgc 6420
gactggagat cacctggaca taaacactta tcgtggttat gctcaggagc gatttctgga 6480
atactatatg taggtatagt gttctggagg catcattcta tggttaccca tcattagagg 6540
aaatttccaa taaactctgg tgtaaggctt agagtgatgg tcgaggtgcc ctatttaggg 6600
tgaggagcct cggtggcagc cccaccaaat cctctattgg ataggaacag ctgtactggg 6660
cagttacagc agtcgtatgg taacacatgc ggcgttccga aatatcatgc ctggtgattc 6720
acaacaagaa agcaatactc ccaacgtaca caatacggaa ctcgctacgt ccactagtga 6780
aaactcgatt gagactcaag aaatcacaac ctttcatgat gtggaaactc cgaataggat 6840
cgataccccc atggctcagg atacttcatc ggctaggaac atggatgata cgcacagtat 6900
tattcagttt ctacagcgcc ccgttctcat tgacaacatt gagatcattg ctggaacaac 6960
ggccgatgca aacaaacccc tcagtcgata tgtgttagat caacaaaatt cccaaaagta 7020
tgtacgaagt tggacgttac catcaacggt gcttaaggct ggcggaaaag ctcaaaaact 7080
tgccaatttt aagtatctgc gatgtgatgt tcaggtgaag ttagtactta atgcgaatcc 7140
ttttgtagca ggaagaatgt atctcgcata tagcccttat gatgacaaag ttgacacggc 7200
ccgtagtgtt ttacaaacat cgcgagctgg ggtcacaggc tatccgggag tcgaactaga 7260
cttccaattg gacaactctg tagaaatgac tattccatat gcctcttttc aagaggctta 7320
tgatctagtt actggaacgg aagattttgt gcagttgtat ttgttcccaa tcacacctgt 7380
actaggaccc aaatctgaat cagaaagttc caaagttgac atttcagttt atatgtggtt 7440
gagtaacata tctcttgtta ttccaacata tcgtataaat cctgatattg tcaaacaagg 7500
agcttcaagg atggtaactg aatctgttcc aaattctctt ggaaaagatg ccaaaactat 7560
agcagacgcc cttaagaaag ttcagaaaaa taatccttct gggtataaat atattatgca 7620
tgtcttgact ggatatgaac ctgaagtaaa gaatgtaaca atgcaagtga acgccccaaa 7680
aacgaaaaca aatcaaaaac ctacctcgga aaatcccaaa attggaccaa tatctgaagt 7740
ggcttctgga gtgaagacaa cagctaatgg aattgagcgc atccctgtga taggtgaaat 7800
tgtaaagcct gtaacaactg ctgtaaagtg gtttgcagac gttgtcggaa ctgtggcagc 7860
tatttttggc tggtccaaac ctcgaaatca acaacaggta tgcccattac aaaatgtgcc 7920
agcatgggga tattctctct ataaaggcat agatatgagc gtaccattgg cttatgaccc 7980
taataacgaa cttggtgatt tgaaggatgt ttttccttcc gcggttgatg aaatggctat 8040
agggtatgtt tgcggcaatc cagctgtgaa acatgttctt acctggaaga cgactgacgc 8100
aattcagaaa ccaatagcaa atggagatga ttggggggga gttataccag tgggaatgcc 8160
ttgttattct aaatccatta gaactacaag tatttcagaa acggaaaatc gtgaaactga 8220
agtcatagat gccgctccat gtgaatatgt tgctaacatg ttctcgtatt ggcgtgcaac 8280
tatgtgttat aggattaccg tggtgaagac agcttttcat actggcagac ttgagatttt 8340
ctttgaacca ggagtgatac ccgtcaaacc cactgttaat aacattgggc ccgatcagga 8400
tcaactcaca ggagcggtgg ctccttccga taataattat aagtacattt tggacctgac 8460
taatgataca gaagttacaa tacgtgttcc ttttgtttca aataagatgt tccttaagac 8520
tgctggaatc tatggtgcta atagtgaaaa taactggaac tttcatgaat cctttagtgg 8580
attcttatgt ataagaccag tcactaaatt gatggctcct gatactgtgt ctgacaatgt 8640
atctatagtt gtttggaagt gggcagaaga tgtagtagta gtagaaccga aaccactaac 8700
atccggacca acacaagtat atcgaccacc cccaactgct tcaacagctg ttgaagtctt 8760
aaatgtagaa cttcaaatta atataggcaa taagactaac gaaaatgtaa tttcattttt 8820
tgactcaaca gatgctgaaa cacaaaatca caacgcttta atgaaaggat gtggtgagtt 8880
tatcgtaaac ttgcgaactc ttctcagaac ttttagaacg ataacagata attggatatt 8940
acaagctaat accaagacac caatcacgga cctcacaaac accacagatg ctcagggtcg 9000
agactatatg tcttacctgt cctatttgta ccgattttat cgaggaggac ggcgttataa 9060
gttctttaac accacccctc tcaaacaatc tcaaacatgc tatataagaa gctttctcat 9120
accacgtaat tactcagctg acgaaattaa cgtagacgga ccttcacata taacataccc 9180
cgtaattaat cctgtgcatg aagtagaagt tccattctat tctcagtata ggaaaatacc 9240
tattgcttca acatcagata aaggttatga ttcttctcta atgtattttt caaatacagc 9300
aacaactcaa attgttgcca gagcaggaaa cgatgacttt acctttggtt ggatgatagg 9360
tccaccccag ctacaaggcg aatcacgctc cgtagccccc tagatgtgca ctgggagaca 9420
gacaaatctc cctatgtatg gctatagtct aaatttttca taaaatttca gtttagaccg 9480
aaaaccgaca cttgaactgg atatagtaca ttaatgtcct gcagctaaca ctgtagttta 9540
tatctaggta gagtgggcaa aattttcgaa ttaggtaaat ttaaaaaaaa aaaaaaaaac 9600
cggtgcagtc aatactgaat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa 9660
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tgtcattccg ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt 10080
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ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg 10200
cagcagccac tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc 10260
taaactgaaa ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa 10320
gagttggtag ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca 10380
gagcaagaga ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taaggggtct 10440
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 10500
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gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 10620
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 10680
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ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 10800
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 10860
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 10920
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 10980
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 11040
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 11100
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 11160
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 11220
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 11280
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11340
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 11400
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 11460
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 11520
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gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 11640
cttcaagaat tttataaacc gtggagcggg caatactgag ctgatgagca atttccgttg 11700
caccagtgcc cttctgatga agcgtcagca cgacgttcct gtccacggta cgcctgcggc 11760
caaatttgat tcctttcagc tttgcttcct gtcggccctc attcgtgcgc tctaggatcc 11820
tccggcgttc agcctgtgcc acagccgaca ggatggtgac caccatttgc cccatatcac 11880
cgtcggtact gatcccgtcg tcaataaacc gaaccgctac accctgagca tcaaactctt 11940
ttatcagttg gatcatgtcg gcggtgtcgc ggccaagacg gtcgagcttc ttcaccagaa 12000
tgacatcacc ttcctccacc ttcatcctca gcaaatccag cccttcccga tctgttgaac 12060
tgccggatgc cttgtcggta aagatgcggt tagcttttac ccctgcatct ttgagcgctg 12120
aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc 12180
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gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg 12300
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atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc 12480
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aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat 12780
acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac 12840
actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat 12900
gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa 12960
tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct 13020
gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc 13080
ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta 13140
tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc 13200
cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttacttaata cgactcacta ta 13252
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
taatacgact cactata 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ccggtgcagt caatactga 19
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ccctatagtg agtcgtatta agtaatacaa ggggtgttat ga 42
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gctcaggata cttcatcggc atactggctt actatgttgg 40
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gccgatgaag tatcctgagc c 21
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
accggtgcag tcaatactga atactggctt actatgttgg 40
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
taatacgact cactataggg acttttatgt ccctacgtac aattttcgcc gaaatt 56
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tttttttttt tttttttaaa tttacctaat tcgaaaattt tg 42
Claims (5)
1.一种IAPV感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，包括下述步骤：
1)IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成
合成IAPV全长基因组的cDNA：选择IAPV-BJ2病毒株序列，其序列如GenBank:MG599488.1所示；分成三个片段进行基因合成，这三个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸组成的核苷酸片段，片段2为自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段，片段3为自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列组成的核苷酸片段；T7启动子序列如SEQ ID NO.2所示，A序列如SEQ ID NO.3所示，三个片段分别用高保真酶通过PCR的方式并进行琼脂糖胶回收得到，经过DNA测序鉴定为正确序列；
2)含有病毒基因组的IAPV cDNA感染性克隆的构建
(1)IAPV基因组片段将片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和引物IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177，引物pACYC1905F的序列为SEQ ID NO.4，引物IA6820-P1580R的序列为SEQ ID NO.5，通过同源重组将片段1和片段2连接到线性化的pACYC177载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-6.8k；
(2)IAPV基因组全长pACYC-IAPV的拼接：用引物IAPV6840R和引物pACYC1580R通过反向PCR线性化载体pACYC-6.8k，引物IAPV6840R的序列为SEQ ID NO.6，引物pACYC1580R的序列为SEQ ID NO.7，通过同源重组将片段3连接到线性化的载体pACYC-6.8k上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有IAPV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-IAPV，其序列如序列表中SEQ ID NO.1的所示。
3.含有权利要求1所述IAPV感染性克隆的重组菌。
4.权利要求1所述的IAPV感染性克隆在制备获得活体蜜蜂感染模型的制剂中的应用。
5.权利要求1所述IAPV感染性克隆在抗蜜蜂以色列急性麻痹病毒药物筛选的应用。
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2019
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