CN113584065A - 一种多方法联用的大片段dna重组方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多方法联用的大片段DNA重组方法，包括以下步骤：S确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC；本发明突破了BAC大小限制，原则上最大能到450kb。解决了BAC修饰过程中会引入重组酶位点的问题。提高了整个方案的可操作性，便于进行多个大片段的整合和修饰。

Description

一种多方法联用的大片段DNA重组方法

技术领域

本申请涉及DNA重组方法，具体涉及一种多方法联用的大片段DNA重组方法。

背景技术

BAC(细菌人工染色体)是一种细菌染色体克隆载体，常规能容纳100kb的 DNA分子片段，最多能容纳300kb的DNA分子片段。随着科技的进步对于大片段 DNA修饰的需求日益增长，在此介绍一种多方法联用的对BAC进行改造的方法。

目前常用的大片段DNA重组技术有如下几种：

(1)YAC的构建：酵母人工染色体(YAC)的构建，YAC本身优点是容量大，最大能容纳1MB的DNA片段，但是它的缺点同样明显，YAC很容易发生DNA的重组导致最终结果不可控；

(2)常规BAC的构建：细菌人工染色体(BAC)的构建，BAC本身优点是稳定性高、便于改造；但缺点是容量小常规情况下不超过300kb，改造难度大，不能做到多位置无缝修饰。

上述方法虽然各有特色，但都存在不足：

(1)YAC的构建，YAC构建难度大，本身稳定性较差往往拿到的阳性克隆和目标序列有差距，最终导致实验结果不尽如人意。主要原因是YAC是在酵母中进行改造和修饰，很容易受到酵母本身重组酶的影响，同时YAC本身是结合在酵母染色体上，容易发生重组和置换。

(2)常规BAC的构建是依赖于Red重组酶进行的，首先BAC本身大小不会超过300kb，同时BAC本身没有抗性基因筛选导致常规BAC修饰存在容量小和修饰困难的缺点。

发明内容

为了解决上述现有技术的缺点，本发明公开了一种多方法联用的大片段 DNA重组方法，将Red重组技术、RMCE技术、Phes负筛技术连用，可以将BAC 装载容量扩大到450kb左右，并且可以做到任何位点无缝插入。

本发明的技术方案如下：

一种多方法联用的大片段DNA重组方法，包括以下步骤：

确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述方法包括以下步骤：

(1)根据片段需要在BAC上设计抗性片段和重组酶位点；

(2)引物设计；

(3)进行BAC修饰：

(4)RMCE-BAC融合；

(5)Phes负筛进行无缝修饰；

(6)最终BAC提取以及验证。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(1) 包括以下具体步骤：

1)根据项目需要查找BAC大片段需要拼接的位置；

2)根据确定的位置然后选择插入的重组酶位点；

3)确定好重组酶位点后根据拼接需要确认插入抗性序列；

4)通过RMCE进行融合拼接，将完整的序列拼接出来；

5)通过Phes删除残留的重组酶位点。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述重组酶位点选自loxP＝SEQ ID NO：1、lox511＝SEQ ID NO：2、lox5171＝SEQ ID NO：3、lox2272＝SEQ ID NO：4、LoxN＝SEQ ID NO：5中的一个或者多个；所述抗性序列选自Kan抗性序列＝SEQ ID NO：6、Amp抗性序列＝SEQ ID NO：7、Spe抗性序列＝SEQ ID NO： 8；Zeo-phes序列＝SEQ ID NO：9中的一个或者多个。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(2)引物设计包括以下具体步骤：

1)根据拼接好的文件将引物设计出来；

2)引物设计时需要参照引物设计规则，并且引物需要带有overlap；

3)引物设计规则如下表1所示

表1引物设计规则

结合长度	Tm值	GC含量	特异性
				20-25bp	45-60	40％-60％	无明显错配

。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(3) 进行BAC修饰具体包括以下步骤：

1)通过设计好的引物进行PCR，扩增获得需要的模块；

2)通过Red修饰的方法进行修饰重组酶位点以及筛选抗性；

3)通过菌落PCR确认是否修饰完成；

4)将修饰好的BAC安排BAC提取。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(4) RMCE-BAC融合具体包括以下步骤：

1)通过电机转化的方法将两个BAC转化到同一个感受态中；

2)通过Cre重组酶的作用将两个BAC进行融合；

3)通过菌落PCR确认融合是否成功。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(5) Phes负筛进行无缝修饰具体包括以下步骤：

1)通过诱导Red表达发生同源重组结合YEG平板筛选去除不需要的序列。

2)通过菌落PCR获得删除完全的融合BAC。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(6) 最终BAC提取以及验证具体包括以下步骤：

1)提取BAC，将改造完成的BAC提取出来进行特定的内切酶酶切；

2)将酶切好的BAC进行脉冲场电泳，电泳完成后和理论序列进行比对看是否和理论一致。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，在大片段BAC 构建中的应用。

本发明的有益效果：相比较现有技术，本发明具有如下进步方面：

本发明是将Red重组技术、RMCE技术、Phes负筛技术连用，可以将BAC装载容量扩大到450kb左右，并且可以做到任何位点无缝插入。与现有技术有如下表2中的优点。

表2：本发明与现有技术比较的优点。

本方法突破了BAC大小限制，原则上最大能到450kb。解决了BAC修饰过程中会引入重组酶位点的问题。提高了整个方案的可操作性，便于进行多个大片段的整合和修饰。

附图说明

附图1A-1C为本发明实施例1中的两BAC融合策略图；

附图2为本发明实施例1中质粒-VT492的构建图谱；

附图3为本发明实施例1中质粒VB131的构建图谱；

附图4为本发明实施例1中质粒VT502-step2的构建图谱；

附图5为本发明实施例1中两BAC融合的电泳图，其中M1为GeneRuler 1kb DNAladder，M2为GeneRuler High Rang DNA ladder,M3为Lambda Ladder PFG Marker；

附图6A-6D为本发明实施例2中的三BAC融合策略图；

附图7为本发明实施例2中质粒VT495-VT的构建图谱；

附图8为本发明实施例2中三BAC融合的电泳图,其中M1为GeneRuler 1kb DNAladder，M2为GeneRuler High Rang DNA ladder,M3为Lambda Ladder PFG Marker。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施方式中涉及到的基因序列如下所示：

loxP＝SEQ ID NO：1 ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT

lox511＝SEQ ID NO：2 ATAACTTCGTATAATGTATaCTATACGAAGTTAT

lox5171＝SEQ ID NO：3 ATAACTTCGTATAATGTgTaCTATACGAAGTTAT

lox2272＝SEQ ID NO：4 ATAACTTCGTATAAaGTATcCTATACGAAGTTAT

LoxN＝SEQ ID NO：5 ATAACTTCGTATAAGGTATACTATACGAAGTTAT

Kan抗性序列＝SEQ ID NO：6、Amp抗性序列＝SEQ ID NO：7

Spe抗性序列＝SEQ ID NO：8、Zeo-phes序列＝SEQ ID NO：9。

实施例1

将两个BAC进行拼接最终拿到修饰完成的序列。

1.1.VT502策略如下

1.1.1.如附图1A所示，先将BAC1原始BAC进行修饰，在BAC1原始BAC-5’上增加loxp以及lox2272位点。

1.1.2.如附图1B所示，再将BAC2原始BAC上3’增加Zeo-lox2272模块。

1.1.3.将修饰完成BAC1-VT克隆制备成感受态。

1.1.4.将BAC2进行提取然后线性化后进行电转到BAC1-VT感受态中，同时电转Cre质粒。

1.1.5.诱导Cre表达，发生RMCE进行两个BAC的融合。

1.1.6.电转片段进行Zeo去除，拿到最终的BAC融合好的质粒，如附图1C 所示。

1.2.实验步骤

1.2.1.BAC1进行修饰

1.Loxp-Kan-lox2272模块进行扩增，引物如下

F引物＝SEQ ID NO：10：

5’-aagtcagcacataaccatataggaagagtgacaaaagcagctgccttggttacctttgac-3’

R引物＝SEQ ID NO：11：

3’-TGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGGCACATTTC-5’

扩增使用的模板为质粒-VT492，如附图2所示；使用的PCR体系和程序如下表3所示

表3 PCR体系和程序

2.制备感受态

VT500-BAC-WT菌株

(1)提前一天取验证正确的BAC克隆过夜培养；

(2)取过夜培养的BAC菌测定OD值，根据OD值吸取菌液接种至4mL Cl+-LB 液体培养基中37℃*225rpm培养；

(3)培养一段时间后，用酶标仪测定菌液OD值，待OD值至0.6时，将菌液从摇床拿出，放于冰盒上；

(4)将2mL菌液分装到2.0EP管里，离心弃上清；

(5)向离心管里加入H2O混合物1ml，混匀，使沉淀全部散开，离心弃上清；

(6)重复步骤(5)3次；

(7)向沉淀中加入66uL的H2O，混匀，感受态做好后立即准备电转(若当日不使用则放入-80℃保存)。

3.电转Red质粒

(1)向做好的感受态的管中加入pRedET质粒，混匀；

(2)将感受态吸进电转杯内槽，将电击杯放于电转仪电击；

(3)加入无抗LB液体培养基至于电转杯中，混匀；

(4)转移至2.0EP管里，放于摇床培养；

(5)将摇好的BAC-Red菌进行划线避光培养36-48h。

4.电转模块修饰loxp、lox2272位点

(1)提前一天取验证正确的BAC-Red过夜培养；

(2)用酶标仪测定菌液OD值；

(3)向管中加arabinose 100uL并做好标记，至终浓度为1％(m/v)置于37℃诱导培养1.5h；

(4)将菌液从摇床拿出，放于冰盒上，预冷好后，分装到2.0EP管里，离心，离心结束，迅速倒出上清；

(5)向离心管里加入1ml H2O，用指轻弹管壁，使沉淀全部散开离心，离好后倒掉上清；

(6)重复步骤(6)3次；

(7)向沉淀中加入66uL的去离子水混匀，感受态做好后立即准备电转(若当日不使用则放入-80℃保存)。

5.模块电转感受态细胞

(1)向做好的感受态的管中加入200ng模块质粒，混匀；

(2)将感受态吸进电转杯内槽，将电击杯放于电转仪电击；

(3)加入无抗LB液体培养基至于电转杯中，混匀；

(4)转移至2.0EP管里，放于摇床培养；

(5)离心机5000g/2min收集复苏完成的菌液，取出800ul上清后重悬菌体，再取100ul菌液至平板上30℃16-18小时。

6.菌检

(1)挑取平板上的单克隆，对电转模块进行菌检；

使用的引物为：

F＝SEQ ID NO：12:5’-Gtgtgcggttgtatgcctgctg3-’

R＝SEQ ID NO：13:5’-TCCTCACCTTGTCGTATTAT-3’

(2)选择菌检阳性的BAC-模块菌进行接种培养；

(3)将菌液进行PCR送测，测序模块区域及插入接口区域；

(4)选择测序正确的BAC-模块菌命名为VT500-VT保菌待用。

7.修饰第二个BAC，按照步骤1-6，获得修饰后的BAC，命名为VT501-VT

扩增模块引物为：

F引物＝SEQ ID NO：14

5’-ccacctggctagttcttttatcagccagaacagttgcacctcagcctaagaagtttcacttcacctaaggcgcataacgataccacga-3’

R引物＝SEQ ID NO：15

3’-GGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGGCACATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGAT-5’

使用的模板为VB131，如附图3所示，

菌捡引物：

F＝SEQ ID NO：16:5’-cctatgctgccttgacatctttg-3’

R＝SEQ ID NO：17:5’-GGAACGGCACTGGTCAACTTG-3’

1.3.1.BAC质粒抽提，将VT501-VT进行抽提，抽提步骤如下：

(1)取400mL菌液进行菌体收集，弃上清，将瓶子倒置于两层吸水纸上，尽量使液体流尽。向瓶中加入20mL Buffer P1，混匀；

(2)加入20mL Buffer P2，上下轻柔颠倒混匀；

(3)加入20mL Buffer P3，上下轻柔颠倒混匀，此时有大量白色絮状物产生，将体系液冰浴10min；

(4)将冰浴后的裂解中和体系液4000rpm*30min离心，使絮状物离心至瓶底；

(5)将过滤后的上清液移至新的离心管中，每管转移30ml，加入60％体积的异丙醇，混匀静置2min后，16,000g*4℃*30min；

(6)将异丙醇离心后的上清去除，加70％乙醇5mL洗涤，16,000g*4℃*15min，离心后管壁上应清晰可见白色薄膜状沉淀，弃去离心后的上清；

(7)加入9.5mL Buffer EX溶解掉管壁上的白色薄膜状沉淀，同时加入300μL ATP-Solution和200μL ATP-Dpendent Exonuclease(从绿帽瓶中吸取225μL Exonuclease-Solvent至Exonuclease棕色瓶中，室温放置自然溶解)，37℃酶切反应60min(此步骤中应将离心管中残余液体全部吸出)；

(8)取QIAGEN-tip 500树脂柱子，加入10mL QBT平衡柱子；将步骤(7)中所得到的酶切体系液取出(若酶切体系液有浑浊或有明显沉淀，则 16,000g*4℃*3min，将上清液置于新的离心管中)，加入等体积的Buffer QS，混匀静置3min；

(9)将(8)中得到的混合体系液加至平衡后的QIAGEN-tip 500树脂柱中，自然滴落；加2*Buffer QC洗柱(即两次Buffer QC满柱)；

(10)加入15mL预热至65℃的Buffer QF，Buffer QF自然滴落至新的50mL 离心管中，加入70％(即10.5mL)的异丙醇溶液，静置2min，16,000g*4℃*30min 离心；

(11)加入1.5mL 70％乙醇吹打异丙醇沉淀，将沉淀吹打下来后，转移至1.5mL EP管内，13,300g*5min离心；

(12)去除上清液，置离心机中瞬离至4000g，将残留酒精吸出；加入PA Buffer，过夜溶解。

1.4.BAC融合

1.4.1.VT500-VT参照以上步骤2制备感受态。

1.4.2.VT501-VT电转进入VT500-VT感受态细胞

(1)向做好的感受态的管中加入1ng VT500-VT，混匀，冰上孵育20min。

(2)将电击杯盖上杯帽，放于卡槽里，轻顿2-3下以去除气泡，单击红色按钮(PULSE)键，当听到电转仪发出“嘀…嘀…”声音后，迅速拿出电击杯，拔掉杯帽，迅速加入900uL培养基，轻轻打至电击杯，缓慢吹打3-4次；

(3)吹打好后，将其完全吸出，转移至写好标记的2.0EP管里，记录电转数据后摇菌37℃*225rpm 1h；

(4)离心机5000g/2min收集复苏完成的菌液，取出800ul上清后重悬菌体，再取100ul菌液至平板上32℃16-18小时。

(5)将平板进行菌检获得融合BAC阳性克隆。

1.5.融合BAC去除残留的lox位点

1.5.1.按照步骤2制备感受态，然后按照步骤4电转去lox位点模块。

1.5.2.按照步骤6进行菌捡，获得最终阳性，命名为VT502-step2，如附图4 所示。

1.6.BAC提取

按照步骤1.3进行BAC提取，获得最终阳性克隆质粒。

1.7.BAC修饰和融合，最终进行脉冲场电泳进行验证

将提取的BAC分别使用三组限制性内切酶进行处理结果如下：按照理论序列使用①.AgeI/AsiSI对融合后的BAC进行酶切，理论条带为： 158.8K/65.2K/21.6K/0.3K/0.2K/0.1K

②.AscI/PmeI对融合后的BAC进行酶切，理论条带为： 150.2K/42.2K/22.6K/11.0K/7.5K/0.8K

③.SalI/PmeI对融合后的BAC进行酶切，理论条带为： 90.6K/60.5K/42.2K/22.6K/19.9K/11.0K/5.6K/1.0K/0.8K

酶切体系如下表4所示，37℃孵育2h

表4酶切体系

将酶切好的BAC质粒进行脉冲场电泳最终结果如图5所示：

结果显示和理论序列一致，表明最终克隆是两个BAC融合好的正确克隆。

实施例2

将三个BAC进行拼接最终拿到修饰完成的序列，总体策略如附图6A＝6D所示。2.1VT495策略如下：

2.1.1在VT492原始BAC的基础上进行修饰，修饰两个模块Car-lox5171、 loxp-Kan-lox2272。在VT493原始BAC的基础上进行修饰，修饰两个模块 loxp-Kan-loxN、Zeo-lox2272。在VT494原始BAC的基础上修饰loxp-Spe、 Zeo-loxN。

2.1.2将VT492-VT的菌株制备成感受态，将VT493-VT电转进去同时电转Cre 质粒诱导表达，在Cre每的作用下发生融合。

2.1.3电转去lox位点片段，将残留的lox位点去除。

2.1.4将上一步得到的正确克隆进行制备感受态，然后电转VT494，进行融合得到VT495，如附图7所示。

2.1.5将上一步得到的正确克隆进行制备感受态，然后电转去lox位点片段。进行残留的lox位点的去除，拿到最终三BAC融合阳性。

实验步骤：

1.参照实例一中步骤1-6将VT492/VT493/VT494进行修饰。

2.参照实例一中1.4-1.6进行两次BAC融合。

3.参照实例一中1.7进行BAC提取。最终按照如下方案进行酶切验证BAC的准确性。

酶切体系如下表5所示：

表5酶切体系

酶切方案如下：

①.SalI:274.1k/40.0k/35.0k/27.5k/19.6k/11.3k/6.4k/1.4k

②.NruI/NotI:143.8k/103.6k/88.3k/43.2k/6.9k/2.5k

分析附图8所示的的电泳图，得出实际酶切的条带和理论一致，因此判断三BAC 融合成功。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 赛业（苏州）生物科技有限公司

<120> 一种多方法联用的大片段DNA重组方法

<130> 2021

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

ataacttcgt ataatgtata ctatacgaag ttat 34

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag ttat 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

ataacttcgt ataaagtatc ctatacgaag ttat 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

ataacttcgt ataaggtata ctatacgaag ttat 34

<210> 6

<211> 1145

<212> DNA

<213> 人工

<400> 6

gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 60

taaaccatgg gatcggccat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 120

gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 180

gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 240

gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 300

ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 360

gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 420

atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 480

caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 540

gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 600

gcgcgcatgc ccgacggcga tgatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 660

atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 720

gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 780

tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 840

ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga ggggatcaat tctctagagc tcgctgatca 900

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 960

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1020

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1080

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1140

gcgga 1145

<210> 7

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 60

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cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 180

ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 240

gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 300

cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 360

cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 420

ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 480

catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 540

tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 600

ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 660

catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 720

cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 780

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ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 960

tccgcg 966

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<211> 1292

<212> DNA

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<400> 8

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cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt ggacataagc ctgttcggtt cgtaagctgt 120

aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg 180

gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt gttatgactg tttttttggg gtacagtcta 240

tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga 300

gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac attatgaggg 360

aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc 420

atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga 480

agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc 540

ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc 600

tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg cgttatccag 660

ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg 720

agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg 780

ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat 840

ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg 900

agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg 960

cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg 1020

tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg gcctcgcgcg 1080

cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca 1140

aataaccctc gagccaccca tgaccaaaat cccttaacgt gagttacgcg tcgttccact 1200

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1260

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cg 1292

<210> 9

<211> 1907

<212> DNA

<213> 人工

<400> 9

aaggcgcata acgataccac gatatcaaca agtttgtaca aaaaagctga acgagaaacg 60

taaaatgata taaatatcaa tatattaaat tagattttgc ataaaaaaca gactacataa 120

tactgtaaaa cacaacatat ccagtcatat tggcggcctc gagcacgtgt tgacaattaa 180

tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgacaagg tgaggaacta aaccatggcc 240

aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc gcgcgcgacg tcgccggagc ggtcgagttc 300

tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac ttcgtggagg acgacttcgc cggtgtggtc 360

cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg gtccaggacc aggtggtgcc ggacaacacc 420

ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac gagctgtacg ccgagtggtc ggaggtcgtg 480

tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg gccatgaccg agatcggcga gcagccgtgg 540

gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc ggcaactgcg tgcacttcgt ggccgaggag 600

caggactgag aattcgaacg aaccagtgtc accactgaca caatgaggaa aaccatgtca 660

catctcgcag aactggttgc cagtgcgaag gcggccatta gccaggcgtc agatgttgcc 720

gcgttagata atgtgcgcgt cgaatatttg ggtaaaaaag ggcacttaac ccttcagatg 780

acgaccctgc gtgagctgcc gccagaagag cgtccggcag ctggtgcggt tatcaacgaa 840

gcgaaagagc aggttcagca ggcgctgaat gcgcgtaaag cggaactgga aagcgctgca 900

ctgaatgcgc gtctggcggc ggaaacgatt gatgtctctc tgccaggtcg tcgcattgaa 960

aacggcggtc tgcatccggt tacccgtacc atcgaccgta tcgaaagttt cttcggtgag 1020

cttggcttta ccgtggcaac cgggccggaa atcgaagacg attatcataa cttcgatgct 1080

ctgaacattc ctggtcacca cccggcgcgc gctgaccacg acactttctg gtttgacact 1140

acccgcctgc tgcgtaccca gacctctggc gtacagatcc gcaccatgaa agcccagcag 1200

ccaccgattc gtatcatcgc gcctggccgt gtttatcgta acgactacga ccagactcac 1260

acgccgatgt tccatcagat ggaaggtctg attgttgata ccaacatcag ctttaccaac 1320

ctgaaaggca cgctgcacga cttcctgcgt aacttctttg aggaagattt gcagattcgc 1380

ttccgtcctt cctacttccc gtttaccgaa ccttctgcag aagtggacgt catgggtaaa 1440

aacggtaaat ggctggaagt gctgggctgc gggatggtgc atccgaacgt gttgcgtaac 1500

gttggcatcg acccggaagt ttactctggt ttcggcttcg ggatggggat ggagcgtctg 1560

actatgttgc gttacggcgt caccgacctg cgttcattct tcgaaaacga tctgcgtttc 1620

ctcaaacagt ttaaataagg caggaataga ttatgaaatt cagtgaactg tggttacgcg 1680

aatgggtgaa cccggcgatt gatagcgatg cgctggcaaa tcaaatcact atggcgctct 1740

agagtcgacc atagtgactg gatatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta 1800

tgcaaaatct aatttaatat attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttc 1860

ttgtacaaag tggttgatat ctctatagtc gcagtaggcg gaattcc 1907

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工

<400> 10

aagtcagcac ataaccatat aggaagagtg acaaaagcag ctgccttggt tacctttgac 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工

<400> 11

tggcaaaatc ggttacggtt gagtaataaa tggatgccct gcgtaagcgg ggcacatttc 60

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<400> 12

gtgtgcggtt gtatgcctgc tg 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 13

tcctcacctt gtcgtattat 20

<210> 14

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工

<400> 14

ccacctggct agttctttta tcagccagaa cagttgcacc tcagcctaag aagtttcact 60

tcacctaagg cgcataacga taccacga 88

<210> 15

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工

<400> 15

ggttacggtt gagtaataaa tggatgccct gcgtaagcgg ggcacatttc attacctctt 60

tctccgcacc cgacatagat 80

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<400> 16

cctatgctgc cttgacatct ttg 23

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 17

ggaacggcac tggtcaactt g 21

Claims (10)

1.一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC。

2.根据权利要求1所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据片段需要在BAC上设计抗性片段和重组酶位点；

(2)引物设计；

(3)进行BAC修饰：

(4)RMCE-BAC融合；

(5)Phes负筛进行无缝修饰；

(6)最终BAC提取以及验证。

3.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下具体步骤：

1)根据项目需要查找BAC大片段需要拼接的位置；

2)根据确定的位置然后选择插入的重组酶位点；

3)确定好重组酶位点后根据拼接需要确认插入抗性序列；

4)通过RMCE进行融合拼接，将完整的序列拼接出来；

5)通过Phes删除残留的重组酶位点。

4.据权利要求3所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述重组酶位点选自loxP＝SEQ ID NO：1、lox511＝SEQ ID NO：2、lox5171＝SEQ ID NO：3、lox2272＝SEQ ID NO：4、LoxN＝SEQ ID NO：5中的一个或者多个；所述抗性序列选自Kan抗性序列＝SEQ ID NO：6、Amp抗性序列＝SEQ ID NO：7、Spe抗性序列＝SEQ ID NO：8；Zeo-phes序列＝SEQ ID NO：9中的一个或者多个。

5.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(2)引物设计包括以下具体步骤：

1)根据拼接好的文件将引物设计出来；

2)引物设计时需要参照引物设计规则，并且引物需要带有overlap；

3)引物设计规则如下

结合长度 Tm值 GC含量 特异性 20-25bp 45-60 40％-60％ 无明显错配

。

6.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(3)进行BAC修饰具体包括以下步骤：

1)通过设计好的引物进行PCR，扩增获得需要的模块；

2)通过Red修饰的方法进行修饰重组酶位点以及筛选抗性；

3)通过菌落PCR确认是否修饰完成；

4)将修饰好的BAC安排BAC提取。

7.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(4)RMCE-BAC融合具体包括以下步骤：

1)通过电机转化的方法将两个BAC转化到同一个感受态中；

2)通过Cre重组酶的作用将两个BAC进行融合；

3)通过菌落PCR确认融合是否成功。

8.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(5)Phes负筛进行无缝修饰具体包括以下步骤：

1)通过诱导Red表达发生同源重组结合YEG平板筛选去除不需要的序列；

2)通过菌落PCR获得删除完全的融合BAC。

9.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(6)最终BAC提取以及验证具体包括以下步骤：

1)提取BAC，将改造完成的BAC提取出来进行特定的内切酶酶切；

2)将酶切好的BAC进行脉冲场电泳，电泳完成后和理论序列进行比对看是否和理论一致。

10.如权利要求1-9任一项所述的多方法联用的大片段DNA重组方法在大片段BAC构建中的应用。

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