CN1200104C - 植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1。它是从水稻中分离的一种新基因OsPTF1，由1862位碱基组成，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿诱导增强表达的bHLH类转录因子。数据显示该基因在水稻叶片中为组成型表达，在根部为磷饥饿诱导表达。OsPTF1参与植物磷的利用过程。过表达所述基因的转基因植株耐磷饥饿能力要高于野生型植株。故利用本发明提供的基因和技术方法可以提高植物或其细胞的耐磷饥饿能力。

Description

植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1

                           技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1。本发明涉及水稻OsPTF1的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于bHLH家族类转录因子。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，及这些多聚核苷酸和多肽的应用。

                           背景技术

磷作为植物营养的必需元素，在其生长发育过程中起着重要的功能。磷既是植物体内许多重要有机化合物的组成成分，在结构和生理上起着重要作用，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理代谢过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢，以及作物的早熟、高产、优质都起着重要的作用。但土壤缺磷是农业生产中普遍存在的限制因素。全世界130亿公顷的土壤中，有18％是酸性土壤，25％是碱性的石灰性土壤。这两种土壤对磷都有固定作用，都属于缺磷性土壤。这种缺磷的现状通常只能通过施用磷肥来解决。但由于磷肥施入土壤后很快就被碱性土壤中的钙盐和酸性土壤中的铁和铝的氢氧化物所固定或被土壤胶体吸附，从而转化为不能为植物所吸收利用的固定态。再加之磷主要通过扩散作用到达根表，而磷的扩散系数又很低，所以施用磷肥的效率一般不超过10％。

长期生长在低磷胁迫的环境条件下，高等植物会形成一些耐低磷胁迫的适应性形态及生理生化机制等自我拯救系统，以提高植物在缺磷条件下对磷素的吸收和利用。另外，人们通过对植物耐低磷胁迫能力的基因型差异比较研究发现，植物无论在种间、亚种间还是品系间都存在显著的基因型差异，主要表现在植物对磷的吸收能力、利用效率及对磷的依赖程度等方面。这种植物耐低磷胁迫能力的基因型差异是我们对植物进行遗传基因改良的前提。通过获得参与或调控磷吸收能力、利用效率的基因，进行改造利用，对于提高植物耐低磷能力都有很高的价值。

                           发明内容

本发明目的之一是提供一种分离出的DNA分子，它编码一个bHLH类转录因子。

本发明的目的之二是提供一种分离出的蛋白质，该蛋白属于bHLH类转录因子。

本发明的目的之三是提供一种利用分离出的DNA分子或蛋白对植物或细胞进行改造，从而提高植物或细胞对磷饥饿耐受能力的方法。

本发明还提供了这种分离出的DNA及蛋白的应用。

本发明第一方面是提供一种分离出的DNA分子，它具有SEQ ID NO：1的1862位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿诱导增强表达的bHLH类转录因子。

本发明第二方面是提供一种分离出的蛋白质及其等价蛋白，它具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

本发明第三方面是提供一种分离出的DNA分子，编码权利要求2的蛋白质的核酸。

本发明还提供了利用权利要求2和3的蛋白质和核酸获得耐磷饥饿的转基因植物或细胞的方法。

本发明的优点在于，利用本发明提供的基因和技术方法可以提高植物或其细胞的耐磷饥饿能力。例如，利用过表达转基因技术将该基因转化作物如水稻、小麦等，通过提高其耐磷饥饿能力，可达到在不影响产量的前提情况下减少磷肥的施加，从而降低粮食生产成本。

                           附图说明

图1是OsPTF1基因的半定量RT-PCR图；

图2是OsPTF1的DNA结合分析图；

图3是OsPTF1-GFP洋葱表皮细胞瞬时表达核定位分析图；

图4是OsPTF1的转录激活分析图；

图5是增强表达OsPTF1转基因拟南芥及野生型拟南芥在缺磷情况下的表型图。

                         具体实施方式

本发明阐述了一种新的水稻转录因子OsPTF1，它属于basicHelix-Loop-Helix(bHLH)家族成员，该家族都含有bHLH这个结构域，具有该结构域的蛋白主要通过形成二聚体或异源二聚体与DNA序列结合从而调控基因的表达。此基因最初通过构建水稻耐低磷品种Kasalath磷饥饿下的抑制性扣除杂交文库筛选得到的。半定量RT-PCR分析显示OsPTF1在水稻根系为磷饥饿诱导增强表达，而在叶片中为组成型表达。

OsPTF1的bHLH结构域位于蛋白序列中部。通过重组OsPTF1-6His蛋白的体外DNA结合实验研究，表明该蛋白可特异性的结合E-box序列(CANNTG)。酵母双杂交分析显示该蛋白的氨基端与GAL4 DNA结合结构域融合能激活转录，表明该蛋白的氨基端具有转录激活功能。利用洋葱表皮细胞的瞬时表达分析发现，35S启动子驱动表达的OsPTF1∷smGFP4融合蛋白进入细胞核内，表明该蛋白为核定位蛋白。这些数据表明OsPTF1为一水稻根系磷饥饿诱导表达的转录因子。

在构建了水稻品种Kasalath磷饥饿4天的抑制性差异扣除杂交cDNA文库后，通过利用扣除探针进行筛选，获得一个在水稻根系磷饥饿诱导增强表达的克隆，根据该克隆的序列设计引物进行快速扩增cDNA末端(RACE)，获得该克隆的全长cDNA(SEQ ID No：1)，我们命名为OsPTF1，该cDNA编码478个氨基酸(SEQID No：2)。与GeneBank相对照探查此推定的蛋白质序列。BLAST探查表明OsPTF1是一种新的蛋白质。此蛋白质的中部靠近-COOH末端发现含有bHLH结构域。由OsPTF1编码的蛋白质的剩余部分与任何已知序列无高度同源。OsPTF1的基因组结构通过对比基因组序列与cDNA序列而分析。OsPTF1基因位于水稻染色体6上，它有8个外显子。进行结构域探查而鉴别了OsPTF1的bHLH结构域内推定的二分核定位信号，此信号序列位于313-327位氨基酸之间。

为研究OsPTF1基因在植物磷饥饿胁迫下的作用，设计了一对特异性扩增该基因cDNA序列的引物进行半定量RT-PCR分析。结果发现，该基因在根中为磷饥饿诱导增强表达，而在叶中为组成型表达(图1)。

如果bHLH类蛋白作为一类转录因子起作用，通常具有与E-box序列(CANNTG)的结合特性。为测试OsPTF1蛋白是否能特异性结合E-box序列，首先将寡聚的E-box双链用³²P末端标记作为探针。同时将OsPTF1克隆入6×His融合载体pET-29b中并转化入大肠杆菌中。纯化重组6×His∷OsPTF1融合蛋白进行分析以测试与DNA的特异结合，如图2所示。OsPTF1蛋白能与E-box序列特异性结合，且该蛋白能特异性的结合CATGTG的E-box序列。

由于结构域分析发现OsPTF1具有一个二分核定位信号，表明OsPTF1可能为核定位蛋白。故将OsPTF1按通读框架构建到smGFP4表达载体内，使之能表达一个OsPTF1∷smGFP4融合蛋白。提取该融合表达载体质粒及未改造的smGFP4质粒，用金粉分别包裹，进行基因枪轰击洋葱表皮细胞实验。轰击后于暗环境下培养1天后，用激光共聚焦显微镜观察。结果发现，smGFP蛋白表达后较均匀的分布于整个洋葱表皮细胞内，而OsPTF1∷smGFP4融合蛋白则特异性的分布于核内(图3)。

为了检测的OsPTF1激活结构域，我们采用了CLONTECH公司的Matchmaker酵母双杂交系统3。通过将OsPTF1构建到含有GAL4 DNA结合结构域的载体pGBKT7中，同时，依据bHLH结构域所在位置将其分为P1、P2和P3三段后分别构建到pGBKT7中，把这四个载体转化到酵母AH109菌株内，每种转化子都分别在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His的营养缺陷型培养基上生长。结果发现，转化有全长的OsPTF1及P1段载体的酵母菌株能在SD/-Trp/-Ade/-His的营养缺陷型培养基上生长，表明OsPTF1的激活结构域位于N-基端(图3)。

将由35S启动子驱动的完整OsPTF1的编码cDNA(SEQ ID NO：1)克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1301中。通过真空浸泡方法转化入Arabidopsisthaliana columbia生态型中。过表达转基因品系选自含有潮霉素的培养基。挑选两个纯合的转基因品系及未转基因的野生型进行磷饥饿实验。种子春化后种在1/10 MS培养基(1mM P)上，正常培养15天后移栽到无磷的1/2MS培养基上。缺磷培养5天后，野生型便出现了缺磷的典型症状，叶片花色素苷沉积，而转基因株系无此现象。继续处理25天后，转基因株系都开花结实了，而野生型已死亡。这表明过表达OsPTF1的转基因品种比野生型具有更高的耐低磷胁迫能力。另外，将野生型和转基因植株用MS液体培养基进行液体培养，正常培养7天后，移入无磷的MS液体培养基中继续培养5天后，野生型的植株要明显小于转基因植株(图5)。

由这些结果表明，我们克隆的水稻OsPTF1基因具有很高的应用价值。我们可以通过利用该基因对不耐低磷的作物品种进行转基因改造，如通过外源导入过表达OsPTF1基因来提高作物耐低磷胁迫能力，从而减少对农作物磷肥的施加量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1，水稻抑制性扣除杂交文库的构建

水稻Kasalath品种于37℃浸种催芽后播种到黄沙钵中，7天后移栽到溶液培养(溶液培养配方为国际水稻所标准配方)。等苗培养到三叶期后开始分组处理，一组正常培养，一组磷饥饿培养。培养4天后取材，分别取根系材料用Gibco公司的Trizol提取总RNA。用Qiagen公司的Oligotex mRNA Mini Kit提取250g总RNA中的mRNA，两份材料的mRNA各取1g用于cDNA合成，cDNA合成采用Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit。取正常培养根组织的cDNA作为Driver，饥饿处理材料的cDNA作为Tester。采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit进行扣除杂交，最终产物用该公司的PCRCloning Kit进行克隆，并转化TOP 10F’大肠杆菌菌株。挑选转化子培养保菌。

实施例2，水稻OsPTF1的cDNA序列的克隆和测定

用构建抑制性扣除杂交文库的cDNA材料，采用PCR-Select DifferentialScreening试剂盒筛选抑制性扣除杂交文库，获得OsPTF1基因片段克隆。对该克隆测序，并设计引物用于快速扩增cDNA末端(RACE)。引物1：ATTTCACAAGGGCCAACAGACAT，用于3‘端RACE扩增，引物2：CCCCCATATTTTTCCGATTTC，用于5‘端RACE扩增。RACE扩增采用Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit。PCR产物采用Clontech公司的PCRCloning Kit克隆于pT-Adv载体，转化后提取质粒进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1862bp。详细序列见SEQ ID No.1，其中开放阅读框位于67-1503位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出OsPTF1的氨基酸序列，共478个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。

实施例3，OsPTF1的半定量RT-PCR

正常培养到三叶期的水稻Kasalath品种开始磷饥饿胁迫，处理方式与构建抑制性扣除杂交文库过程一致。胁迫4天后，分别取正常苗的根、叶及饥饿处理的苗的根、叶材料。用Gibco公司的Trizol试剂分别提取总RNA。4份材料各取5g总RNA用于逆转录。逆转录过程如下：在1.5μl的离心管中加入5μg的RNA，1μl Oilgo(dT)₁₅(Promega公司)，加无RNA酶水至8μl，在70℃水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，稍离心后加入4μl 5×First Strand Buffer(Invitrogen公司)、2μl 0.1DTT(Invitrogen公司)、4μl 2.5mMdNTPs(Takara公司)、1μl Rasin(40unit/l)(Promega公司)及1μl SuperScript RT II(Invitrogen公司)，用枪混匀，42℃空气浴1小时，70℃15分钟，终止反应。逆转录产物用于PCR扩增。分别采用OsPTF1的特异性引物(引物3：TAGCGTGCTATCATGGACTAC，引物4：TTTCTGCAGCCGTTGAGTT)，及肌动蛋白的特异性引物(引物5：GGAACTGGTATGGTCAAGGC，引物6：AGTCTCATGGATACCCGCAG)。扩增体系为：在50l的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200mol/L dNTP，10pmol引物，0.5U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司)。扩增条件为：OsPTF1 94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃90秒作33个循环；肌动蛋白94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃90秒作28个循环。等量的PCR产物电泳检测。

实施例4，OsPTF1原核蛋白表达及其DNA结合实验

利用引物7：GCTGAATTCGATGGACTACTCCGCTGGTTCCT、引物8：TGTGTCGACTTTTTCAGGAGGGATTGCAGCAG扩增含OsPTF1编码框架的cDNA，用EcoRI/SalI双酶切PCR产物，并将其克隆到EcoRI/SalI双酶切过的pET-29b载体(Promega公司)。将质粒转化入大肠杆菌BL21中。转化体生长至OD600为0.6-0.9，然后通过加入IPTG至1mM进行诱导，并在30℃表达融合蛋白5小时。收获菌体后，用Qiagen公司的Ni-NTA agrose纯化重组蛋白，按其试剂说明书中重组蛋白的活性分离方法。分离的重组蛋白用于DNA结合实验。取1g的重组蛋白与10ng³²P标记的寡聚核苷酸于15.0mM Tris，pH8.0，65.0mM NaCl，7.5％甘油，1.25mM DTT，1.8mM EDTA及100ng PolyIPolyC的溶液中室温温浴30分钟，上样于4％的聚丙烯酰氨凝胶中，于4℃按15伏/厘米的电压电泳2小时。电泳完取出凝胶干胶后压X-光片，结果如图2所示。泳道1，³²P标记的寡核苷酸双链(ATATNNNNCANNTGNNNNATAT)；泳道2，³²P标记的寡核苷酸双链(ATATNNNNCANNTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白；泳道3，³²P标记的寡核苷酸双链(ATATNNNNCAATTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白；泳道4，³²P标记的寡核苷酸双链(ATATNNNNCATGTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白。

实施例5，OsPTF1的自激活结构域分析

采用Clontech公司的MATCHMAKER Library Construction & Screening Kit进行OsPTF1的自激活结构域分析。依据OsPTF1的bHLH结构域所在位置将其编码区分为三段如图3A。P1段是将实施例4中构建好的原核表达载体用NcoI/PstI切出的片段构建到相应酶切过的PGBKT7(BD)载体中，而P2、P3是以引物9(GCTGAA TCC GCC ACC ACT TCC TTC AAA GAT)和引物10(TGT GTC GAC TCA AAC CGAGTG CCA TAG TAA)、引物11(GCT GAA TCC CCT GGA GCA GTT CTT CCC CTT)和引物12(TGT GTC GAC TTT GAC GAG GGA TTA CAG CAG)分别做PCR，PCR产物和PGBKT7(BD)载体分别用EcoRI/SalI进行双酶切，分别将酶切后的P2、P3和PGBKT7载体连接，转化。把这三个构建好的载体转化到酵母菌株AH109内，每种转化子都分别在色氨酸营养缺陷型(SD/-Trp)和色氨酸、组氨酸、腺嘌呤营养缺陷型(SD/-Trp/-Ade/-His)培养基上生长(如图3)。结果含P1-BD的转化子能在SD/-Trp/-Ade/-His培养基上生长，而含P2-BD、P3-BD的转化子不能在SD/-Trp/-Ade/-His培养基生长。这说明P1-BD有自激活能力，而P2-BD、P3-BD没有，所以OsPTF1的激活域位于P1段即氨基端。

实施例6，OsPTF1的核定位实验

包含有OsPTF1全长编码框架的cDNA按阅读框架克隆到smGFP4质粒载体的启始密码子ATG前，提取构建好的质粒及smGFP4质粒各2g用金粉包裹，用Bio-rad公司的PDS-1000/He型基因枪进行轰击，采用1100psi的氦压轰击洋葱表皮。轰击后于暗培养1天后，用激光共聚焦显微镜观察，结果如图4。图4A为smGFP4质粒轰击结果，4B为OsPTF1-smGFP4质粒结果。

实施例7，转化载体的构建及植物转化

构建好CaMV 35S启动子(一类强表达的组成型启动子)驱动的OsPTF1元件后再加上NOS终止子，将其亚克隆入pCAMBIA1301中。构建好的质粒电转化到农杆菌EHA105中。再采用真空浸润转化法对拟南芥进行转基因(Bechtold等，1993，CR Acad Sci 316：1194)。

实施例8，植物培养条件和方法

拟南芥种子用双蒸水浸泡30分钟后用95％乙醇浸泡5分钟，再用20％次氯酸钠漂白7分钟，最后用双蒸水洗涤5次。种子于4℃春化处理48小时。处理好的种子于1/10 MS(1mM P)上培养15天后移栽到无磷的1/2MS培养基上，并进行观察。发现转基因植株出现磷饥饿症状要迟于野生型，缺磷培养5天后，野生型便出现了缺磷的典型症状，叶片花色素苷沉积，而转基因株系无此现象。继续处理25天后，尽管转基因植株也出现了花色素苷沉积，但转基因株系都能正常开花结实了，而野生型已死亡；另处理好的种子各取30棵用MS液体培养基培养，于25℃100rpm光照培养7天后，再转到无磷的液体培养基上生长5天。图5为此时植物生长情况图，A为正常培养时的情况，野生型(左)和转基因(右)植株生长基本一致。B为饥饿培养5天后情况，饥饿培养下的植株都要小于正常培养的植株但转基因植株(右)比野生型植株(左)明显生长得大。

                              序列表

<110>浙江大学

<120>植物磷饥饿诱导转录因子OsPTF1

<130>

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>Length：1862

     SequenceName：OsPTF1

<212>Type：DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<221>CDS

<222>LocationFrom：67

<222>LocationTo：1503

<400>1

acactttctg tttctagagg ccattctctg taacactttg gagcatcaat tttgtagcgt      60

gctatcatgg actactctgc tggttcctac atgtggcctg gcaattcagg ttctgagaac     120

tataattttg ttgacggttc gtcggaatca tatgcagaag aaggaagcct accaccttca     180

ggctatttca tgggagctgg atcagatcgc agtttaaaga tcacggagaa tgaaaggaac     240

cccactatgc ttgcaaatgg atgcttgcca tacaacaccc aggctcatcc attatctggc     300

cagattctac ctaagggtga gctccctaac aatcttctgg atcttcaaca gctacagaac     360

agcagcaatc tgcgaagcaa ttcaattccc ccaggggttc ttcagtgcaa ttcaacatct     420

ggaacatttg atgcgaaatt ggatacacct ggtcttgcag aactgcctca tgctttgtcc     480

agttcaattg atagcaatgg tagtgacatt tctgcttttc ttgctgatgt gcatgccgtt     540

tcttcagccc cgacgttgtg ttcagcattc caaaacgttt cctccttcat ggaaccagta     600

aatctagatg ctttcggttt ccaaggggca caaaatgttg ctatgttgaa caaaacaagt     660

cttccaaatg ggaatccctc gctgtttgat aatgctgcca tagcatcact acatgatagc     720

aaagagtttc tcaatggtgg ttccatccct tcgtttggta ctgtcctgca ggcactagga     780

gcgggtggtt tgaaggctgc tcaacaggag caaaatatcc ggaatatacc tctccctaca     840

ttcacatctg gtagtcattt ggcagttact gatgcacaag ggccaccact tccttcaaag     900

ataccaccat tgatccatga ccataatagt gagtacccta ttaaccattc ttctgatgtg     960

gaaccccaag caaattcagc tcctggaaat agtgccaatg cgaagccacg tacaagggct    1020

cgccgtggac aggcaactga tcctcacagt attgctgaac ggcttcgccg agagaaaatt    1080

tcagaaagga tgaaaaatct ccaagtcctt gtcccaaact ccaataaggc agataaggca    1140

tcaatgcttg atgaaataat tgattatgtg aaatttcttc agcttcaggt caaggtattg    1200

agcatgagca ggctaggagc tcctggagca gttcttcccc ttcttaggga atctcaaacc    1260

gagtgccata gtaatccatc tctatcagct tcaaccattt cacaagggcc aacagacatg    1320

ccagactcag aagacagctc tgcctttgag caagaggtag tgaagctgat ggaaacgagc    1380

atcatcagcg cgatgcagta tcttcagaac aagggtctct gcctgatgcc cattgctctc    1440

gcttcggcca tatccaacca gaaaggcatg gctgctgctg ctgcaatccc tcctgaaaaa    1500

tgaaaaaaaa aatgaaatcg gaaaaatatg gggggaacaa ctgcagaaga cataataact    1560

caacggctgc agaaatgtgc tggacactgc aggttttgtg aatgaagtga aatccaatcc    1620

agggggtcat aaaacatagg aagttatctg actaattcag gcttatgaca caatctactc    1680

tatagtctat agctattgtg tgcctgttgc acatcagttg atgtgtattc ttttgttttt    1740

tttgtattgc atccggatgc taattaggta gtagtgtttc ctttgatgta catgagtatt    1800

atctatgcgg ttttatctaa tgtgcatata aagtaaaatc tggtaaaaaa aaaaaaaaaa    1860

aa                                                                   1862

<210>2

<211>478

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

MDYSAGSYMW PGNSGSENYN FVDGSSESYA EEGSLPPSGY FMGAGSDRSL KITENERNPT      60

MLANGCLPYN TQAHPLSGQI LPKGELPNNL LDLQQLQNSS NLRSNSIPPG VLQCNSTSGT     120

FDAKLDTPGL AELPHALSSS IDSNGSDISA FLADVHAVSS APTLCSAFQN VSSFMEPVNL     180

DAFGFQGAQN VAMLNKTSLP NGNPSLFDNA AIASLHDSKE FLNGGSIPSF GTVLQALGAG     240

GLKAAQQEQN IRNIPLPTFT SGSHLAVTDA QGPPLPSKIP PLIHDHNSEY PINHSSDVEP     300

QANSAPGNSA NAKPRTRARR GQATDPHSIA ERLRREKISE RMKNLQVLVP NSNKADKASM     360

LDEIIDYVKF LQLQVKVLSM SRLGAPGAVL PLLRESQTEC HSNPSLSAST ISQGPTDMPD     420

SEDSSAFEQE VVKLMETSII SAMQYLQNKG LCLMPIALAS AISNQKGMAA AAAIPPEK       478

Claims (4)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，具有SEQ ID NO：1的共1862位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿诱导增强表达的bHLH类转录因子。

2.一种分离出的水稻bHLH类蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种分离出的DNA分子，其特征在于编码权利要求2的蛋白质的核酸。

4.一种培养植物的方法，其特征在于包括用权利要求3的核酸转化所述植物，并培养所述植物，其中所述植物耐受磷饥饿能力要强于野生型植物，所述植物选自水稻、小麦或拟南芥。

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