CN115304662B - CsHEC1蛋白及其编码基因在降低果实瓜把长度中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及CsHEC1蛋白及其编码基因在降低果实瓜把长度中的应用。本发明提供了CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控植物果实瓜把长度、选育不同瓜把长度的植物、以及植物品种改良中的应用，加快了不同黄瓜市场对瓜把长度需求的新品质培育。

Description

CsHEC1蛋白及其编码基因在降低果实瓜把长度中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CsHEC1蛋白及其编码基因在降低果实瓜把长度中的应用。
背景技术
葫芦科的园艺作物黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜的果实是其重要经济价值的器官，可鲜食，亦可加工成泡菜食用。园艺作物可食用果实的研究绝大多数集中在果实外观品质和内在品质性状方面，其中外观品质主要包括，果实形状，果实颜色以及果实表面特征等。果实形状直接影响着生产者和消费者的选购，也直接决定了该产品的外观等级和市场价值。因此，解析直接调控黄瓜果形发育的基因和调控网络，对于培育具有不同市场理想外在品质的黄瓜品种具有重要意义。
黄瓜果实从发育形态上看，瓜把和美味的果实部分共同组成了果实整体，并经由果柄连接到植株上。瓜把表面通常没有刺瘤，内部没有胎座等组织。在黄瓜种质资源中，商品瓜的瓜把长度从1cm～12cm 变异，可占果实总长度的35％。此外，瓜把由于其不佳的食用品质和较果实更窄小的直径，往往对黄瓜果实的形状和商业价值带有不利影响。以往的研究表明，黄瓜瓜把长度的变异主要是由加性遗传控制，而不是环境因素。2008年，王桂玲等在《黄瓜瓜把长度QTL定位的研究》研究中指出，在第1染色体的21.4cM区域发现了一个主效数量性状位点(QTL)，可解释瓜把长度18.5％的变异。随后，王敏等人在《黄瓜RIL群体瓜长和把长的QTL定位分析》中，利用160个重组自交系进行QTL定位，在3、6和7号染色体上检测到4个QTL 关联瓜把长度变异。然而，研究人员于2020年才克隆到第一个调控瓜把长度的QTL，定位于7号染色体，被命名为Fruit neck length 7.1 (CsFnl7.1)，其编码一个晚期胚胎发生丰富的蛋白，该蛋白可能通过调节细胞的扩展来正调黄瓜瓜把长度的伸长。除此之外，黄瓜瓜把长度变异的有关调控机制和候选基因尚不清楚。
此外，basic helix-loop-helix(bHLH)家族转录因子HECATEs (HECs)通过介导生长素和细胞分裂素途径在拟南芥的雌蕊群和顶端分生组织发育中扮演重要角色。有趣的是，当利用组成型35S启动子对HECs基因进行异位表达时，HEC基因的过表达均会导致花器官上产生异位的类似心皮化的异常组织，最常见的是柱头化组织；过表达的HEC1和HEC3也有时会导致雌蕊顶端-基底极性缺陷的产生，例如增大的柱头，缩小的子房和伸长的雌蕊柄(类比于黄瓜的瓜把组织)。
目前，黄瓜市场普遍畅销瓜把短或近乎没有的黄瓜品种，但有关黄瓜瓜把长短形成的遗传基因和调控机制仍十分有限。因此，去挖掘直接影响果实外观品质性状的瓜把长短调控基因对加速匹配黄瓜市场需求有着直接的生产指导和应用意义。
发明内容
鉴于此，本发明的第一目的是提供CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控植物果实瓜把中的应用。
本发明的第二目的是提供CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育不同瓜把长度的植物中的应用。
本发明的第三目的是提供CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物品种改良中的应用。
作为本发明的一种优选的实施方案，通过抑制CsHEC1基因的表达降低植物果实瓜把的长度。
作为本发明的一种优选的实施方案，通过基因编辑技术抑制 CsHEC1基因的表达。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述CsHEC1蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选的实施方案，CsHEC1蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述植物为葫芦科的植物。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述植物为黄瓜属的植物，优选为黄瓜。
本发明还提供了一种构建短瓜把黄瓜的方法，通过基因编辑技术抑制黄瓜中CsHEC1基因的表达。
在具体实施过程中，可采用CRISPR/Cas系统进行基因编辑。
在具体实施过程中，也可利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含CsHEC1 基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。
作为本发明的一种优选实施方案，本发明采用CRISPR/Cas9技术对CsHEC1基因进行了编辑，利用过表达载体对CsHEC1基因进行了过量表达，提供了CsHEC1基因在调控果实瓜把长度中的应用。
具体地，本发明从黄瓜品种“新泰密刺”中克隆得到黄瓜CsHEC1 基因，构建了基因CsHEC1的CRISPR/Cas9基因编辑载体和过表达载体，并遗传转化黄瓜，成功得到了CsHEC1基因被编辑的敲除植株和 CsHEC1基因过量表达的植株。该敲除植株中CsHEC1基因提前形成终止密码子而不能翻译成完整蛋白，进而使CsHEC1基因功能丧失。本发明首次发现黄瓜CsHEC1基因敲除的编辑植株表现为显著降低果实瓜把长度，而过表达CsHEC1基因则可以显著增加瓜把长度。
本发明的有益效果在于：本发明提供了CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控植物果实瓜把长度、选育不同瓜把长度的植物、以及植物品种改良中的应用，加快了不同黄瓜市场对瓜把长度需求的新品质培育。
附图说明
图1为实施例3中野生型WT、Cshec1#1和Cshec1#2编辑植株双靶点的桑格测序色谱图比对结果。
图2为实施例3中野生型WT、Cshec1#1和Cshec1#2突变体的基因型特征。
图3为实施例3中野生型WT、Cshec1#1和Cshec1#2突变体的黄瓜果实表型分析图。图中：A图为开花当天的果实；B图为商品期的果实；C图为成熟期果实的纵剖图；D图、E图和F图为成熟期果实的瓜把长、瓜长及瓜把长/瓜长数值的数据统计。
图4为实施例3中野生型WT和CsHEC1过表达植株的RNA和蛋白水平检测。
图5为实施例3中野生型WT和CsHEC1过表达植株的黄瓜果实表型分析图。图中：A图为开花当天的果实；B图为商品期的果实；C 图为成熟期果实的纵剖图；D图为成熟期果实的瓜把长统计；E图为成熟期果实的瓜把长/瓜长数值的统计。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
CsHEC1基因是Csa4G639900基因的简称。PKSE402G载体由中国农业科学院黄三文教授惠赠(Hu et al.,2017.Engineering Non-transgenic Gynoecious Cucumber Usingan Improved Transformation Protocol and Optimized CRISPR/Cas9 System.MolPlant 10:1575-1578)。pCBC-DT1T2模板质粒由中国农业大学陈其军教授惠赠(Xing etal.,2014.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.BMCPlant Biol 14:327)。农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。BsaI，HindIII和KpnI限制性核酸内切酶及T4连接酶购自新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)。
下述实施例中的实验方法和实验条件，若无特殊说明，均为常规方法。所用的试验材料、试剂或仪器等，如无特殊说明，均可从常规生化试剂商店购买得到。
实施例1CsHEC1基因的克隆
本发明依托于课题组前期的创新性研究，起源于早期苔藓的HEC 基因，在被子植物产生之前经历了基因复制事件，产生了HEC1/2和 HEC3的分支，功能验证发现黄瓜CsHEC3基因在维管束高表达，从而调控黄瓜器官形态发育和霜霉病抗性，而CsHEC2在果刺和果瘤中高表达，并在刺瘤密度控制中起作用，这表明基因功能通常与表达部位密切相关，并且HECs家族基因在黄瓜中产生了新功能化。此外，我们利用系列基因表达手段发现黄瓜CsHEC1基因高度表达在瓜把位置，这表明该基因可能在黄瓜瓜把长度调控中发挥着作用。因此对其进行以下探究。
1、实验材料的获得
黄瓜“新泰密刺”品种由中国农业大学眭晓蕾教授实验室惠赠。种子在恒温培养箱催芽露白后，种植于光照培养箱，待黄瓜幼苗生长到第三片真叶展开，取幼嫩生长点，迅速置入液氮中冷冻，并置入-80℃冰箱备用。
2、RNA的提取
采用普洛麦格公司试剂盒(Eastep Super isolation Kit，Promega)提取植物样品的总RNA。
3、cDNA的获得
以上述步骤2中提取的RNA为模板，采用天根生化科技(北京) 有限公司试剂盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix Kit，Tiangen Biotech)进行反转录合成cDNA。
4、目的基因的扩增
以步骤3获得的cDNA为模板，采用引物CsHEC1-F和CsHEC1-R 进行PCR扩增，得到PCR产物长度为717bp的CsHEC1基因全长。引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示：
CsHEC1-F:5’-ATGGAAAATGATGATTTAAAATCGG-3’(SEQ ID NO.4)
CsHEC1-R:5’-TCAAGGTTGGGATTGATGATGAT-3’(SEQ ID NO.5)
表1、目的基因CsHEC1编码区全长序列的扩增体系
Figure BDA0003624890880000061
PCR扩增反应程序：预变性98℃1min；变性98℃10s，退火57℃ 15s，延伸72℃40s，34个循环；终延伸72℃5min。
5、PCR产物的回收和克隆载体的构建
扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切下预期的目的条带。采用胶回收试剂盒进行凝胶回收，并将胶回收产物进行克隆载体“T”的连接，挑取单克隆菌进行测序。将测序正确的菌液保存-80℃冰箱，备用。
实施例2CsHEC1基因的CRISPR/Cas9载体和过表达载体构建
1、sgRNA序列的靶点序列设计
在CsHEC1基因上寻找并设计靶点序列，长度为19bp。靶点核苷酸序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。
靶点一核苷酸序列为：5’-CAGAAACAGAGGTCGGTAG-3’(SEQ ID NO.6)。
靶点二核苷酸序列为：5’-GTAGTTGAGCTGAAATCAG-3’(SEQ ID NO.7)。
2、CRISPR/Cas9载体构建的引物设计及扩增
依据上述步骤1中选择的靶点序列合成下列四条部分重叠的引物。以稀释100倍的pCBC-DT1T2质粒为模板进行四引物PCR扩增。
-BsF/-BsR为正常引物浓度；-F0/-R0稀释20倍。PCR体系及扩增程序同实施例1。四引物序列如SEQ ID NO.8～11所示。
CsHEC1-DT1-BsF:(SEQ ID NO.8)
5’-ATATATGGTCTCGATTGCAGAAACAGAGGTCGGTAGGTT-3’
CsHEC1-DT1-F0:(SEQ ID NO.9)
5’-TGCAGAAACAGAGGTCGGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3’
CsHEC1-DT2-R0:(SEQ ID NO.10)
5’-AACCTGATTTCAGCTCAACTACCAATCTCTTAGTCGACTCTAC -3’
CsHEC1-DT2-BsR:(SEQ ID NO.11)
5’-ATTATTGGTCTCGAAACCTGATTTCAGCTCAACTACCAA-3’
3、载体的酶切-连接体系建立
将PCR扩增产物进行纯化回收，建立如下酶切-连接体系：
表2、CRISPR/Cas9载体构建的酶切-连接体系
Figure BDA0003624890880000081
反应程序如下：37℃孵育2min，16℃孵育5min，循环重复50次， 80℃孵育5min(对酶进行热失活)。
4、过表达载体构建的引物设计及构建
以实施例1中测序正确的菌液提取质粒做模板，采用引物1300CsHEC1-Flag-F和1300CsHEC1-Flag-R进行扩增，得到PCR产物胶回收与pCambia1300-Flag过表达载体进行同源重组连接构建，重组构建选择的限制性核酸内切酶为HindIII和KpnI。引物序列如SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示。过表达载体中CsHEC1基因的C端与Flag 标签融合表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
1300CsHEC1-Flag-F：(SEQ ID NO.12)
AAATCGACTCTAGAAAGCTTATGGAAAATGATGATTTAAAATCG G
1300CsHEC1-Flag-R：(SEQ ID NO.13)
TCTTTGTAGTCCATGGTACCAGGTTGGGATTGATGATGATT
5、大肠感受态转化及菌落测序
将上述步骤3和4中连接好的载体转化大肠杆菌感受态DH5α，菌液涂布在含硫酸卡那霉素(50mg/L)的培养基平板上进行筛选。将得到的单菌落，使用引物U626-F+U629-R＝726bp进行菌落PCR鉴定 CRISPR/Cas9载体，选取符合预期目的条带的菌落用引物U626-F和U629-F进行CRISPR/Cas9载体测序。使用引物pCambia1300-Flag-F和 pCambia1300-Flag-R对过表达载体进行菌落PCR鉴定和载体测序。
引物序列如SEQ ID NO.14～18所示。
U626-F:5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’(SEQ ID NO.14)
U629-F:5’-TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC-3’(SEQ ID NO.15)
U629-R:5’-AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC-3’(SEQ ID NO.16)
pCambia1300-Flag-F:(SEQ ID NO.17)
TCAGAAATGGATAAATAGCCTTGC
pCambia1300-Flag-R:(SEQ ID NO.18)
GATCGGGGAAATTCGAGCTC
实施例3CsHEC1基因在调控果实瓜把长度中的应用
1、重组载体转化农杆菌EHA105
将上述实施例2中获得的测序正确的CRISPR/Cas9载体和过表达载体菌液通过质粒提取试剂盒进行质粒提取。获得的重组质粒分别通过热激转化法进行农杆菌感受态EHA105的转化。具体转化步骤按照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌感受态转化说明书进行。
2、农杆菌侵染遗传转化黄瓜
将上述步骤1中的重组农杆菌利用农杆菌介导的黄瓜子叶转化方法进行黄瓜遗传转化，黄瓜品种为“新泰密刺”，具体遗传转化步骤参照Hu等人在Engineering Non-transgenic Gynoecious Cucumber Using an Improved Transformation Protocol andOptimized CRISPR/Cas9 System.Mol Plant 10:1575-1578文章所描述。经过分化后的再生芽在体式荧光显微镜下进行GFP荧光阳性芽筛选，将获得的T0代阳性芽进行生根培养。植株经过驯化炼苗后，种植温室，通过人工授粉，收取后代种子。
3、基因CsHEC1编辑的黄瓜植株获得
将上述步骤2中的T0代植株在中国农业大学科技园温室进行繁殖后获得T1代种子，对于CRISPR/Cas9的育苗，T1代种子选取无GFP荧光的种子进行育苗(无GFP荧光说明载体已得到分离，获得不含转基因载体但被编辑的植株)。待幼苗第二片真叶长出时，采用经典的 CTAB方法进行基因组DNA的提取。CsHEC1基因采用实施例1中的引物CsHEC1-F和CsHEC1-R进行PCR扩增，得到的产物经凝胶电泳，紫外灯下观察有条带后，将不同株系的不同单株的PCR扩增凝胶产物进行桑格测序。根据测序公司结果与野生型(WT)的CsHEC1基因进行序列比对，进而对所获得的基因编辑植株完成基因型鉴定(图1，2)。图1的测序色谱图分析表明，利用CRISPR/Cas9系统成功的实现了对黄瓜CsHEC1基因的编辑，且获得两个完全突变体：Cshec1#1(纯合等位基因，靶点一缺失9bp，靶点二缺失4bp，103氨基酸)和Cshec1#2(纯合等位基因，靶点一缺失2bp，靶点二插入1bp，63氨基酸)，两者都提前产生终止密码子，最终导致截短的蛋白终产物，实现CsHEC1 基因的功能缺失(图2)。
4、基因CsHEC1编辑的黄瓜植株表型观察
上述步骤3获得的T2代黄瓜基因CsHEC1编辑的植株在温室种植和生长发育后，进行表型观察和拍照。结果如图3所示，与野生型植株果实相比较发现：Cshec1#1和Cshec1#2敲除植株的开花当天的果实(图3中A)和商品期的果实(图3中B，C)特征都表明瓜把长度明显变短。统计学分析发现，敲除植株与野生型植株的果实相比较，敲除体果实的瓜把长显著的下降(图3中D)，同时瓜长也一定程度上变短(图3中E)。于是，我们也对瓜把长/瓜长的比值进行了计算，统计结果表明Cshec1#1和Cshec1#2敲除果实的瓜把长/瓜长比值显著下降(图3中F)。以上结果表明基因CsHEC1正调控黄瓜瓜把长度的变化。
5、CsHEC1的过表达植株检测和表型观察
对于过表达植株的育苗，T1代种子需选取GFP荧光的种子进行育苗(GFP荧光说明过表达载体在植株中)。我们选取了代表性的三个株系的后代进行表型观察，首先对CsHEC1基因的过表达植株进行了 RNA和蛋白水平的检测。结果显示，三个过表达植株OE#2，OE#3，OE#4的RNA水平较野生型分别上升了约150、126和95倍(图4中A)。进一步通过免疫印迹分析了CsHEC1蛋白水平的变化，结果显示 CsHEC1蛋白在这3个过表达转基因株系中均有很高水平的积累(图4 中B)。进行表型观察发现，与WT相比，CsHEC1-OE的果实从开花当天(图5中A)到成熟期(图5中B和C)均表现出明显的瓜把伸长。详细的统计数据分析表明，CsHEC1-OE株系的瓜把长度同野生型相比增加了24-53％(图5中D)。而CsHEC1-OE株系的果实长度较野生型相比没有明显差异。此外，CsHEC1-OE株系的瓜把长/瓜长的比值较野生型也显著升高(图5中E)。
以上数据共同支持CsHEC1基因可以正调控黄瓜瓜把伸长，这为改良黄瓜短瓜把品种提供了基因资源和分子设计育种参考，有望加速黄瓜的品种改良。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> CsHEC1蛋白及其编码基因在降低果实瓜把长度中的应用
<130> KHP221113959.3
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagatta tgatgatgat gcaacaaatg gaaaaaatcc ctgaatttta caatgatttc 60
tcaccgccat cctctgattt cagctcaact accaccgatc acccacattg ccatttggat 120
tcctcttcat cgcctccatt attcatcaac aacaacagta acaacaacag caacaaccca 180
ccttataatt tcccccaaca atctactgtt ccattcccag gaacctccag ttcacggtgg 240
cgaaactccg gtagttgtga aacagagagt ttgcagaaac agaggtcggt agcggctatg 300
agggagatga tattcagaat agcagtgatg caaccaattc acatagaccc agaagcggtg 360
aagccaccaa aaagaagaaa cgtgaagatt tcaactgacc cacaaagtgt agcggctcga 420
cataggagag aaagaattag cgagagaatt agaatacttc aaagattagt ccctggaggt 480
actaaaatgg acactgcttc tatgttggat gaagctattc attatgttaa attcttaaaa 540
acccaagttc agtctcttga aagagccgcc gtttccgctg ggaaccgccc aatcaccggt 600
gttggtgcac ccagtagcgt tgggttccct ttggaaatgt caacgggaag ttacatccct 660
aatcatcatc aatcccaacc ttga 684
<210> 2
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaaaatg atgatttaaa atcggaagat cagatggaga ttatgatgat gatgcaacaa 60
atggaaaaaa tccctgaatt ttacaatgat ttctcaccgc catcctctga tttcagctca 120
actaccaccg atcacccaca ttgccatttg gattcctctt catcgcctcc attattcatc 180
aacaacaaca gtaacaacaa cagcaacaac ccaccttata atttccccca acaatctact 240
gttccattcc caggaacctc cagttcacgg tggcgaaact ccggtagttg tgaaacagag 300
agtttgcaga aacagaggtc ggtagcggct atgagggaga tgatattcag aatagcagtg 360
atgcaaccaa ttcacataga cccagaagcg gtgaagccac caaaaagaag aaacgtgaag 420
atttcaactg acccacaaag tgtagcggct cgacatagga gagaaagaat tagcgagaga 480
attagaatac ttcaaagatt agtccctgga ggtactaaaa tggacactgc ttctatgttg 540
gatgaagcta ttcattatgt taaattctta aaaacccaag ttcagtctct tgaaagagcc 600
gccgtttccg ctgggaaccg cccaatcacc ggtgttggtg cacccagtag cgttgggttc 660
cctttggaaa tgtcaacggg aagttacatc cctaatcatc atcaatccca acctggtacc 720
atggactaca aagacgatga cgataaagtc gagatggact acaaagacga tgacgataaa 780
gtcgagatgg actacaaaga cgatgacgat aaatag 816
<210> 3
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Asn Asp Asp Leu Lys Ser Glu Asp Gln Met Glu Ile Met Met
1               5                   10                  15
Met Met Gln Gln Met Glu Lys Ile Pro Glu Phe Tyr Asn Asp Phe Ser
            20                  25                  30
Pro Pro Ser Ser Asp Phe Ser Ser Thr Thr Thr Asp His Pro His Cys
        35                  40                  45
His Leu Asp Ser Ser Ser Ser Pro Pro Leu Phe Ile Asn Asn Asn Ser
    50                  55                  60
Asn Asn Asn Ser Asn Asn Pro Pro Tyr Asn Phe Pro Gln Gln Ser Thr
65                  70                  75                  80
Val Pro Phe Pro Gly Thr Ser Ser Ser Arg Trp Arg Asn Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Cys Glu Thr Glu Ser Leu Gln Lys Gln Arg Ser Val Ala Ala Met Arg
            100                 105                 110
Glu Met Ile Phe Arg Ile Ala Val Met Gln Pro Ile His Ile Asp Pro
        115                 120                 125
Glu Ala Val Lys Pro Pro Lys Arg Arg Asn Val Lys Ile Ser Thr Asp
    130                 135                 140
Pro Gln Ser Val Ala Ala Arg His Arg Arg Glu Arg Ile Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Arg Ile Leu Gln Arg Leu Val Pro Gly Gly Thr Lys Met Asp Thr
                165                 170                 175
Ala Ser Met Leu Asp Glu Ala Ile His Tyr Val Lys Phe Leu Lys Thr
            180                 185                 190
Gln Val Gln Ser Leu Glu Arg Ala Ala Val Ser Ala Gly Asn Arg Pro
        195                 200                 205
Ile Thr Gly Val Gly Ala Pro Ser Ser Val Gly Phe Pro Leu Glu Met
    210                 215                 220
Ser Thr Gly Ser Tyr Ile Pro Asn His His Gln Ser Gln Pro
225                 230                 235
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaaaatg atgatttaaa atcgg 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaaggttgg gattgatgat gat 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagaaacaga ggtcggtag 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtagttgagc tgaaatcag 19
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atatatggtc tcgattgcag aaacagaggt cggtaggtt 39
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcagaaaca gaggtcggta ggttttagag ctagaaatag c 41
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacctgattt cagctcaact accaatctct tagtcgactc tac 43
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attattggtc tcgaaacctg atttcagctc aactaccaa 39
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaatcgactc tagaaagctt atggaaaatg atgatttaaa atcgg 45
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctttgtagt ccatggtacc aggttgggat tgatgatgat t 41
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtcccagga ttagaatgat taggc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttaatccaaa ctactgcagc ctgac 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agccctcttc tttcgatcca tcaac 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcagaaatgg ataaatagcc ttgc 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatcggggaa attcgagctc 20

Claims (9)

1.CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控葫芦科植物果实瓜把中的应用；
所述CsHEC1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.CsHEC1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育不同瓜把长度的葫芦科植物中的应用；
所述CsHEC1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过抑制CsHEC1基因的表达降低葫芦科植物果实瓜把的长度。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因编辑技术抑制CsHEC1基因的表达。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，CsHEC1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述葫芦科植物为黄瓜属植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述葫芦科植物为黄瓜。
9.构建短瓜把黄瓜的方法，其特征在于，通过基因编辑技术抑制黄瓜中CsHEC1基因的表达；
所述CsHEC1基因编码的CsHEC1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243766A (zh) * 2007-02-14 2008-08-20 天津市绿丰园艺新技术开发有限公司 耐寒温室专用黄瓜新品种津绿3号的选育方法
CN113621037A (zh) * 2021-03-23 2021-11-09 中国农业大学 黄瓜CsHEC2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8445753B2 (en) * 2010-08-16 2013-05-21 Enza Zaden Beheer B.V. Cucumber hybrid Menfis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243766A (zh) * 2007-02-14 2008-08-20 天津市绿丰园艺新技术开发有限公司 耐寒温室专用黄瓜新品种津绿3号的选育方法
CN113621037A (zh) * 2021-03-23 2021-11-09 中国农业大学 黄瓜CsHEC2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
佚名."XP_004141382.1".《Genbank》.2019,全文. *
赵鹏等."黄瓜把长和瓜长的遗传分析".《 东北农业大学学报》.2012,第43卷(第01期),104-110. *
马娟等."黄瓜把长主基因＋多基因混合遗传分析".《西北农业学报》.2010,第19卷(第10期),161-165. *

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