CN1353187A - 一种新的植物外源凝集素基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供来源于Amaranthus caudatus含有内含子的苋菜凝集素ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)基因的克隆及编码ACA蛋白的编码区基因序列。将上述的ACA编码区基因序列转化到高效、稳定表达的微生物表达载体中,可利用微生物大量合成ACA蛋白。ACA基因在转基因植物中高效表达可使转基因植物获得抗蚜虫作用,同时提高其营养品质,在植物抗虫基因工程和品质改良中有潜在的应用价值。

Description

一种新的植物外源凝集素基因

本发明涉及植物抗虫基因工程及生物化学领域。具体地说，本发明涉及一个新克隆的苋菜ACA基因及在植物中表达的重组质粒，可进行植物转化以构建具有抗蚜虫特性的转基因植物；同时通过构建ACA基因高效，稳定表达的微生物表达载体，可利用微生物获得ACA蛋白。

ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)是南美大陆一种营养价值高的苋菜的种子^[1]中存在的一种植物凝集素，是一种贮藏蛋白，在种子萌发时提供营养。该蛋白只在胚乳形成时大量合成，在营养器官中不合成。GenBank中已经报道了ACA蛋白氨基酸序列(Accession No.g2781234)。用纯化的蛋白在体外喂饲豌豆蚜的实验结果表明ACA对所试蚜虫有很高的抑制或毒杀作用^[2]。该凝集素蛋白在肿瘤细胞的特异性识别，组织化学鉴定及肿瘤的早期诊断上有重要作用^[3]。随着对植物凝集素的功能进一步阐明及对其在医学，生物学方面的潜在应用价值的了解，克隆ACA基因对研究和应用该凝集素有重要意义。虽然在体外抗虫试验中，ACA表现出很好的抗蚜虫作用，但它在转基因植物中是否有相同的功能还有待实验证实。另外ACA蛋白作为一种富含必需氨基酸的蛋白质在改善作物品质上也会有重要作用。同时体外方便地获得大量的ACA蛋白可为肿瘤的检测提供充足的材料。

基于以上情况，本发明的目的是提供一种可获得ACA的新的结构基因，重组质粒，及在微生物和植物中表达的重组质粒。

为了获得ACA的基因组结构基因，以苋菜总DNA为模板进行PCR，首次获得了ACA结构基因。这个基因含有2628bp，有一个1716bp的内含子和两个分别为212bp和700bp的外显子。由其核苷酸序列推导出的氨基酸序列与已发表ACA蛋白的序列相比有很高的同源性。构建了能在植物体中具有组成型表达的重组质粒。其优点是在所得的转基因植株各组织中能表达ACA蛋白。为特定的目的，也可用组织特异型启动子驱动ACA基因在特定组织中表达。表达ACA蛋白的转基因植株可能会获得很好的抗蚜虫活性，同时由于ACA中必需氨基酸含量丰富，所以在植物中表达该蛋白还有助于改善植物的营养价值。利用ACA基因构建高效，稳定表达的微生物表达载体，可利用微生物大量合成ACA，该蛋白在肿瘤的检测中也会有一定的应用价值。

本发明通过基因工程手段，首次克隆了ACA基因，从而为实现ACA的生产以及在农业和医学等方面的应用提供可能。

为了达到上述目的，实现本发明的具体技术步骤如下：以苋菜品种Amaranthus caudatus的种子或叶组织提取的总DNA为模板，根据与ACA蛋白有高度同源的另一种苋菜Amaranthus hypochondriacus的AmA1蛋白基因的序列设计并合成一对引物^[4]，通过PCR扩增ACA结构基因，并克隆了该基因。将纯化的PCR产物连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)DH5α，获得含ACA结构基因的重组质粒pACA及其大肠杆菌(e.coli)DH5α转化子，该转化子(pACA/DH5α)已交中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保存，保存的微生物命名为pACAg，编号为CGMCC NO.0438。以重组质粒pACA为模板，利用反向PCR技术，设计特异的引物，扩增出ACA cDNA的编码区DNA片段，与载体连接后转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，获得了重组质粒pACAc及其大肠杆菌(E.coli)DH5α转化子。从重组质粒pACAc或pACA中分离出含有ACA结构基因的DNA片段，分别连接到植物组成型表达载体pBin438，连接物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，获得能在植物中组成型表达的重组质粒pBACAc和pBACA及大肠杆菌(E.coli)DH5α转化子。从上述转化子中提取重组质粒pBACAc和pBACA，转化根癌土壤杆菌(Agrobacterium.tumefacieus)LBA4404。分别获得土壤杆菌(A.tumefacieus)转化子pBACAc/LBA4404和pBACA/LBA4404。同时从重组质粒pACAc分离含有ACA结构基因DNA片段，连接到大肠杆菌表达载体pET30a(+)，连接物转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，获得能在大肠杆菌中表达的重组质粒pEACAc和大肠杆菌转化子pEACAc/BL21(DE3)。对大肠杆菌转化子pEACAc/BL21(DE3)进行了诱导表达，获得了特异的ACA蛋白。

                      实施例

1.苋菜Amaranthus caudatus总DNA的提取

植物材料为美国IOWA州立大学区域植物引种站提供的苋菜(Amaranthus caudatus)。DNA提取方法参照文献5。取苋菜叶片或正在成熟种子200mg，液氮研磨后，加入1ml冰预冷的DNA提取缓冲液[0.35M glucose，0.1Mtris-Hcl(PH8.0)，0.005M Na2-EDTA(PH8.0)，2％(w/v)PVP，0.1％(W/V)diethylithiocabarmic acid(DIECA)，0.2％(w/v)巯基乙醇，0.5％ Triton-X100]，充分混匀后，4℃离心2700Xg 10分钟，去上清。在沉淀中加入500ul细胞核裂解缓冲液[0.1M Tris-Hcl(PH8.0)，1.4M NaCl，0.02M Na2-EDTA(PH8.0)，2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，0.1％(W/V)DIECA，0.2％(W/V)巯基乙醇，0.5％ Triton-X100]，重新悬浮沉淀物，于65℃水浴30分钟。加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，10000rpm离心，取上清。加入0.6倍体积的预冷的异丙醇沉淀。12000rpm离心沉淀，70％乙醇洗一次，干燥后溶于50ul灭菌水中，-20℃保存。

2.ACA基因的PCR扩增

在20ul的PCR体系中，加入1ul约50ng苋菜总DNA，2ul 10x扩增缓冲液，2ul dNTP(每种NTP终浓度为10mmol/L)，2ul引物(终浓度为10pmol/ul)Taq Plus I(2.5Units)，加水至20ul。在反应混合物的液面上加适量矿物油以防止蒸发。

5’端引物序列：5’GGAAGATCTACCATGGCGGGATTACCAGTG 3’

3’端引物序列：5’AGCGTCGACTTAGTTGTTGGATCCCAATTC 3’

PCR反应条件为：94℃3分钟预变性，然后以94℃1分钟，49℃1分钟，72℃1分30秒反应，30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物在电泳分析中有两条DNA扩增带，分子量分别约为2.5kb和0.9kb。分别回收(用上海华顺DNA回收试剂盒回收)，溶于30ul灭菌水中。

3.ACA基因的克隆及序列分析

基因克隆和序列分析参照文献6。取回收的PCR产物10ul与1ul来自于pUC18的T载体在20ul的连接体系中连接，其中含2ul 10x连接缓冲液，10ul PCR回收产物，1ul载体，1ul T4连接酶，6ul灭菌水。连接体系在14℃-16℃反应12小时，取8ul转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，涂于含50mg/L Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。利用蓝白斑法筛选阳性克隆。对于阳性克隆用碱法提取质粒，进一步酶切鉴定后，用Pharmacia T7测序试剂盒测序。结果显示插入片段约2.6kb含ACA基因。质粒构建过程见图1，质粒命名为pACA。最后经ABI377测序仪完成全序列测定，序列结果见图2A-C。序列分析表明该基因共有2628bp，含1716bp内含子和两个分别为212bp和700bp的外显子。ACA核基因的结构见权利要求1和图3。

4.反向PCR获得编码区ACA基因序列

根据ACA基因的序列，设计两对引物分别与内含子相邻的外显子互补，其序列为：

5’端序列：5’GTGGTCTCCCAATCATTATTG 3’

3’端序列：5’CTAACCAAATATTTGTTAGTG 3’

反向PCR体系含有1ul dNTP(每种dNTP各为10mmol/L)，5’端引物和3’端引物各1ul(25pmol/ul)；碱法制备的pACA质粒稀释500倍，取1ul做PCR模板；10X PCR缓冲液2ul，pfu Taq酶0.4ul(5Unit/ul)，加水至20ul.PCR反应条件为：94℃3分钟预变性，94℃50秒，58℃50秒，72℃2.5分钟，30个循环，最后72℃10分钟。PCR产物电泳分析显示一条3.5kb的DNA片段，纯化PCR产物，T4 DNA多核苷酸激酶进行磷酸化，乙醇沉淀后溶于20ul灭菌水中。

5.ACA编码区序列的克隆及序列分析

取10ul上述纯化产物，加入2ul 10x连接酶缓冲液，1ul T4 DNA连接酶(1Unit/ul)，7ul灭菌水至总体积20ul。连接反应在14℃-16℃反应12小时，取8ul转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，涂于含50mg/LAmp的LB固体培养基上，挑取转化子，碱法制备质粒，NcoI和SalI酶切，产物约为900bp。ABI 377测序仪测序结果证明拼接正确，质粒命名为pACAc。在pACAc中ACA基因的序列见图2A-C(大写字母表示)。ACA基因编码的氨基酸序列与已发表的ACA序列的比较见图4。

6.含ACA基因编码区的植物表达载体和重组农杆菌的制备。

BglII和SalI双酶切质粒pACAc，回收ACA结构基因片段与BamHI酶切，SalI酶切的载体pBin438^[7]片段连接，即得重组质粒pBACAc，整个构建过程见图5。连接产物转化冻存感受态细胞DH5α后，涂于含50mg/L Kan(卡那霉素)的固体LB平板上。利用酶切和PCR方法鉴定重组质粒pBACAc。用碱法提纯的质粒pBACAc转化根癌土壤杆菌LBA4404感受态细胞，涂于50ug/ul Kan，50ug/ul Rif(利福平)，50ug/ulStr(链霉素)的YEP固体培养基上，挑取单菌落进行PCR检测及酶切分析后获得含pBACAc的农杆菌LBA4404转化子。

7.含ACA基因的植物表达载体构建。

外源基因为来自pACA的ACA基因片段，NcoI酶切质粒pACA，Klenow酶补平，SalI酶切，回收2.6kb的基因片段，与BamHI酶切，Klenow酶补平，SalI酶切的载体pBin438片段连接即得重组质粒pBACA，用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，利用酶切和PCR方法鉴定转化子中的重组质粒pBACA。根癌土壤杆菌制备方法同以上6中所述。除利用CaMV 35S启动子外，还可以利用组织特异性的启动子或其它类型的启动子与ACAc或ACA构建植物表达载体。pBACA的构建过程见图6。

8.含ACAc基因的大肠杆菌表达载体的构建和表达

NcoI，SalI酶切质粒pACAc，回收约0.9kb片段与同样双酶切的表达载体pET30a(+)连接。转化筛选重组质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，该重组质粒命名为pEACAc。按文献[8]提供的方法诱导表达。细菌接种于卡那霉素浓度为50ug/ul的LB培养基中于37℃，250rpm条件下培养。当细菌培养达到OD＝0.2时，加入IPTG，终浓度为1mmol/L，诱导表达3小时。诱导产物进行SDS-PAGE分析，蛋白分子量标准为BioLab公司的预染蛋白分子量标准。大肠表达产物的SDS-PAGE电泳^[9]结果显示在含有重组质粒pEACAc的大肠表达产物中有一条分子量为36KD的特异的蛋白(1泳道)，而对照菌中则无此蛋白(2泳道)。说明该蛋白在大肠杆菌中获得表达。表达蛋白经过扫描后计算约占总蛋白的35％。电泳结果如图7。

下面结合附图对本发明进一步详细描述。

图1：ACA基因重组质粒pACA构建模式图(Amp：氨苄青霉素抗性)

图2A-C：ACA基因全序列，小字母代表内含子的碱基序列

图3：ACA基因结构示意图，图上方的数字表示有关部分的大小(以bp表示)

图4：ACA基因推导的氨基酸序列和ACA蛋白测序所得氨基酸序列同源性比较(ACA.PRO：ACA蛋白质氨基酸序列；ACAc.PRO：本发明克隆的ACA基因推导的氨基酸序列；方框内氨基酸表示两序列中不同的氨基酸)

图5：ACA植物表达载体pBACA构建模式图(NPTII：新霉素磷酸转移酶基因：35S：带双增强子的CaMV35S启动子；NOS：胭脂碱合成酶基因转录终止子：LB：Ti质粒左边界序列；RB：Ti质粒右边界序列)

图6：ACA基因编码区植物表达载体pBACAc构建模式图(Kl：KlenowDNA聚合酶)

图7：ACA蛋白大肠杆菌表达产物SDS-PAGE电泳图(M：分子量标准；1：pEACAc/BL21(DE3)；2：对照pET30a/BL21(DE3)；箭头所指示的带为表达的目的蛋白ACA)

附注：

LB培养基：5g/NaCl；10g/Trypton；5g/Yeast extract；PH7.0；12g/L

琼脂；15磅灭菌30分钟

YEP培养基：5g/L NaCL；10g/L Trypton；10g/L Yeast Extract；PH7.0，

12g/L琼脂，15磅灭菌30分钟

主要参考文献：

1.Vietmeyer，N et al(1986).Sciences 232，1379-1384

2.Rahbe Y，Sauvion N，Febvay G et al 1995，Ento Exp App，76：143-155

3.Boland，C et al.(1991).Cancer Res.51，657-665

4.Anjana R et al.(1992).PNAS.Vol(89).11774-11778

5.Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF et al Plant Mol.Biol.Reporter，

(1993)11(2)：122-127

6.萨姆布吕克等，分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1993

7.李太元等，中国科学B辑，(1994)24：276-282

8.A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-Taged

  protein。Qiagene Company

9.Laemmli UK.1970.Nature 227：680-685

Claims (16)

1.一种苋菜凝集素ACA结构基因，其特征在于该基因含有一个内含子和两个外显子。具有如下式所示的2628bp的核苷酸序列。1ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACACTAACAAATATTTGGTTAGgtacgttttttttcgcgtttatacttcctccgtttcaatatagtcgcaatatatcgaaaataaacactattcacttatctcctttaatttgtgattgataagtaatttataagttaaaacatagtcaactgagatcttgtttgattcatctcgacgtaaagattattaatatcaaatttttataattttatattatacataattgtagttattaatgattgaattagtacattagactgcgtgaaaaaggcatatgttgtaagtattttggaacgaaggtagtgttatatttcttctgttagtctatttaaaatttgcgatatttaaattaaatatttaagatttttttgagttacatgtttcaaattctggagtgagtacgtactttaagtatacttttgtactagctaccatttgattgacataattaataaatgggaaattccacatggtagcatctagttttgatgaaatgccagtggtgacacttttttaagaaaattccacatgctagcattcagtttatacactatctaattgccgtagcattttccgttaagttcttgttaaattccactaaatttatcattttgtaagtttttttccacatggtagtatccagtttttgttaatttatcattttaactcttaattcaccattttaatgtttaattcactatttaattcattaacgctcataagtgttagatatttttattgaaaaattataagaaactatctaatcgggtcgaaacaagaacttattcgcctatttttcgatacgtaaaccggaaaagatatttggcgtcatttttacctatcataacgatttttttcaataaacggacgttgcaattacccttatgggataactctttcgaaaatccggtcgaaacaagtacttattcgcctattttccgatagatgtgttcaagaaaatgggacaactaaatagattcagagggagtatttcggagtaattatgttgacaaaattatacttgaactaatagctacggtgatgcttgttcaatttcactgattttgtacaatcataaagtttcttgatcacatttccaaaaaaatgaaagttaagtggcaaaaaatatgtgaatataaaatttgacaagtctaatttaaaattttcactaattttttttaataaaacgaaatacaacataatatatttttattgagatatattttgtgaaatttaatttaaatgtcaccactataaatttgtaatggtacatatagttgatttagttacatttattagaccttctagctgcataattaaaatcatactaaagctttttcctgagatagaatctaatgatatttctcatatgccggcatgcaaccaaataaagtgttactatataaattactaaagtagcgacattttttaatgttgcaaaaagaaaattttgtttagtgacggtcttatagtgtgactatctctattgggcagacatatgtacatttagtatgaaatgatcacttataattttaaagtaatacaattacagagtgacttgtttacaatgaatttgtgtttttgtccagcaagtcttttaatgagagacgtctcttagatctaatccattagagtttaattcttactcttattctatatttttctttatgggtcacccaattagagttggtatctcaaagagaccgtctctcacaagaatttgcgtttttgtcttagGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACT

                              2628GCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC

2.根据权利要求1所述的两个外显子外显子1和外显子2，分别具有如下式所示的212bp和700bp的核苷酸序列。

外显子1：1ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTAC

                  212ACTAACAAATATTTGGTTAG外显子21929GTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACTGCTATTTT

                      2628AGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC

3.根据权利要求2所述的两个外显子推测其编码的氨基酸序列如下：1M A G L P V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N I Q Q Y GL L Q F S A D K I L D P L A Q F E V E P S K T Y D G L V H IK S R Y T N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E P D E N KS N W A C T L F K P L Y V E E G N M K K V R L L H V Q L G HY T Q N Y T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G S K D V FH V I D W K S I F Q F P K R Y V T F K G N N G K Y L G V I TI N Q L P C L Q F G Y D N L N D P K V A H E M F V T S N G TI C I K S T Y M N K F W R L S T D D W I L V D G N D P R E TN E A A A L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T W F I K RF T S G K P G F I N C M N A A T Q N V D E T A I L E I I E L

  304G S N N

4.一种重组质粒，它是含有权利要求1所述的ACA基因序列的pACA质粒。

5.一种重组质粒，它是含有权利要求2所述的ACA基因仅含外显子序列的pACAc质粒。

6.一种重组微生物，它含有权利要求4，5所述的重组质粒pACA或pACAc。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，它是大肠杆菌Escherichia.coliDH5αCGMCCNo.0438。

8.一种重组质粒，它是由权利要求1或2所述的ACA基因序列与二元表达载体pBin438构建而成的植物表达载体。

9.根据权利要求8所述的植物表达载体，它们分别是如图5或图6所示的pBACA和pBACAc。

10.一种重组质粒，它是由权利要求2所述的ACA外显子序列ACAc与大肠杆菌表达载体pET30a(+)构建而成。

11.一种按权利要求10所述的重组质粒是pEACAc。

12.一种重组微生物，含有pBACA重组质粒或pBACAc重组质粒。

13.一种重组微生物，含有pEACA重组质粒。

14.根据权利要求12所述的重组微生物是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacieus)LBA4404或大肠杆菌Escherichia.coliDH5α。

15.由权利要求9所述的植物表达载体pBACA或pBACAc在转化植物获得转基因植物中的应用。

16.由含ACA编码区序列的大肠杆菌表达载体pEACAc在细菌中表达产生的ACA凝集素蛋白质中的应用。

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