CN112694524B

CN112694524B - 一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23、其基因、表达载体、转化体与应用

Info

Publication number: CN112694524B
Application number: CN202110150086.6A
Authority: CN
Inventors: 何艳军; 范敏; 姚依秀; 李玉林; 张慧青
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112694524A

Abstract

本发明“一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23、其基因、表达载体、转化体与应用”属于植物基因工程领域。所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23可有效调控植物对枯萎病的抗性，使发病时间推迟，发病程度减轻。

Description

一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23、其基因、表达载体、转化体与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23、其基因、表达载体、转化体与应用。

背景技术

西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai]属葫芦科西瓜属中一年生蔓本植物，原产于非洲，是一种重要的经济作物，在世界范围内被广泛的种植和食用，但是它极易受到各种生物和非生物胁迫的伤害，导致其品质和产量大大降低，大大提高了西瓜的种植成本，严重制约了西瓜的生产供应。

其中，枯萎病病菌属半知菌亚门，镰孢属，尖镰孢菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)synder et Hansen)。在镰孢菌(Fusarium oxysporum)中有许多专化型，能引起葫芦科作物枯萎的专化型有5种。西瓜专化型对西瓜感病品种高度感病，而对其它葫芦科作物不感病，或轻度感病。西瓜枯萎病又称为西瓜萎蔫病或蔓割病，由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxyporumf.sp.niveum)侵染所致，该菌存在3个生理小种0、1、2。中国以生理小种1引发的枯萎病占主导地位。是目前西瓜生产上危害最严重的一种病害。发病时，叶片萎蔫并逐渐干枯，根部腐烂，直至植株枯死。近些年来，西瓜枯萎病害频频发生,并有蔓延趋势，严重影响了西瓜产量和品质，使农民遭受巨大经济损失。因该病为土传真菌病害，药剂防治困难，所以选育抗病品种被认为是最经济、最有效的措施。

目前枯萎病的研究主要集中在抗病相关基因的定位、抗病基因克隆等方面。但是关于西瓜枯萎病抗病基因的鉴定及其调控机制研究还没有报道。

PHD蛋白是一类真核生物中较为常见的具有一个或几个PHD结构域的锌指蛋白。PHD结构域由约60个氨基酸组成，具有Cys4-His-Cys3锌结合基序特征，半胱氨酸残基之间以及半胱氨酸与组氨酸之间的氨基酸数相对保守，且最后一对半胱氨酸前的第2个氨基酸残基通常为色氨酸等芳香族氨基酸。PHD结构域的三维结构通常为球状。进一步研究发现，PHD结构域是14种已知的锌指结构域中的一种，存在于400多种真核生物蛋白质中，在进化过程中高度保守^[3,7]。植物PHD蛋白的结构比较复杂，除了共同拥有的PHD结构域外，同一物种中的PHD蛋白还包含其他多种结构域，如BAH(bromo adjacent homology domain)、DDT结构域。PHD蛋白中丰富且多样的结构域很可能是导致其功能多样性的决定因素。研究发现，PHD蛋白与植物的各种生理生化过程有关，许多研究也表明了PHD基因在调节植物生长发育、病原体防御和对各种胁迫的反应中具有重要作用。

本领域从未报道过PHD蛋白与枯萎病之间的关联。

发明内容

基于本领域的上述空白，本发明克隆到一个响应西瓜枯萎病的西瓜PHD转录因子ClPHD23基因，并验证了西瓜ClPHD23基因的抗西瓜枯萎病的功能，为进一步深入研究西瓜响应枯萎病的防御机制提供理论基础。

一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因，其特征在于，其编码序列如SEQ IDNO.2所示。

所述的一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因，其特征在于，其DNA序列如SEQID NO.3所示。

一种重组表达载体，其特征在于，其上装载有可过表达或沉默抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的序列；所述PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的一种重组表达载体，其特征在于，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列、或，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列片段；

优选地，所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列选自如SEQ ID NO.2所示的编码序列，和/或，如SEQ ID NO.3所示的DNA序列；

优选地，抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列片段如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述重组表达载体为装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列的表达载体；

优选地，所述表达载体选自EGFP-pFGC载体、或，PV190载体。

一种转化体，其特征在于，包含可过量表达或沉默抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的表达载体；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的一种转化体，其特征在于，包含装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列、或，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列片段的表达载体；

优选地，优选地，所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列选自如SEQ IDNO.2所示的编码序列，和/或，如SEQ ID NO.3所示的DNA序列；

优选地，所述表达载体选自EGFP-pFGC载体、或，PV190载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

一种抗枯萎病的方法，其特征在于，在目标植物体内过表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将含有可表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体的宿主细胞转染至所述目标植物体内；

优选地，将可表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体转化至宿主细胞内；

优选地，将抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列连接至表达载体上；

优选地，所述表达载体为EGFP-pFGC载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述将如SEQ ID NO.2所示的编码序列连接至EGFP-pFGC载体上并转化至农杆菌GV3101内获得转化体，再将转化体转染至目标植物体内；

优选地，所述目标植物为西瓜。

一种枯萎病致病方法，其特征在于，在目标植物体内沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，将含有可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体的宿主细胞转染至所述目标植物体内；

优选地，将可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体转化至宿主细胞内；

优选地，将可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列连接至表达载体上；

优选地，所述可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列为抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因的编码序列的第551-800位置的片段序列；

优选地，所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列如SEQ IDNO.4所示；

优选地，所述表达载体选自PV190载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述将如SEQ ID NO.4所示的基因片段序列连接至PV190载体上并转化至农杆菌GV3101内获得转化体，再将转化体转染至目标植物体内；优选地，所述目标植物为西瓜。

本发明提供一种西瓜中获得的PHD转录因子基因ClPHD23。

所述的西瓜PHD转录因子基因ClPHD23的核苷酸序列。

所述的西瓜PHD转录因子基因ClPHD23的功能研究；

1)采用荧光定量PCR的方法，证实西瓜PHD转录因子基因ClPHD23在西瓜不同品种中响应枯萎病菌的模式不同；

2)通过病毒诱导基因沉默和瞬时过量表达的方法进一步验证西瓜PHD转录因子ClPHD23基因响应西瓜枯萎病的功能。

所述的西瓜PHD转录因子基因ClPHD23的应用。

本发明开拓性发现了西瓜PHD转录因子ClPHD23与枯萎病之间的关联，通过实验证实，沉默表达所述PHD转录因子ClPHD23基因可使枯萎病病情加重，过表达所述PHD转录因子ClPHD23基因可缓解枯萎病病症。本发明从西瓜中鉴定到一个响应西瓜枯萎病生理小种2的效应的转录因子ClPHD23，该基因编码的蛋白属于PHD转录因子家族成员。定量PCR结果表明其在感病品种‘SugerBuby’中被抑制表达而在西瓜抗病病品种‘PI296431’中的表达水平基本没有变化。利用病毒诱导基因沉默实验(VIGS)和西瓜瞬时过表达实验进一步证明了ClPHD23基因在响应西瓜枯萎病过程中的正调控功能。本发明鉴定到的ClPHD23转录因子基因有利于分析研究西瓜响应枯萎病的抗性机制，可用于抗枯萎病西瓜的培育。ClPHD23基因在不同西瓜品种中响应枯萎病菌的模式，为进一步深入研究PHD转录因子响应西瓜枯萎病提供了依据。本发明获得的ClPHD23转录因子可有效调控植物对枯萎病的抗性，使发病时间推迟，发病程度减轻。

附图说明

图1为西瓜ClPHD家族蛋白的进化树分析图，红色圆代表ClPHD23蛋白

图2为西瓜ClPHD23蛋白的亚细胞定位示意图。

图3为西瓜ClPHD23基因在不同抗性的西瓜品种中响应枯萎病的表达分析。

图4.病毒诱导基因沉默验证西瓜ClPHD23基因功能。其中左侧柱形图中的标记含义列示如下：

PV190：转入了PV190空载体的并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株；

ClPHD23-PV190：转入了ClPHD23基因沉默表达载体，即，重组质粒PV190-ClPHD23的，并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株；

右图照片中的标记含义列示如下：

PV190对照：转入了PV190空载体的但并未接种西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株；

PV190接病：转入了PV190空载体的并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株；

ClPHD23-PV190对照：转入了ClPHD23基因沉默表达载体，即，重组质粒PV190-ClPHD23的，但并未接种西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株；

ClPHD23-PV190接病：转入了ClPHD23基因沉默表达载体，即，重组质粒PV190-ClPHD23的，并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜植株。

图5.瞬时过量表达验证西瓜ClPHD23基因功能。左图照片和右图柱形图中的标记含义列示如下：

CK：转入了pFGC空载体的并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜幼苗植株；

OEPHD23和ClPHD23-PFGC均表示：转入了ClPHD23基因过表达载体EGFP-ClPHD23-pFGC载体的，并接种了西瓜枯萎病菌生理小种2的西瓜幼苗植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不以此限制本发明的保护范围。

生物材料的来源和记载出处

‘JJZ’西瓜为申请人实验室保存的西瓜高代自交系，申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的效果。

西瓜抗病品种PI296431和感病品种SugerBuby均为公知公用的西瓜品种，可商购获得。

农杆菌GV3101购自北京天恩泽基因科技有限公司。pFGC载体均可商购获得。

PV190载体为已知载体，其披露于“Acucumber green mottle mosaic virusvector for virus-induced gene silencing in cucurbit plants”一文中。

西瓜枯萎病菌生理小种2由北京农林科学院许勇实验室提供，申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的效果。

第1组实施例、本发明的抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23

本组实施例提供一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本领域技术人员可根据本发明的启示，对抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行功能结构域分析，并在不改变该PHD转录因子ClPHD23抗枯萎病这一功能的前提下，对PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列进行氨基酸的修饰、改变、增加、删减。

任何基于抗枯萎病功能的对PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列进行氨基酸的修饰、改变、增加、删减的行为均落入本发明的保护范围。

任何使用、合成、表达、生产、销售、许诺销售本发明的抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的行为均落入本发明的保护范围。

第2组实施例、本发明的抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因

本组实施例提供一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一些实施例中，所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因的DNA序列如SEQID NO.3所示。

基于密码子的简并性，本领域技术人员可根据本发明的记载，在不改变本发明PHD转录因子ClPHD23的功能的前提下，任何对PHD转录因子ClPHD23的基因序列做核苷酸的修饰、改变、增加、删减的行为均落入本发明的保护范围。

任何使用、扩增、合成、生产、销售、许诺销售本发明的抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的行为均落入本发明的保护范围。

第3组实施例、本发明的重组表达载体

本组实施例提供一种重组表达载体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述重组表达载体上装载有可过表达或沉默抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的序列；所述PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些具体的实施例中，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列、或，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列片段；

优选地，所述表达载体选自EGFP-pFGC载体、或，PV190载体。

在本发明具体的实验例中，EGFP-pFGC载体用来过表达PHD转录因子ClPHD23，本领域技术人员也可采用其它过表达载体，例如，可商购获得的商品化的过表达载体，更换其它过表达载体对本发明的PHD转录因子ClPHD23进行过表达是本领域的常规操作，不存在任何技术障碍。

在本发明另一些具体的实验例中，PV190载体用来沉默表达PHD转录因子ClPHD23，本领域技术人员也可采用其它基因沉默表达载体，例如，可商购获得的商品化的基因沉默表达载体，更换其它基因沉默表达载体对本发明的PHD转录因子ClPHD23进行沉默是本领域的常规操作，不存在任何技术障碍。

第4组实施例、本发明的转化体

本组实施例提供一种转化体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述转化体包含可过量表达或沉默抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的表达载体；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在具体的实施例中，所述一种转化体包含装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列、或，装载有抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列的表达载体；

优选地，所述表达载体选自EGFP-pFGC载体、或，PV190载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

第5组实施例、本发明的抗枯萎病方法

本组实施例提供一种抗枯萎病的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：在目标植物体内过表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施例中，将含有可表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体的宿主细胞转染至所述目标植物体内；

优选地，所述表达载体为EGFP-pFGC载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述目标植物为西瓜。

第6组实施例、本发明的枯萎病致病方法

本组实施例提供一种枯萎病致病方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：在目标植物体内沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述表达载体为PV190载体；

优选地，所述转化体的宿主细胞为农杆菌；

本领域技术人员可利用本发明的上述枯萎病致病方法构建模式病株。

实验例、本发明的转录因子ClPHD23基因的克隆与功能验证

具体实验步骤如下：

1.西瓜PHD转录因子ClPHD23基因的克隆

将本研究室保存的西瓜高代自交系‘JJZ’种植在浙江省农业科学院基地的温室大棚，挑选生长至坐果期的西瓜，取其根、茎、叶片、当天开放的雄花和雌花、以及直径3cm左右的授粉的果实，迅速置于液氮中，然后放在-80℃冰箱至RNA提取。采用TAKALA公司的RNA提取试剂盒进行RNA的提取，具体步骤参考说明书(TAKALA,日本)。cDNA第一链的合成参照TAKALA公司的反转录试剂盒(SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit)的说明书进行。将各个样品cDNA混合后作为模板，以引物ClPHD23-S：ATGGTCGTTAACGCTC(SEQ ID NO.5)；ClPHD23A：GTTAACATACCCTAGTCTAAAC(SEQ ID NO.6)，这对引物可以扩增出ClPHD23基因cDNA全长。扩增体系50μL，其中buffer 25μL、dNTP 10μL、上下引物各1.5μL、模板2μL、ddH2O9μL、KOD FX 1μL。扩增程序为98℃2min；98℃20s，60℃30s，68℃1min，共40个循环；68℃5min；10℃保温。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段切下之后进行纯化，并进行测序验证。

2.实时定量PCR反应

将西瓜枯萎病抗感病品种，包括抗病品种PI296431和感病品种SugerBuby播种在光照培养箱中，光照强度为300μmol m-2s-1、光周期为16h/8h，温周期为28℃/23℃。当西瓜生长至一叶期时，挑选出大小、长势一致且健壮的幼苗进行枯萎病接种，接种病菌采用西瓜专化型生理小种2，接种方法采用国际标准的苗期浸根接种鉴定方法，具体参考(Niu etal.,2016)，接种后0h和24h对其根部进行取材，置于-75℃保持至提取RNA。

选取ClPHD23基因的特异性序列设计qRT-PCR引物，以西瓜β-actin(Cla007792)作为内参基因(Kong et al.,2014)，所有引物按照合成说明进行稀释。反应体系参照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书，在CFX96 Real Time Systerm(Bio-Rad,USA)仪器上进行反应。每次实验设置3次技术重复。数据处理按照2-ΔΔCt方法进行处理和分析。

定量所用引物：qrtClPHD23-S：ATGGGGTTGAGTATCGGC(SEQ ID NO.7)；

qrtClPHD23-A：GCATCAGGAGTCACGGC(SEQ ID NO.8)。

3.亚细胞定位分析

为了对西瓜ClPHD23蛋白进行亚细胞定位，我们以西瓜cDNA为模板，利用高保真酶对其进行克隆ClPHD23基因的CDS序列(扩增体系参照TOYOBO公司KOD-plus-Neo操作说明书)，在5’和3’端分别引入BamH I限制性酶切位点，

subClPHD23-S:

GACGAGCTGTACAAGGGATCCATGGTCGTTAACGCTC(SEQ ID NO.9)；

subClPHD23-A:

CTCTAGACTCACCTAGGATCCGTTAACATACCCTAGTCTAAAC(SEQ ID NO.10)。

利用同源重组的方法将纯化的PCR产物连接到BamH I酶切的EGFP-PFGC载体上，构建EGFP-ClPHD23-pFGC载体。将得到的含有阳性质粒转化到农杆菌GV3101中。选长势良好的4周左右的烟草植株，每株选取3片叶片，将悬浮液稀释后的EGFP-ClPHD23-pFGC和pFGC菌液推入叶片背面，注射后的烟草于正常生长环境中培养48h后，剪取针孔附近的叶片，在共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)下观察荧光信号并拍照。

4.病毒诱导基因沉默

本部分“病毒诱导基因沉默”的具体实验操作步骤可参考"Liu M,Liang Z,ArandaM A,et al.A cucumber green mottle mosaic virus vector for virus-induced genesilencing in cucurbit plants[J].Plant Methods,2020,16."一文记载的实验步骤。

采用酶切连接的方式将合成的ClPHD23基因片段构建到PV190载体上(古勤生课题组提供)。该基因片段序列如SEQ ID NO.4所示，这段序列由公司直接合成，其两端有BamH I限制性酶切位点；该片段为西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai)抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23基因的编码序列的第551-800位置的片段序列，经基因沉默实验证实该基因片段序列可沉默表达西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai)抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23基因(图4)。

将重组质粒PV190-ClPHD23及PV190空载质粒导入农杆菌GV3101(北京天恩泽基因科技有限公司，北京)。将菌液注射入3周左右的‘JJZ’西瓜第二片真叶中，5天和15天后，观察发病表型并统计病情指数。

5.瞬时过量表达ClPHD23基因过表达

将西瓜种子剥皮后进行催芽，催芽2天待种子开始露白后，将种子浸没在含有EGFP-ClPHD23-pFGC菌液(即上面第3部分构建得到的EGFP-ClPHD23-pFGC载体并转化到农杆菌GV3101中得到的含有阳性质粒的农杆菌GV3101)的悬浮液进行抽真空30min，用无菌水冲洗干净后继续催芽2-3天，待大多数种子的胚根长度大于1cm时，利用西瓜枯萎病菌生理小种2接种胚根，接种鉴定方法具体参考(李丽莉等，2020年，浙江农业科学)。2天后对发病后的胚根进行观察拍照，并对病情指数进行统计。

6.试验结果：

本发明鉴定一个典型且保守的PHD家族蛋白成员ClPHD23(图1至图2)；

荧光定量PCR结果显示，接种枯萎病24h后，西瓜ClPHD23在西瓜枯萎病抗病材料(PI296431)中的表达水平没有显著变化，而在感病材料(SugerBuby)品种中的表达水平大大降低(图3)。

病毒诱导基因沉默和瞬时过表达实验表明，西瓜ClPHD23正调控枯萎病的感染。ClPHD23的表达被干涉时，西瓜的发病时间明显提前，发病程度显著加重，病情指数明显高于对照(图4)。同时，ClPHD23被过量表达时，西瓜胚根的发病时间推迟，发病程度减轻(图5A)，病情指数显著低于对照(图5B)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23、其基因、表达载体、转化体与应用

<130> P210008/NKY

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 700

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

Matsum&Nadai）抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23

<400> 1

Met Val Val Asn Ala Arg Pro Leu Lys Arg Met Lys Arg Arg Val Thr

1 5 10 15

Ala Asp Leu Tyr Asp Phe Leu Ser Phe Pro Ser Ser Ser Met Ser Ala

20 25 30

Ala Ser Pro Asp Asp Ser Asp His Asp His Leu Phe Thr Gly Pro Phe

35 40 45

Arg Thr Asn Val Arg Thr Phe Leu Ser Lys His Ala Leu Leu Pro Pro

50 55 60

Pro Ser Ser Leu Phe Pro His Leu Leu Thr Trp Gln Ile Leu Phe Arg

65 70 75 80

Ile Gly Asp Leu Val Asp Gly Pro Asp Ser Gln Pro Ala Val Val Tyr

85 90 95

Leu Asp Ile Val Glu Glu Asp Val Pro Arg Ser Arg Ser Val Tyr Cys

100 105 110

Asp Gln Cys Arg Val Val Gly Trp Ser Ala His Pro Val Cys Ala Lys

115 120 125

Arg Tyr His Phe Ile Ile Lys Ala Asn Gly Ser Ser Ile Gly Gly Tyr

130 135 140

His Lys Pro Cys Met Cys Cys Gly Asp Val Leu His Leu Ser Glu Ser

145 150 155 160

Lys Cys Lys Ser Cys Asn His Val Thr Ser Thr Asp Asp Val Glu Asp

165 170 175

Trp Val Tyr Gln Gln Leu Glu Asn Asn Thr His Leu Leu His Ala Val

180 185 190

Val His Ser Asn Gly Tyr Gly His Leu Leu Arg Val Asn Gly Arg Glu

195 200 205

Gly Gly Ser Arg His Leu Ser Gly Cys His Ile Met Asp Phe Trp Asp

210 215 220

Arg Phe Cys Lys Met Leu Gly Val Arg Lys Val Ser Val Met Asp Val

225 230 235 240

Ser Lys Lys Tyr Gly Val Glu Tyr Arg Leu Leu His Ala Ile Thr Lys

245 250 255

Gly His Pro Trp Tyr Gly Glu Trp Gly Tyr Glu Phe Gly Ala Gly Ser

260 265 270

Phe Ala Val Thr Pro Asp Ala Tyr Lys Met Ala Val Glu Thr Leu Ser

275 280 285

Ser Leu Pro Leu Ser Ile Phe Thr Ser Gln Gly Arg Lys Pro Arg Ser

290 295 300

His Leu Gln Asp Ile Ile Leu Tyr Tyr Gln Ser Leu Ser Glu Arg Lys

305 310 315 320

Leu Val Asn Val Arg Asp Leu Phe Arg Phe Leu Met Ser Leu Ile His

325 330 335

Asn Val Arg Lys Ser Ser Thr Ile Asn Asp Val Thr Asp Glu Lys Gln

340 345 350

Gln Ser Lys Val Leu Cys Ser Trp Thr Arg Ser Asp Val Thr Arg Val

355 360 365

Glu Glu Ala Met Leu Lys Val Leu His Ala Val Ser Gly Ser Asn Trp

370 375 380

Val Thr Trp Arg Thr Leu Arg Gly Ala Val Cys Lys Ala Gly Pro Pro

385 390 395 400

Glu Leu Leu Asp Tyr Cys Leu Lys Asn Leu Gly Gly Lys Val Ser Ser

405 410 415

Asp Gly Met Val Val Asn Ala Gln Arg Asn Pro Gln Ser Gly Ala Phe

420 425 430

Glu Tyr Arg Leu Glu Pro Ser Ser Val Ser Leu Asn Thr Ala Ser Asp

435 440 445

Ser Thr Glu Ser Ser Ile Ser Ser Tyr Pro Ser Glu Glu Asn Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Ala Met Leu His Pro His Ser Met

465 470 475 480

Val Asn Tyr Gly Pro Gln Ala Thr Arg Glu Ala Ala Val Ser Ser Ala

485 490 495

Leu Lys Leu Ile Asp Cys Lys Gln Phe Val Lys Asp Tyr Lys Pro Glu

500 505 510

Lys Leu Ser Thr Lys Leu Asn Pro Phe Ser Ile Cys Leu Leu Cys Glu

515 520 525

Val Glu Val Val Glu Asp Ser Lys Asp Asn Ser Ser Arg Pro Pro Pro

530 535 540

Glu Leu Val Ile Leu Pro Ser Asn Ala Thr Met Ser Asp Leu Lys Leu

545 550 555 560

Glu Ala Ser Lys Ala Phe Gln His Val Tyr Leu Met Phe Arg Arg Phe

565 570 575

Gln Ala Glu Glu Ile Val Asp His Gly Gly Val Asp Asp Ser Thr Gln

580 585 590

Val Lys Leu Leu Phe Gly Gln Thr Glu Ser Val Cys Val Arg Gly Arg

595 600 605

Cys Gln Val Lys Ile Ala Leu Asn Arg Phe Arg Met Glu Arg Gly Val

610 615 620

Glu Arg Trp Thr Val Asp Cys Ser Cys Gly Ala Lys Asp Asp Asp Gly

625 630 635 640

Glu Arg Met Leu Ala Cys Asp Leu Cys Gly Val Trp Arg His Thr Arg

645 650 655

Cys Ser Gly Ile Gln Asp Ser Asp Asp Val Pro Gly Lys Phe Val Cys

660 665 670

Tyr Lys Cys Arg Ser Ser Ile Val Ala Met Asn Thr Asn Gly Glu Thr

675 680 685

Glu Ala Asp Thr Leu Phe Arg Leu Gly Tyr Val Asn

690 695 700

<210> 2

<211> 2103

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

Matsum&Nadai）抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因编码序列

<400> 2

atggtcgtta acgctcgtcc cctcaagaga atgaagagac gtgtcactgc tgatctttac 60

gatttccttt ccttcccttc ttcctccatg tccgccgcct ctccagatga ttccgaccac 120

gaccatctct tcaccggccc tttccggacc aacgttcgca ccttcctttc taagcatgct 180

ctccttcctc ctccctcttc cttgttccct caccttctca catggcagat cctcttccgc 240

atcggcgacc ttgtcgatgg ccctgattct caacctgccg ttgtttatct cgatatcgtc 300

gaggaagacg tccccagatc cagatccgtt tactgcgatc agtgccgtgt tgttgggtgg 360

agtgcacatc ctgtgtgtgc gaaacggtac catttcataa taaaggctaa tggaagctcc 420

attggaggtt atcataagcc atgtatgtgc tgtggagacg tcttgcatct atccgagtcc 480

aaatgcaagt cgtgcaatca tgtaacgagc acagatgatg tggaagattg ggtgtaccaa 540

caattggaga acaataccca tcttttacat gctgtggtcc actccaatgg ttatgggcac 600

ctactcaggg tcaatggaag agagggtggt tcaaggcact tatctggatg ccatatcatg 660

gatttttggg accgattttg taaaatgctt ggagtcagaa aggtaagtgt aatggatgtg 720

tccaagaagt atggggttga gtatcggctg cttcatgcca tcaccaaagg ccatccatgg 780

tatggtgagt ggggttatga atttggtgct ggtagttttg ccgtgactcc tgatgcctac 840

aaaatggctg ttgaaaccct ctccagccta cctttgtcaa tctttacatc tcaaggccgg 900

aagcctcgtt ctcacctgca ggatataatt ttatattatc agtctttgtc agagcgtaag 960

cttgtaaatg taagagatct cttcaggttt ctgatgagct taattcataa tgttcgcaag 1020

tcatcaacca ttaatgatgt aacggatgag aagcagcagt cgaaggtttt gtgctcatgg 1080

acaagaagtg atgttacacg tgttgaggaa gcaatgctga aagtgctgca tgcagtatct 1140

gggtcgaatt gggtcacctg gcgcaccctt cgtggtgctg tgtgcaaagc aggtccacct 1200

gaactccttg attattgcct taagaatctt ggagggaaag tatcatctga tggaatggtt 1260

gttaatgctc aacgcaatcc tcaatccggt gctttcgaat acagacttga accgagcagt 1320

gtttcattga atacagcttc tgattccact gaatcatcca tctctagcta cccatctgaa 1380

gaaaatcttc tattggactt gagatttttg tacgatgcca tgcttcatcc acattctatg 1440

gtgaactatg ggccccaggc aactagggaa gcagcggtca gctcggcctt gaagctcata 1500

gactgcaagc agttcgtgaa agattataaa ccagagaagt tgtcaactaa gttgaatcct 1560

ttttcgatat gcctcttgtg tgaggtcgaa gtcgtggagg actcaaaaga caattcctca 1620

agacctcctc cagagctagt tatacttcca tctaatgcta ccatgtctga cctgaagctg 1680

gaagcatcaa aagctttcca acatgtatac ttgatgttca gaaggtttca agcagaagag 1740

atagtggacc atggcggtgt ggacgattcc acccaggtca agctgttgtt cggacaaacg 1800

gagtcggtct gtgtcagagg aagatgccaa gtgaagattg cgctgaacag gtttcgaatg 1860

gagagagggg tagaacggtg gacagttgat tgtagttgtg gagccaagga tgacgatggg 1920

gagaggatgc tagcttgtga cttatgcggt gtttggcggc atacaagatg ttcagggatt 1980

caagactctg atgatgtccc tgggaaattt gtctgttata aatgcagaag ctcgattgtt 2040

gcaatgaata ctaatgggga aactgaggcg gatactctgt ttagactagg gtatgttaac 2100

tga 2103

<210> 3

<211> 4776

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

Matsum&Nadai）抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因DNA序列

<400> 3

atggtcgtta acgctcgtcc cctcaagaga atgaagagac gtgtcactgc tgatctttac 60

gatttccttt ccttcccttc ttcctccatg tccgccgcct ctccagatga ttccgaccac 120

gaccatctct tcaccggccc tttccggacc aacgttcgca ccttcctttc taagcatgct 180

ctccttcctc ctccctcttc cttgttccct caccttctca catggcagat cctcttccgc 240

atcggcgacc ttgtcgatgg ccctgattct caacctgccg ttgtttatct cgatatcgtc 300

gaggaagacg tccccagatc cagatccgtt tactgcgatc agtgccgtgt tgttggtgag 360

tctctccttt ctttcacttt ttccgatggt ttttctctac ctcttctcgc cggcgatcga 420

tctttgaaaa tctcgcgaat ttgactgatg ccgataattt ctcgagattt tgagatgggg 480

aattgtttcg aggtgaattg attatctttt cttcttctgt ggggcccttg atttgaggat 540

gtttgatacc accgttggat gtgttacacg tggcggaacg gaaatgaaat tggatattat 600

gttaatgtct gagtgacagc taattcgaaa ctttgggagt acggtgttgt agtgggtaat 660

gaatgatcat gatgatgatt ttttcttatc ttaggagggg gcttcgcttt tgactatttt 720

cttaatatat agttaattaa tttattttat tgtcttaagt attgatatga agtaaaagat 780

ttgaattact atacttcaag gggagactat ttatgtattt cttttgcaaa gtgggtggtg 840

ggtgggtgaa gggatctttt tctttgacag agagagatgg aaaagaagag acattttcat 900

ggaaattgag gattgtctgt ttgtggatac aatgtcccac atctcggaaa aagctgacaa 960

atcacgttac ctgcgtgttc ctcttttcct tctggataaa agaattattt catttctctt 1020

tcccgtctcc attttgttta tctttttatc tttagaacat gtcgaatatc taattcactt 1080

gattttttta tacgtttaat tttttaactt ttgggttatg atacccttat ggattactgt 1140

acaagaacac ccaagcgggt gttttgtttg atgattgatg tgaattgtgt ttgaaattgt 1200

atggcaatga ttagggtgga gtgcacatcc tgtgtgtgcg aaacggtacc atttcataat 1260

aaaggctaat ggaagctcca ttggaggtta tcataagcca tgtatgtgct gtggagacgt 1320

cttgcatcta tccgagtcca agtgagctca ttaaccacac ccctttcact tgtttatgtt 1380

tattctggac tgaacaatcc atattttcca ataatttttt tacctttgtt cttcctttta 1440

gttcaatggt ttttgtgtga ttgcttgctt tcgagactag aattgagctt tagatatgga 1500

cgcatcatcg tctacagatg agcttggata taattttgct gaataattca ttatttacag 1560

aattcctaac ctatgtcacg tggtttatag gtaaacttta atctatgagt caaatatgaa 1620

tttgatgtgt gcagaaggtg aatgaaatga tacttctggg atcacgactg ccatatcttt 1680

cctttccatt taatcagtgt agccaaataa acaatttgca aaattcattt tcttgtgttt 1740

gcaattagtt ccttctttat tttgttgtgt agaagtaaaa ttgttataac tgaatgacag 1800

gcatacatct cagccttttc ttatcttgca gaatctgata tttaagggat ctctatgtct 1860

aagcattatt ctggcttttg ttttttctcc cgattttgaa gagttcctta ttatatttgc 1920

atttctagat gcaagtcgtg caatcatgta acgagcacag atgatgtgga agattgggtg 1980

taccaacaat tggagaacaa tacccatctt ttacatgctg tggtccactc caatggttat 2040

gggcacctac tcagggtcaa tggaagagag ggtggttcaa ggcacttatc tggatgccat 2100

atcatggatt tttgggaccg attttgtaaa atgcttggag tcaggtaagg catccttcca 2160

gtgaatcctt ttggaaatgg atttatagct tttttcagtt cggctcacat tgtcaactga 2220

attatttaca ttaatgtttt tatttgctat ttttgggctg tttataaaaa aagcacaatg 2280

aattaagctt ctacgttcta agctttgttt gatatattat gttgtaatga aatcctgtat 2340

taatataaca aactattcct gatggataga gaaaagtgaa accttaaagt ttgtaatttt 2400

atgctctgga acggcatttc aacgctcttt ccaccctaac caaagaaaag caaagatttc 2460

attatttgtt ataattttcc tttacaaatt actaacgcac agacaatgca tggttgtaag 2520

gtggagtatt atgttttatt cctagtcggt tgttaaagat gtaactggga agatgttatt 2580

ctgttggttg ctgcctgcct atatttgagt attttagggg tattttacta aggttgatga 2640

gaaccctata ttttgcgttg gtatttgtat actccattgt ttttctagaa agtcaacccc 2700

tgtgcatatt ctcttcaata tgtgttacag tttggggatg ataccagatg tagtattcaa 2760

attctttttg gacctgctct tcccaccaaa gctcagttgt tatgtattaa tgcttcaaag 2820

gctattctct cagatatttt gttggaaaga atccaaagag ttcttgaaac caagtctctt 2880

gattgggtgc atcaatttta acttatcaag attaaagctc cttaggggtg tttattgttt 2940

aaacattttc ctgcttatcc tcttagtggc atttgtaaca acttggggcc ttttctctat 3000

gggctgtgat tttcagtctt tccctttttc tgcttttatt tctatcaatt ctgttttaaa 3060

tcttttccct agtctacact ctttagtcat tgttcggctg tgttctgttt ctctttttat 3120

ttatcaatga gttcttgttc cttgttccaa aaccaaaatg aaattgagtg tatgctctct 3180

tctgtgctga aaatggtgaa agtgccatat tcttctttgt tatggattca tggaataatt 3240

gattttttgt tttcgatttt tgggcagaaa ggtaagtgta atggatgtgt ccaagaagta 3300

tggggttgag tatcggctgc ttcatgccat caccaaaggc catccatggt atggtgagtg 3360

gggttatgaa tttggtgctg gtagttttgc cgtgactcct gatgcctaca aaatggctgt 3420

tgaaaccctc tccagcctac ctttgtcaat ctttacatct caaggccgga agcctcgttc 3480

tcacctgcag gatataattt tatattatca gtctttgtca gagcgtaagc ttgtaaatgt 3540

aagagatctc ttcaggtttc tgatgagctt aattcataat gttcgcaagt catcaaccat 3600

taatgatgta acggatgaga agcagcagtc gaaggttttg tgctcatgga caagaagtga 3660

tgttacacgt gttgaggaag caatgctgaa agtgctgcat gcagtatctg ggtcgaattg 3720

ggtcacctgg cgcacccttc gtggtgctgt gtgcaaagca ggtccacctg aactccttga 3780

ttattgcctt aagaatcttg gagggaaagt atcatctgat ggaatggttg ttaatgctca 3840

acgcaatcct caatccggtg ctttcgaata caggtaaatg aaatggtctt tctttgatct 3900

tttttcatgt tattgttcgt acgattgttt ttcatagttt gtggtctctc aagggggtgt 3960

atttgtcttt tttgcagact tgaaccgagc agtgtttcat tgaatacagc ttctgattcc 4020

actgaatcat ccatctctag ctacccatct gaagaaaatc ttctattgga cttgagattt 4080

ttgtacgatg ccatgcttca tccacattct atggtgaact atgggcccca ggcaactagg 4140

gaagcagcgg tcagctcggc cttgaagctc atagactgca agcagttcgt gaaagattat 4200

aaaccagaga agttgtcaac taagttgaat cctttttcga tatgcctctt gtgtgaggtc 4260

gaagtcgtgg aggactcaaa agacaattcc tcaagacctc ctccagagct agttatactt 4320

ccatctaatg ctaccatgtc tgacctgaag ctggaagcat caaaagcttt ccaacatgta 4380

tacttgatgt tcagaaggtt tcaagcagaa gagatagtgg accatggcgg tgtggacgat 4440

tccacccagg tcaagctgtt gttcggacaa acggagtcgg tctgtgtcag aggaagatgc 4500

caagtgaaga ttgcgctgaa caggtttcga atggagagag gggtagaacg gtggacagtt 4560

gattgtagtt gtggagccaa ggatgacgat ggggagagga tgctagcttg tgacttatgc 4620

ggtgtttggc ggcatacaag atgttcaggg attcaagact ctgatgatgt ccctgggaaa 4680

tttgtctgtt ataaatgcag aagctcgatt gttgcaatga atactaatgg ggaaactgag 4740

gcggatactc tgtttagact agggtatgtt aactga 4776

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 可沉默表达西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

Matsum&Nadai）抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23基因的基因片段序列

<400> 4

acaataccca tcttttacat gctgtggtcc actccaatgg ttatgggcac ctactcaggg 60

tcaatggaag agagggtggt tcaaggcact tatctggatg ccatatcatg gatttttggg 120

accgattttg taaaatgctt ggagtcagaa aggtaagtgt aatggatgtg tccaagaagt 180

atggggttga gtatcggctg cttcatgcca tcaccaaagg ccatccatgg tatggtgagt 240

ggggttatga 250

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 可扩增西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

Matsum&Nadai）抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23基因cDNA全长的引物ClPHD23

-S

<400> 5

atggtcgtta acgctc 16

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 可扩增西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.)

A

<400> 6

gttaacatac cctagtctaa ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 定量PCR引物qrtClPHD23-S

<400> 7

atggggttga gtatcggc 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 定量PCR引物qrtClPHD23-A

<400> 8

gcatcaggag tcacggc 17

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 亚细胞定位引物subClPHD23-S

<400> 9

gacgagctgt acaagggatc catggtcgtt aacgctc 37

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 亚细胞定位引物subClPHD23-A

<400> 10

tctagactca cctaggatcc gttaacatac cctagtctaa ac 42

Claims

1. 一种抗枯萎病的方法，其特征在于，在目标植物体内过表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述目标植物为西瓜。

2.根据权利要求1所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将含有表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体的宿主细胞转染至所述目标植物体内。

3.根据权利要求1所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体转化至宿主细胞内。

4.根据权利要求2所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的重组表达载体转化至宿主细胞内。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因序列连接至表达载体上。

6.根据权利要求5所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，所述表达载体为EGFP-pFGC载体。

7.根据权利要求2-4任一所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌。

8. 根据权利要求1-4、6任一所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将如SEQ IDNO.2所示的编码序列连接至EGFP-pFGC载体上并转化至农杆菌GV3101内获得转化体，再将转化体转染至目标植物体内。

9. 根据权利要求5所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.2所示的编码序列连接至EGFP-pFGC载体上并转化至农杆菌GV3101内获得转化体，再将转化体转染至目标植物体内。

10. 根据权利要求7所述的一种抗枯萎病的方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.2所示的编码序列连接至EGFP-pFGC载体上并转化至农杆菌GV3101内获得转化体，再将转化体转染至目标植物体内。

11. 一种枯萎病致病方法，其特征在于，在目标植物体内沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23；所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述目标植物为西瓜。

12. 根据权利要求11所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，将可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列连接至表达载体上；所述可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列如SEQ ID NO.4所示。

13.根据权利要求12所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，将连接有可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列的重组表达载体转化至宿主细胞内。

14.根据权利要求13所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，将转化有可沉默表达抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因片段序列的重组表达载体的宿主细胞转染至所述目标植物体内。

15. 根据权利要求11-14任一所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，所述抗枯萎病PHD转录因子ClPHD23的基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

16.根据权利要求12-14任一所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，所述表达载体为PV190载体。

17.根据权利要求13或14所述的一种枯萎病致病方法，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌。