CN100349916C

CN100349916C - 一种大豆phd转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100349916C
Application number: CNB2005101237570A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 黄剑; 何锶洁; 杜保兴; 刘学义
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2005-11-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2007-11-21
Anticipated expiration: 2025-11-22
Also published as: CN1789280A

Abstract

本发明公开了一种大豆PHD转录因子及其编码基因与应用。该大豆PHD转录因子，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有PHD转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。该大豆PHD转录因子及其编码基因可用于培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐大豆。

Description

一种大豆PHD转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的与耐逆性相关的PHD转录因子及其编码基因与应用，特别涉及来源于大豆的与耐逆性相关的PHD转录因子及其编码基因与其在培育耐逆植物品种中的应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)类转录因子广泛存在于动植物以及细菌、病毒蛋白中，比如哺乳动物的CBP类蛋白，人的ING1家族，酵母Yng2p蛋白，病毒MIR1蛋白。PHD类蛋白结构域是C4HC3类的锌指结构，其功能主要为以下几类：(1)作为乙酰化或去乙酰化酶参与染色质相关的转录调控；(2)作为E3泛素连接酶参与蛋白降解；(3)作为PIPs受体感知PIPs信号参与染色质相关的转录调控。在拟南芥中首次发现了PHD类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。

大豆是我国五大作物之一，弄清其耐非生物胁迫分子机理，进而为提高其耐逆性提供基础，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种大豆PHD转录因子及其编码基因与应用。

本发明所提供的大豆PHD转录因子，名称为GmPHD2，来源于大豆属大豆(Glycinemax(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由252个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第199位-252位氨基酸残基序列为PDH类转录因子的PDH保守结构域。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述大豆PHD类转录因子的编码基因(GmPHD2)也属于本发明的保护范围。

上述大豆PHD类转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：2由759个脱氧核苷酸组成，本序列为GmPHD2基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第595到第756位碱基为GmPHD2中保守的PHD结构域的编码序列。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增GmPDH2一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的GmPDH2的编码基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

使用GmPDH2构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmPDH2的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等双子叶植物。

GmPHD2的表达不受高盐和干旱的诱导，但是受脱落酸ABA的诱导。已知ABA与植物非生物胁迫应答相关，因此GmPHD2可能与植物对非生物逆境应答的调控有关。导入GmPHD2的拟南芥与未转基因拟南芥相比，其耐盐性显著提高，说明尽管GmPHD2基因的表达不受高盐、干旱诱导，但是其参与植物对非生物胁迫应答的调控。

本发明的GmPDH2对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐大豆，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义，并且从分子生物学角度证明了PDH家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmPDH2在非生物逆境胁迫下的表达特性图

图2为含有GmPDH2的植物表达载体的部分结构示意图

图3A为转GmPDH2拟南芥株系G2-3、G2-6、G2-8与野生型植株在盐胁迫下和正常生长条件下的生长比较图

图3B为转基因植株TG-1，TG-2，TG-3和野生型植株在正常条件下的生长情况照片

图3C为转基因植株TG-1，TG-2，TG-3和野生型植株用150mM NaCl处理14天后再回复14天后的生长情况照片

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、大豆GmPDH2及其编码基因的筛选及其cDNA的克隆

以大豆抗旱品种晋豆23和旱敏感品种灰布织(购自山西省农业科学院)为材料，通过cDNA-AFLP的方法筛选得到60余个差异表达基因，其中有一个296bp片段，该片段经BLAST大豆EST数据库表明其为包含PHD结构域的锌指蛋白，在比对中发现在多个物种的旱、盐cDNA库中有该基因的同源序列。经在大豆EST数据库中比对得到6个该家族成员，分别命名为GmPHD1-6。经过EST延伸拼接获得4个GmPHD基因的全长序列，其中GmPHD2具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由252个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第199位-252位氨基酸残基序列为PDH类转录因子的PDH结构域，PDH结构域和自氨基端的第1至114位氨基酸残基非常保守，而中间部分的序列变异较大。

根据GmPHD2基因序列设计引物：GmPHD2 ORF sense：5‘-ATGGACGGTGGTGGAGTGA-3’，GmPHD2 ORF antisense：5‘-TCAAGGCCGTGCTCTCTTAT-3’应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmPHD2基因。取晋豆23叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μlPCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl，液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30-32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，然后克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGmPHD2。

实施例2、GmPHD2基因在非生物胁迫下的表达特征

对大豆抗旱品种晋豆23进行干旱、NaCl、ABA、冷害处理用于分析大豆GmPHD2在非生物胁迫下的表达情况。将晋豆23的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理：

干旱处理：将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

盐处理：将大豆幼苗的根系置于150mM NaCl溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

ABA处理：大豆幼苗的根系置于20μM ABA中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

低温处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

总RNA的提取同实施例一。分别以用上述方法处理的不同大豆样品以及没有经过胁迫处理的大豆样品(对照)的RNA为模板，以³²P-CTP标记的GmPHD2 cDNA为探针，按常规方法进行Northern分析，结果如图1所示，GmPHD2基因的表达不受高盐、干旱诱导，ABA处理下GmPHD2的表达在12小时时有升高。低温处理时GmPHD2的表达呈降低趋势，表明GmPHD2的表达虽然不受高盐及渗透胁迫诱导，受低温(4℃)抑制，但是受与植物非生物胁迫信号传导密切相关的植物激素ABA诱导，因此GmPHD2可能参与植物对非生物胁迫的应答反应。

实施例3、GmPHD2编码蛋白的功能鉴定

将GmPHD2正向插入pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰等，高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282)植物表达载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，构建得到含有GmPHD2的植物表达载体如图2所示，命名为pBGmPHD2。pBGmPHD2通过根癌农杆菌GV3101的介导转化拟南芥，PCR检测结果表明获得11个转化植株，Northern分析表明其中至少3株中GmPHD2的表达量很高，将表达量高的三株分别命名为G1-3、G1-6、G1-8。将G1-3、G1-6、G1-8的种子种入MS培养基，将得到的幼苗分别命名为G2-3、G2-6、G2-8，5天后和未转基因拟南芥(WT)幼苗分别移栽到含50mM、100mM、150mM和200mM NaCl的1/2MS培养基中培养14天，结果如图3A所示，表明在100mM NaCl和150mM NaCl中，对照叶片明显卷曲，而转基因植株G2-3、G2-6、G2-8变化不明显，但在200mM NaCl中，对照和转基因植株均明显枯萎。

将转基因植株G2-3、G2-6、G2-8的种子和未转基因拟南芥的种子(对照)种入MS培养基中，在相同条件下培养14天后，用150mMNaCl处理14天后，再置于正常条件下生长14天。在正常条件(无胁迫)下，转基因植株和野生型植株均可正常生长，表型无显著差异，如图3B。而150mM NaCl处理14天后，对照不能恢复生长，而转pBGmPHD2拟南芥TG-1，TG-2，TG-3可以恢复生长。可见在高盐环境下，转pBGmPHD2拟南芥植株的长势明显优于野生型植株，并且经盐胁迫后也比野生型拟南芥更易恢复生长(图3C)，说明GmPHD2与耐盐性相关，可提高植物的耐盐性。图3A、3B和3C中TG-1，TG-2，TG-3为由G2-3，G2-6，G2-8的种子长成的植株，对照为未转基因拟南芥。

序列表

<160>2

<210>1

<211>759

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

atggacggtg gtggagtgaa ctacaaccct cgcaccgtgg aacaggtttt ccgggacttc 60

aagggccgta gagctggcat gatcaaggct ctcaccactg atgttgaaga atttttccag 120

cagtgcgatc ctgaaaagga taatctttgt ctgtacggat tccctaatga gcaatgggaa 180

gttaatttac ctgcggaaga agttcctccg gagcttcctg agcctgcatt gggcataaac 240

tttgctaggg atgggatgca agacaaggac tggctgtctt tggttgccgt tcacagcgat 300

gcatggttac ttgcagtggc tttctacttt ggggcacgat ttggttttga taatgctgac 360

aggaaacgcc tgttctctat gattaatgat ttaccaacaa tatttgagat tgtgactgga 420

agcgcaaaaa aacagacgaa ggaaaaatca tccatttcaa accacagcag taacaaatca 480

aaatctggtt caaaagggcg aggatctgaa tcagggaagt attcaaagga aacaaaggac 540

gaggaggaag aggtactgga tgaagaagat gacgaggagc atgaggagac cttgtgtggg 600

gcatgtgggg agcactatgc atccgatgag ttctggattt gttgcgacat atgtgagaag 660

tggttccatg gcaagtgtgt gaagatcact ccagccaggg ccgaacacat caagcagtat 720

aagtgcccct catgcagcaa taagagagca cggccttga 759

<210>2

<211>252

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2

Met Asp Gly Gly Gly Val Asn Tyr Asn Pro Arg Thr Val Glu Gln Val

1 5 10 15

Phe Arg Asp Phe Lys Gly Arg Arg Ala Gly Met Ile Lys Ala Leu Thr

20 25 30

Thr Asp Val Glu Glu Phe Phe Gln Gln Cys Asp Pro Glu Lys Asp Asn

35 40 45

Leu Cys Leu Tyr Gly Phe Pro Asn Glu Gln Trp Glu Val Asn Leu Pro

50 55 60

Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile Asn

65 70 75 80

Phe Ala Arg Asp Gly Met Gln Asp Lys Asp Trp Leu Ser Leu Val Ala

85 90 95

Val His Ser Asp Ala Trp Leu Leu Ala Val Ala Phe Tyr Phe Gly Ala

100 105 110

Arg Phe Gly Phe Asp Asn Ala Asp Arg Lys Arg Leu Phe Ser Met Ile

115 120 125

Asn Asp Leu Pro Thr Ile Phe Glu Ile Val Thr Gly Ser Ala Lys Lys

130 135 140

Gln Thr Lys Glu Lys Ser Ser Ile Ser Asn His Ser Ser Asn Lys Ser

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ser Lys Gly Arg Gly Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Ser Lys

165 170 175

Glu Thr Lys Asp Glu Glu Glu Glu Val Leu Asp Glu Glu Asp Asp Glu

180 185 190

Glu His Glu Glu Thr Leu Cys Gly Ala Cys Gly Glu His Tyr Ala Ser

195 200 205

Asp Glu Phe Trp Ile Cys Cys Asp Ile Cys Glu Lys Trp Phe His Gly

210 215 220

Lys Cys Val Lys Ile Thr Pro Ala Arg Ala Glu His Ile Lys Gln Tyr

225 230 235 240

Lys Cys Pro Ser Cys Ser Asn Lys Arg Ala Arg Pro

245 250

Claims

1、一种大豆PHD转录因子，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有PHD转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID №：2所示。

3、权利要求1或2所述的大豆PHD转录因子的编码基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述大豆PHD转录因子的cDNA基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1所示的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。

5、含有权利要求3或4所述基因的表达载体。

6、含有权利要求3或4所述基因的细胞系。

7、含有权利要求3或4所述基因的宿主菌。

8、权利要求1或2所述的大豆PHD转录因子及其编码基因在培育耐盐性植物中的应用。