CN111549057B - 一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法。本发明克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性状的产生；通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不育和滞绿两个表型连锁同步，通过观察乙烯利处理的叶片快速的筛选出雄性不育系，该方法方便、快捷、有效。本发明对于番茄雄性不育系的培育及番茄育种有重要意义。

Description

一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系 的方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法。

背景技术

番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中 国是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。番茄是 严格的闭花授粉作物，杂种优势明显，杂种优势是指在植物中两个遗传基础不同的品 种间或相近物种间进行杂交，其杂交一代在生长势、生活力、适应性和产量等性状上 优于其双亲的现象。杂种优势利用的关键在于发展和利用可以控制的授粉系统，以防 止自花授粉导致的自交衰退。为了保证杂交种的纯度，必须使母本丧失雄性功能。目 前主要采取的方法有人工或机械去雄、化学杀雄和采用雄性不育系做母本。人工去雄 是指在授粉期前人为的去除母本的雄花，需耗费大量人力物力，对于番茄等严格自花 授粉的作物，则更加困难。机械去雄和化学去雄对植物的正常生长影响较大。因此创 制雄性不育系可以降低成本、提高杂交种纯度，对杂交育种有着重要的意义。

雄性不育包括细胞质不育和核不育，细胞质不育不稳定易受环境影响，因此创制稳定的核不育系是雄性不育系的发展方向。随着分子生物学的发展，越来越多的核育 性基因被克隆出来，包括Lat52(Twell et al.,1989)、Ps-2(Gorguet et al.,2009)、Style 2.1(Chen et al.,2007)、Ms10-35(Jeong et al.,2014)、MPK20(Chen et al.,2018)、Ms15(Cao et al.,2019)、PIF3(CN 109456979 A)、LAP3(CN 109207505 A)等，这些基 因大多数没有被应用的原因包括：1)败育性不彻底，会导致杂交种不纯；2)没有有 效的保持系或可区分不育系和保持系的简易方法。

可见标记是指通过肉眼或者简单的处理可以有效的和对照株系进行区分的表型，包括叶片形状、叶片颜色、茎秆颜色、表皮绒毛、种子大小、种子绒毛等性状。连锁 可见标记是指该标记与目标基因紧密连锁，后代可以通过可见标记间接的判断目标基 因的基因型。

第三代基因编辑(CRISPR/Cas9)是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术， 通过人工构建的工程化核酸酶，对基因组目标区间序列特异性的识别与切割，产生双 链断裂，并通过细胞内源的同源重组或非同源末端连接DNA损伤修复机制，可以在 细胞活体基因组DNA序列中产生碱基缺失、插入、替换等修饰的技术(Hsuet et al., 2014)。基因编辑技术理论上可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标 性状的快速、精准改良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，基因编辑技术 还可以实现多基因同时突变，从而大大提高了多性状聚合的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系 的方法。

第一方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法A或方法B。

所述方法A包括如下步骤：降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量，得 到雄性不育植物；

所述方法B包括如下步骤：沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲除编码SlNP1蛋白的基因，得到雄性不育植物：

所述SlNP1蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)：

(A1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋 白质；

(A3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。

所述“降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量”为使SlNP1蛋白的氨基酸残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。

所述“沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲除编码SlNP1蛋白的基因”，为突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表 达量降低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。

所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。

所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。

第二方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法C或方法D。

所述方法C包括如下步骤：同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的 活性和/或含量，得到雄性不育植物；

所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白 的基因，得到雄性不育植物：

所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。

所述SlSGR1蛋白是如下(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(C2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与具有相同功能的蛋白质；

(C3)将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述“同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量”为使SlNP1蛋白的氨基酸残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止且使SlSGR1蛋白的氨 基酸残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。

所述“同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因 的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因”，为同时突 变番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白 的基因和编码SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因 和编码SlSGR1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。

所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.5。

所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。

第三方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码 SlNP1蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变；

所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。

所述保持系为第一方面中所述方法制备的不育植株的保持系。

所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。

所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。

第四方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：同时突变番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和 编码SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因和编码 SlSGR1蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变；

所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。

所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。

所述保持系为第二方面中所述方法制备的不育植株的保持系。

所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.5。

所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。

第五方面，本发明保护番茄雄性不育系扩繁的方法，为方法E或方法F。

所述方法E包括如下步骤：按照第一方面中所述方法制备番茄雄性不育植株，作为番茄雄性不育系；按照第三方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄性 不育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。

所述方法F为包括如下步骤：按照第二方面中所述的方法制备番茄雄性不育植株，作为番茄雄性不育系；按照第四方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄 性不育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。

所述方法F中，采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉后，对后代叶片进行乙烯利处理，通过肉眼观察叶片颜色选择区分不育系和保持系。

第六方面，本发明保护SlNP1蛋白或其相关生物材料在调控番茄育性或番茄育种中的应用；

所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)SlNP1蛋白的编码基因；

(2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质；

(3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白的活性和/或含量的物质；

所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。

所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为CRISPR/Cas9基因编辑载体。 所述基因编辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。

第七方面，本发明保护SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白联用或二者相关生物材料在培 育番茄不育系或番茄育种中的应用；

所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的编码基因；

(2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质；

(3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量的 物质；

所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。

所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。

所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为Cas9基因编辑载体。所述基 因编辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位和SEQ ID NO.5。

以上任一所述纯合突变为两条同源染色体都发生相同突变。

以上任一所述杂合突变为仅一条同源染色体发生所述突变。

以上任一所述编码SlNP1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。

以上任一所述编码SlSGR1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和 1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃， 在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中 杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后 用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

以上任一所述番茄具体可为番茄材料Ailsa Craig。

本发明具有以下明显的效果：1)克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性 状的产生；2)通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不育和滞绿两个 表型连锁同步，通过观察乙烯利处理的叶片快速的筛选出雄性不育系，该方法方便、 快捷、有效。

本发明对于番茄雄性不育系的培育及番茄育种有重要意义。

附图说明

图1为SlNP1基因的组织表达模式。

图2为育性基因验证载体和双基因敲除载体示意图。

图3为slnp1突变体基因型鉴定。

图4为slnp1突变体表型鉴定。

图5为双基因突变体基因型鉴定。

图6为可见标记表型鉴定。

图7为可见标记不育系扩繁策略示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

番茄材料Ailsa Craig：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

CPB载体记载于文献：Zhao et al.(2016).An alternative strategy fortargeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design.Scientificreports,6,23890.；公众 可以从潍坊兴旺生物种业有限公司获得。

实施例1、雄性不育基因的发现

经过大量序列分析及功能分析，筛选得到一个功能基因，将其命名为SlNP1，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1中，自5’端第269-341位为1号外显子， 第947-1588位为2号外显子，第2250-2641位为3号外显子，第3426-3991位为4号外显子， 第4687-4741位为5号外显子。该基因编码的蛋白质如SEQ ID NO.2所示。

实施例2、SlNP1基因表达模式研究

选取番茄材料Ailsa Craig的根、茎、叶、果实、雌蕊、萼片、花瓣、雄蕊(S1)、 雄蕊(S2)、雄蕊(S3)、雄蕊(S4)组织，提取总RNA进行反转录得到cDNA，以 cDNA为模板，使用UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒(康为世纪)进行RT-PCR。

用于检测SlNP1基因的引物如下：

RT-SlNP1-F：5’-ATCTGCACTTTCCGATCTCTCAC-3’；

RT-SlNP1-R：5’-AACGCCACTTTATTTTCCACCCA-3’；

用于检测内参基因的引物如下：

RT-UBI-F：5’-TGGTCGGAATGGGACAGAAG-3’；

RT-UBI-F：5’-CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3’。

RT-PCR的反应体系见表1。

表1

RT-PCR的反应程序如下：95℃10min；95℃15S，58℃1min，40个循环，采 集信号；融解曲线分析。

根据2^-ΔΔCt算法进行计算，得到育性基因SlNP1组织表达模式。结果如图1所示。 图1中，1-11依次为雄蕊(S1)、雄蕊(S2)、雄蕊(S3)、雄蕊(S4)、雌蕊、萼 片、花瓣、根、茎、叶和果实。结果显示，SlNP1基因在番茄雄蕊发育前期高效表达。

实施例3、SlNP1基因在创制雄性不育系中的应用

一、敲除载体载体的构建

以CPB载体为基础载体，参照Yan et al.,2015.High-efficiency genomeediting in Arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.Molecularplant,8(12), 1820-1823，将Cas9的启动子pUBI更换成pYao启动子，改造后的载体命名为YBK 载体。

根据靶位点综合效率及脱靶情况分析，选取SEQ ID NO.1自5’端第966-988位 为靶位点(SlNP1-Target)，构建敲除载体，用于验证SlNP1基因功能。

基于YBK载体和SlNP1-Target，设计引物如下：

SlNP1-U6-F：5’-CCTGTCAAACACTGATAGTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTG-3’；

SlNP1-U6-R：5’-GTGCTGTAGTTGCTTGGCGCAATCACTACTTCGACTCTAGC-3’；

SlNP1-sgRNA-F：5’-GCGCCAAGCAACTACAGCACGTTTCAGAGCTATGCTGGAAAC-3’；

SlNP1-sgRNA-R：5’-GTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3’。

以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为模板，采用SlNP1-U6-F和SlNP1-U6-R为引 物进行PCR扩增，得到片段(命名为：SlNP1-Target-U6)。

以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，以SlNP1-sgRNA-F和SlNP1-sgRNA-R 为引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：SlNP1-Target-sgRNA)。

以SlNP1-Target-U6和SlNP1-Target-sgRNA为模板进行重叠PCR，得到产物(命 名为：SlNP1-Target-U6-sgRNA)。

上述重叠PCR扩增的反应体系如表2所示，PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃ 15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。

表2中试剂来自KOD Plus，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：KOD-201。

表2

将YBK载体用限制性内切酶PmeⅠ酶切得到大片段YBK-PmeⅠ(约16876bp)，将 重叠PCR产物SlNP1-Target-U6-sgRNA和酶切大片段YBK-PmeⅠ用重组酶试剂盒 (pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit，全式金)进行重组，50℃重组15min， 然后转化测序得到敲除载体YBK-SlNP1-Target(载体重要元件结构示意图见如图2A)。 上述敲除载体包括RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子AtU6驱动的向导RNA、Yao启动子 驱动的Cas9核酸酶编码基因、35S启动子驱动的卡那霉素筛选基因。

二、番茄遗传转化

1、无菌外植体获得

番茄受体种子(Ailsa Craig，本发明同样适用于其他材料)于无菌水42℃浸泡2h，75％酒精消毒1min，10％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗4-5次，接种于MS培养基 中，25℃暗培养直至发芽，移至光照下培养1周。用刀切掉子叶远轴端及下胚轴，留 下近轴端为外植体。

2、农杆菌侵染

将上述质粒YBK-SlNP1-Target转化GV3101农杆菌感受态，挑取阳性菌落培养至对数中期，离心，用MS培养基悬浮至0D600值为0.2，将外植体浸泡悬浮液5min，25℃暗处理共培养(MS培养基：4.3g/L，蔗糖30g/L，玉米素1mg/L，1x尼许维生素， 0.8％琼脂)2天。

3、再生及筛选

将共培养后的外植体移至含15mg/L Hyg的再生培养基(MS培养基4.3g/L，蔗糖30g/L，玉米素2mg/L，100mg/L肌醇，1x尼许维生素，0.8％琼脂)中，每两周继代一 次直至长出抗性芽。

4、生根

将抗性芽移至生根培养基(MS培养基4.3g/L，蔗糖30g/L，1x尼许维生素，0.8％ 琼脂)中，约20天左右，将生根苗移至育苗钵中。

三、slnp1突变体表性鉴定

以上述番茄抗性芽发育成的抗性株的基因组DNA为模板，利用阳性鉴定引物Cas9-F：5’-TTCCAGAATGTCCTCGTTT-3’和Cas9-R：5’- CGGCACAGCATCAAGAA-3’进行PCR鉴定，将有1734bp条带的PCR阳性苗用Bar 试纸条进行复筛，获得番茄阳性株。

以上述阳性株DNA为模板，利用扩增引物SlNP1-F：5’-AGGTGTGACAATGCTTTGTAGTAAGT-3’和SlNP1-R：5’- GCGGTGCCGCCGCCGATGATTATGTA-3’进行PCR扩增，将PCR产物用限制性内 切酶MwoⅠ进行酶切，主条带类型为558bp的为对照株，主条带类型为610bp和558bp 的为杂合编辑株，主条带类型为610bp的为纯合编辑株。

T0代阳性株基因型鉴定如图3A所示，NP-1和NP-2为纯合突变株系，NP-3和NP-4 为杂合突变株系。NP-1和NP-2株系基因型如图3B所示，NP1-1株系经过编辑产生3 个碱基的缺失，未造成SlNP1编码氨基酸移码或提前翻译终止，NP1-2株系经过编辑 产生1个碱基的插入(在SEQ ID NO.1自5’端第982位和983位碱基之间插入A)， 造成了氨基酸移码并提前翻译终止。

slnp1突变体NP1-2表现为花粉完全败育(如图4所示，图4A和图4C为野生型 对照株，图4B和图4D为slnp1突变株NP1-2)，突变体因花粉败育无法坐果，只能 通过恢复系授粉才可以正常坐果结籽，且无其它不良性状(如图4所示，图4E为对 照株系正常坐果，图4F为slnp1突变株NP1-2，白色箭头为恢复系授粉所结果实)。

上述花粉活性检测方法为：收集花粉，用FDA进行处理，在激发波长495nm荧 光下，显绿色荧光及有活性，无绿色荧光及无活性。

所述恢复系为番茄材料Ailsa Craig。

结果表明本发明创制的slnp1突变体可以作为番茄雄性不育系用于杂交种生产。

实施例4、SlNP1基因紧密连锁标记的开发及应用

一、双基因敲除载体构建

番茄SlSGR1基因是绿色器官衰老或成熟的关键调控因子，SlSGR1基因与SlNP1 基因紧密连锁，可应用于番茄雄性不育系的培育。SlSGR1基因如SEQ ID NO.6(自5’ 端第189-305位碱基为第一外显子，第406-579位碱基为第二外显子，第1698-1865 位碱基为第三外显子，第2033-2392位碱基为第四外显子)所示，其编码的蛋白质如 SEQ ID NO.7所示。

根据靶位点综合效率及脱靶情况分析，选取SlSGR1基因上一个靶位点 SlSGR1-Target(SEQ ID NO.5)，以YBK-SlNP1-Target载体为基础，加入SlSGR1-Target 敲除元件构建双基因敲除载体，用于创制SlSGR1可见连锁标记的SlNP1雄性不育系。

基于SlSGR1-Target设计引物如下：

SlSGR1-U6-F：5’-CACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTT-3’；

SlSGR1-U6-R：5’-AGAACATATACACTGACTCCAATCACTACTTCGACTCTAGC-3’；

SlSGR1-sgRNA-F：5’-GGAGTCAGTGTATATGTTCTGTTTCAGAGCTATGCTGGAAA-3’；

SlSGR1-sgRNA-R：5’-TTCCCGCCTTCAGTTTAAACAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3’。

以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为模板，采用SlSGR1-U6-F和SlSGR1-U6-R 为引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：SlSGR1-Target-U6)。

以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，以SlSGR1-sgRNA-F和 SlSGR1-sgRNA-R为引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：SlSGR1-Target-sgRNA)。

以SlSGR1-Target-U6和SlSGR1-Target-sgRNA为模板进行重叠PCR，得到产物(命名为：SlSGR1-Target-U6-sgRNA)。

上述重叠PCR扩增的反应体系如表3所示，PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃ 15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。

表3

用PmeⅠ限制性内切酶酶切YBK-SlNP1-Target载体质粒，得到大片段 YBK-SlNP1-Target-PmeⅠ(约17281bp)，将重叠PCR产物SlSGR1-Target-U6-sgRNA 和酶切大片段YBK-SlNP1-Target-PmeⅠ用重组酶试剂盒(pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit，全式金)进行重组，50℃重组15min，然后转化测序得到敲除载体 YBK-SlNP1-SlSGR1-Target(载体重要元件结构示意图见如图2B)。

二、番茄遗传转化

利用双基因敲除载体YBK-SlNP1-SlSGR1-Target参照实施例3的方法进行番茄遗传转化。

三、突变体表性鉴定

采用实施例3中的方法鉴定得到番茄阳性株。

以上述番茄阳性株DNA为模板，以SlNP1-F和SlNP1-R为引物，进行扩增测序 鉴定SlNP1-Target位点基因型，以SlSGR1-F：5’-ACGGGCTCTTAAATAAACTTCT-3’ 和SlSGR1-R：5’-TTTACGCAACCTTAGTCCTACC-3’为引物，进行扩增测序鉴定 SlSGR1-Target位点基因型。T0代鉴定出双基因纯合突变株NG-1(如图5所示)， NG-1株系SlNP1-Target位点为插入1个碱基(在SEQ ID NO.1自5’端第982位和 983位碱基之间插入A)，SlSGR1-Target位点为缺失1个碱基(缺失SEQ ID NO.6自 5’端第504位碱基)，均造成了氨基酸移码及翻译提前终止。

取野生型对照株系WT和双基因突变株系NG-1叶片于器皿中，喷施500mg/L的 乙烯利，盖上盖子保湿于黑暗中处理72h，对照株系表现为叶绿素降解，叶片发黄， NG-1株系表现为叶绿素未降解，叶片浓绿(如图6所示)。因控制该可见表型的基因 SlSGR1与控制育性的基因SlNP1遗传上紧密连锁，该可见连锁标记可用不育系的筛 选。

实施例5、可见标记不育系扩繁策略

本发明创制的可见标记不育系解决了实际生产不育系扩繁过程中保持系与不育系 的筛选难题。可见标记不育系基因型为np1np1/sgr1sgr1(两条同源染色体均发生SlNP1和SlSGR1突变，为纯合突变)，保持系基因型为NP1np1/SGR1sgr1(仅一条同源染色 体发生SlNP1和SlSGR1突变，为杂合突变)，保持系花粉授给可见标记不育系，F1 代基因型为np1np1/sgr1sgr1和NP1np1/SGR1sgr1，其比例为1:1，通过对其叶片进行 乙烯利处理，肉眼观察叶片颜色可有效的区分不育系和保持系(如图7所示)。

序列表

<110> 潍坊兴旺生物种业有限公司

<120> 一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4900

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

actagtcatt ttctttcttc ctttatataa tttctccaaa tcactattat atagttctac 60

ttctttctca aatattcaag aaattcacaa ttcctgcatt ttcttgttcc ttaaaattat 120

atactgaaaa ttctattaag gaacattttg tgttttccaa attaattgcc gtccaaattg 180

tttgaatttt actatataac atcttttttt tctttctact tttccatcaa tcttaagatc 240

attaaatata ttaaattaat taaacaaaat ggagtttaat ttgattattg ctactcttct 300

tggaattttc ctctttcatg gattttgtac ttccgaaaaa ggtaaacaaa ttcttatagt 360

aatttagcaa tttcgtaaaa aaaaaaataa ttgataaatt ttatttcgtt aaaaatagaa 420

gaggtgtgac aatgctttgt agtaagtgaa cacttgtttc tgtttggcta gtaggaattt 480

ctagcatatt aacaaattaa tttaagttaa attggaattt atattttttt tataagttta 540

actttatatg tattgataac gtgaagaatt tttatattat taatgtaatt tcacctataa 600

tatgagtttt ttttcatata tatacaaatt attggttgaa acctacaact tttcttttat 660

actgttaaca atgtagttta acttgtaata ttgtagcaag ttaattactt gtaatttttg 720

taaaaataat ttgattgtgt aaatattctt tattctcttt ttttaatttg atataactga 780

catgttttat ttttcaatat gatagtatta tttttttagt taaataattt tttaagttaa 840

attggcttaa tattttaaaa ttgaagtttt tttatggcat gaaaattaaa ttcatttttg 900

tttagttaca aaaatttaaa cttttttttt ttgtataaac ttgcagctcc aaattactca 960

tttatgcgcc aagcaactac agcaccggag atatcacatt acgattacat aatcatcggc 1020

ggcggcaccg ctggctgccc attagccgcc acgctctctc agaactacga cgtacttcta 1080

ctagagcgcg gtggttcacc ttacggaaat cctaatatca catatttatc ggcattcgga 1140

tctgcacttt ccgatctctc accgaaatcg ccatctcagc gattcatctc cgaggacggt 1200

gtaatcaacg cgcgtgcacg cgttttgggc ggcggaagtt gtttaaacgc cggattttac 1260

tcacgcgccg gcacaaagta tgtgagcagc gttggatggg acggacaact cgtgaacgaa 1320

tcgtatgttt gggtggaaaa taaagtggcg tttcagccgc cggtgaggca gtggcagtcc 1380

gccgtgcgcg acggtcttgt ggagtcaggg gtggtgccgt acaatggatt tacgtacgat 1440

catattaatg gaactaaaat tgggggcacg attttcgatg ccgccggccg tcggcacacg 1500

gctgccgatc tacttgagta tgctaaacct agtggaatta cactactttt gcatgctacc 1560

gttcacaaaa tcatattcca aactagaggt acgtatcttc tcatgcgaat aaagaaaacg 1620

aaatccgttt tatttaagtg atactatttg actcgaaaca aaattatgat cgataaaggc 1680

ttgctatacc caaaaacccg ccctcaattg gctgaataca ttgtccgtga cattatggga 1740

gctagacttt tgacacgtat caagagtata tgacaattct ctgactataa aatattttac 1800

caagtgtaat atactttttc cgtctcaatt tatatgacat acttagtgtc tgtttggatt 1860

gacttatttt agctgcagtg tttgagtaaa attaaaaaat gtttaaaaca cttattttaa 1920

agccaaaata acaaaataat aagttagaaa tcctaactta ttgtttttgg cttataatca 1980

taagccaaaa gtgaatccaa acaagctttt tatcatttta gttagaagaa tgacatgttt 2040

ctacattggc aataatttaa ctttaaaata tttatattac atttaatcat gagatgatat 2100

gtagtcacac aaacaattat gactgtttaa actctgtgtc aagtcaggac agatggttac 2160

attgtttacg tgtgattaac taatgggagt tcattaattt atttctaata tatgattaag 2220

aaagtattac ttaaacaact tttttgcagg attatcaaga ccaaaagctc atggtgtaat 2280

atttagagat gcattaggaa aaaaacacac agcatattta agaagaggag aaatgaatga 2340

agtaatagta tcatctgggg cacttggaag cccacaaatg ttaatgttaa gtggtgtagg 2400

cccatcagaa cacttaaagg cccataacat tacagttgta ttggatcagc ccaatgttgg 2460

acaaaacatg atggataatc caatgaatgc aatatttgtg ccatcacctt tacctgttga 2520

agtttctctt atacaagttg tgggtattac aagatttgga acttatattg aagctgcctc 2580

cggcgagaat ttctccggtt atcgttctag tcggagtgat tatggaatgt tctccccgaa 2640

ggtaaatttt ttctcgtgat tttaagttat atatactgat gacatacata tattttagag 2700

tatcaagtta tctaatatat atatatatat atacgggtta tcattcgtga tatatagtag 2760

tagtgaccta taaaataaga taggtaactt atcataaaaa gttaaaagac attaccggta 2820

catataagtt aaatcttttt ctaatttgaa gttgtagtct ataatatggt atcaataaaa 2880

atctttctat ataatggcaa taaaatgatt taaacaattt tggaaccttg gtctagcaca 2940

aattaccagt atttagggaa gcgtgaagtg gaaaaaagcg ataaggcccc gcttcacgct 3000

ttgagcgctt cgtgaagtgt agaaggctcg catcgctaaa gagatgaagc gatcgctttc 3060

ctaaacaatg caaattattg ttctaatatt agcaaaaagt tactttgtaa attgattagt 3120

caaatacaaa ttgttaatct ttgaaaatac tttgtcaaaa tgaacttctg attaaatatt 3180

ttttttcaaa ataagtaaaa tttttggtca aacagattat taataatgaa aaattagaca 3240

ggctaaaaca catggtatat tattggtata cataagttat actacatact acaaaatgta 3300

tgtatattct tgtgaggccc aaactttctc taacttaata ttaaatgggc ctaagtgaag 3360

cccaatatag tccttgatgt ttatttgaac acaaaagttt acaaaaatag ccattttgtt 3420

tccagattgg tcagctatca acagtgccac caaagcaaag aacaccagaa gccttagaaa 3480

aggctataaa ttcaatgaat gcactagatg cagcagcatt tagaggagga ttcatattag 3540

aaaaaataat gggcccaata tccactggac atttggagct ccgaacccgg aacccgaatg 3600

acaacccatc agtaacattt aattatttca aagagccaga agatttacaa agatgtgtag 3660

atggactcaa aattatagaa aatataattg agtcaaaatc attttcacaa ttcagatatg 3720

actcaatttc attgccagca ttacttaatt tgactgcaag tgctccagtc aatttattgc 3780

ctaaacatga caatatttca gtctcattgg aacaattctg taaagatact gttatgacaa 3840

tttggcatta tcatggaggg tgtcaagttg gcaatgttgt tgatcaagat tataaggtta 3900

ttggtattga taatttgagg gttattgatg gttcaacttt taattattct cctggtacta 3960

atcctcaagc cactgtcatg atgcttggaa ggttagtatt tctactaatt tatactcttt 4020

ctgttctaat ttatgtaact gtttattttc tttttagtct gtctaaaaga atatgacatc 4080

atctttcaaa aggaactgtg tgttgaagga agctctaaca cgtcagtctg cttcgatgga 4140

catgttccat caatctttaa gcttccttca acactgtgga gtaacagtaa agttatctat 4200

aggtcatcgg ttcgagcaaa agtaacttac aaaagagtat tgacaccttt gaaaggaaat 4260

cttggagcaa caataaagtt gtctccacgt gatttgtagg tcactggttc gagctgtgga 4320

atcagtcatt gatgcttgca tcaaggttga ttctgtatat tatatatacg ccttaattga 4380

ggtgtggctc ttccctgaat tctcatgaac acgaaatgct tcgtgcacca caccatcttc 4440

tttcttcttg tttattcagg aaaagaacac attttttata tctattaaca agttaaaaaa 4500

tgatttatga ctacttgtag gtagggggat ctttcggttt aaaaattgtg ttcaatctaa 4560

tatactttgg ataaattgag atggagggat aagaattaat taaactatat accaaagtcc 4620

tataatttgt tgaaattaag atgtgatgat tactaaaata ttaccatttt tttggaaaat 4680

gtgcaggtat atgggagtaa ggatagtgaa tgagagactt gctaaagagg agtcaaatta 4740

attgataata aattcgtttc ttcttctttt gttatctttt gtttatgaat gagagtggat 4800

taattaagaa tatataatac gatgtaaaaa attgagttca ttctctgtaa taataatccc 4860

cataatttca gtaacaatat gttttaagct taattattga 4900

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Glu Phe Asn Leu Ile Ile Ala Thr Leu Leu Gly Ile Phe Leu Phe

1 5 10 15

His Gly Phe Cys Thr Ser Glu Lys Ala Pro Asn Tyr Ser Phe Met Arg

20 25 30

Gln Ala Thr Thr Ala Pro Glu Ile Ser His Tyr Asp Tyr Ile Ile Ile

35 40 45

Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Pro Leu Ala Ala Thr Leu Ser Gln Asn

50 55 60

Tyr Asp Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly Gly Ser Pro Tyr Gly Asn Pro

65 70 75 80

Asn Ile Thr Tyr Leu Ser Ala Phe Gly Ser Ala Leu Ser Asp Leu Ser

85 90 95

Pro Lys Ser Pro Ser Gln Arg Phe Ile Ser Glu Asp Gly Val Ile Asn

100 105 110

Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Cys Leu Asn Ala Gly Phe

115 120 125

Tyr Ser Arg Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ser Ser Val Gly Trp Asp Gly

130 135 140

Gln Leu Val Asn Glu Ser Tyr Val Trp Val Glu Asn Lys Val Ala Phe

145 150 155 160

Gln Pro Pro Val Arg Gln Trp Gln Ser Ala Val Arg Asp Gly Leu Val

165 170 175

Glu Ser Gly Val Val Pro Tyr Asn Gly Phe Thr Tyr Asp His Ile Asn

180 185 190

Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr Ile Phe Asp Ala Ala Gly Arg Arg His

195 200 205

Thr Ala Ala Asp Leu Leu Glu Tyr Ala Lys Pro Ser Gly Ile Thr Leu

210 215 220

Leu Leu His Ala Thr Val His Lys Ile Ile Phe Gln Thr Arg Gly Leu

225 230 235 240

Ser Arg Pro Lys Ala His Gly Val Ile Phe Arg Asp Ala Leu Gly Lys

245 250 255

Lys His Thr Ala Tyr Leu Arg Arg Gly Glu Met Asn Glu Val Ile Val

260 265 270

Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Pro Gln Met Leu Met Leu Ser Gly Val

275 280 285

Gly Pro Ser Glu His Leu Lys Ala His Asn Ile Thr Val Val Leu Asp

290 295 300

Gln Pro Asn Val Gly Gln Asn Met Met Asp Asn Pro Met Asn Ala Ile

305 310 315 320

Phe Val Pro Ser Pro Leu Pro Val Glu Val Ser Leu Ile Gln Val Val

325 330 335

Gly Ile Thr Arg Phe Gly Thr Tyr Ile Glu Ala Ala Ser Gly Glu Asn

340 345 350

Phe Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Arg Ser Asp Tyr Gly Met Phe Ser Pro

355 360 365

Lys Ile Gly Gln Leu Ser Thr Val Pro Pro Lys Gln Arg Thr Pro Glu

370 375 380

Ala Leu Glu Lys Ala Ile Asn Ser Met Asn Ala Leu Asp Ala Ala Ala

385 390 395 400

Phe Arg Gly Gly Phe Ile Leu Glu Lys Ile Met Gly Pro Ile Ser Thr

405 410 415

Gly His Leu Glu Leu Arg Thr Arg Asn Pro Asn Asp Asn Pro Ser Val

420 425 430

Thr Phe Asn Tyr Phe Lys Glu Pro Glu Asp Leu Gln Arg Cys Val Asp

435 440 445

Gly Leu Lys Ile Ile Glu Asn Ile Ile Glu Ser Lys Ser Phe Ser Gln

450 455 460

Phe Arg Tyr Asp Ser Ile Ser Leu Pro Ala Leu Leu Asn Leu Thr Ala

465 470 475 480

Ser Ala Pro Val Asn Leu Leu Pro Lys His Asp Asn Ile Ser Val Ser

485 490 495

Leu Glu Gln Phe Cys Lys Asp Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His

500 505 510

Gly Gly Cys Gln Val Gly Asn Val Val Asp Gln Asp Tyr Lys Val Ile

515 520 525

Gly Ile Asp Asn Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Thr Phe Asn Tyr Ser

530 535 540

Pro Gly Thr Asn Pro Gln Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met

545 550 555 560

Gly Val Arg Ile Val Asn Glu Arg Leu Ala Lys Glu Glu Ser Asn

565 570 575

<210> 3

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattcggagt ttttgtatct tgtttcatag tttgtcccag gattagaatg attaggcatc 60

gaaccttcaa gaatttgatt gaataaaaca tcttcattct taagatatga agataatctt 120

caaaaggccc ctgggaatct gaaagaagag aagcaggccc atttatatgg gaaagaacaa 180

tagtatttct tatataggcc catttaagtt gaaaacaatc ttcaaaagtc ccacatcgct 240

tagataagaa aacgaagctg agtttatata cagctagagt cgaagtagtg att 293

<210> 4

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac 60

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 92

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaagaacat atacactgac tca 23

<210> 6

<211> 2629

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 6

tgagccaaac gggctcttaa ataaacttct tcccaactct ctgtgaggac ttttatcaaa 60

cagctaactt gcaatttctt ttatatactt ttaacattca acaagattgt tttattactg 120

gaaatttcca gtaatattgg aactccaaga ttcaaggagt tttgggtacc caatttcttg 180

tagaaaaaat gggaactttg actacttctc tagtggttcc atctaagctc aacaatgaac 240

aacagagctc tatttttata cacaaaacta gaaggaaatg caagaagaat caatccatag 300

tacctgtaat taatttccac catctttttt cttcttctta agattcttct attggtttga 360

tattgtttac ttaatagttt ttatttgttt gttgaatgaa aataggtggc aaggttattt 420

ggaccagcta tatttgaagc ttcaaaattg aaggtacttt ttttgggagt tgatgaagaa 480

aagcatccag gaaagttgcc aagaacatat acactgactc atagtgatat tacttctaaa 540

cttactttgg ctatctccca aaccatcaat aattctcagg taatcaaata tttctcttta 600

gaaattttga tgacatatta ttctgtgtga gaaatagtcg aggtctatca gaaactctct 660

tttaaggtag gactaaggtt gcgtaaacac cactctcttc atactttaga gtctagccct 720

ttaatttaaa ttttgagttt atttctccaa tgatcactca aataataata gttattatct 780

cggaaaatta tttttcttgt cgattccaat tttcttcggc aaagaaagtt aataagataa 840

taattactat tagagtgaac cctttaaatt tggtggcaat aagaatatgg aggtccttga 900

ttagttgatc attcttctcg aattattagt tgaatgacta tttgaaaaat caaatcttta 960

atttggtggc aataagaata tggagttcct tgattagttg atcatacttc tctattccaa 1020

tttcctttgg caaagaaagt gactttacga gatactagta attattagtt gaatggttat 1080

ttgaaaaatc aactctttaa atttgatggc aataagaata tggaggtcct tgataagttg 1140

atcgttcttc tcgatttcaa tttccttcag caaagaaagt gatctgatga gataataatt 1200

attagttgaa taaccattag agaaatcaac ttcttacact tggtggcaat aagaatatgg 1260

gattcttgat tagttgatct tcatctattg ctgattcgga gtataggcga attcaagatt 1320

tgatctttat gagttttgaa ttttaggaca gcaaactcaa gtactagtaa cttggaattt 1380

gaatttgatt cttgtacata tttaatgaat ttctaaacat agggtctggg ccaaaactac 1440

taaattctac attcggtgga taatggatcc gtgccgtcta ttgttctcaa cttaaatact 1500

attatctaaa gcaatatcaa gctcatgacg catgtcgaaa tcccacacat cacatgctat 1560

acttttacca ctaaattatt agctgcatat tcatttagag aagttcgaaa atatgttttt 1620

tttaaatctt gaatctgcat ctacatcgta gtagaacttc tgttgagaaa agtggaaatg 1680

gtatgtttga tttgcagttg caaggttggt ataacagact tcaaagagat gaagttgttg 1740

cagagtggaa gaaagtaaaa gggaagatgt cacttcatgt ccattgccac attagtggag 1800

gccattttat gttagactta tttgctagac tcagaaacta catcttctgc aaagaactcc 1860

ctgtggtaag ttcataataa attgccacca tatctatgta tgtatgtcgt tcgaacttcc 1920

caaaattgtt attggtcctg tgtcagatcc ttcttttgga ggatcaaaca cacaaccata 1980

ggttaatagt accatatttt cataacttgt gtttttattt tgtttgcatt aggttctcaa 2040

ggcttttgtt catggagatg agaatttact aaggaattat ccagagttac aagaagcttt 2100

agtttgggta tattttcatt caaacattca agaattcaac aaagtagaat gttggggtcc 2160

actcagagat gcaacttccc cctcatcttc ttctggtggg gtaggtgggg tgaagagtac 2220

aagttttaca agcaatagca acaaaaaatg ggaattacca aagccttgtg aagaggcttg 2280

tgcctgttgc tttcccccag tgagtgttat gccttggctt tcttcaaatc ttgatggggt 2340

aggtgaggaa aatgggacca tccaacaagg cttgcaagag cagcaaagtt gaaaaaaatg 2400

agatagtgat tatgtttggt ttattatgtg atttgatgta attaactatt taattagttg 2460

tcattatagg gtttgtggaa gcagcattat ttatttggtt gaaatgtaaa taagaattca 2520

gaggtcatga ttaaagacaa gaacatcaag tttaggatgg tgatacataa ctatacaatt 2580

attgtaagtt gggttgtgcc taaatcaatg ttaaattttt ttcatgatt 2629

<210> 7

<211> 272

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 7

Met Gly Thr Leu Thr Thr Ser Leu Val Val Pro Ser Lys Leu Asn Asn

1 5 10 15

Glu Gln Gln Ser Ser Ile Phe Ile His Lys Thr Arg Arg Lys Cys Lys

20 25 30

Lys Asn Gln Ser Ile Val Pro Val Ala Arg Leu Phe Gly Pro Ala Ile

35 40 45

Phe Glu Ala Ser Lys Leu Lys Val Leu Phe Leu Gly Val Asp Glu Glu

50 55 60

Lys His Pro Gly Lys Leu Pro Arg Thr Tyr Thr Leu Thr His Ser Asp

65 70 75 80

Ile Thr Ser Lys Leu Thr Leu Ala Ile Ser Gln Thr Ile Asn Asn Ser

85 90 95

Gln Leu Gln Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Gln Arg Asp Glu Val Val Ala

100 105 110

Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Lys Met Ser Leu His Val His Cys His

115 120 125

Ile Ser Gly Gly His Phe Met Leu Asp Leu Phe Ala Arg Leu Arg Asn

130 135 140

Tyr Ile Phe Cys Lys Glu Leu Pro Val Val Leu Lys Ala Phe Val His

145 150 155 160

Gly Asp Glu Asn Leu Leu Arg Asn Tyr Pro Glu Leu Gln Glu Ala Leu

165 170 175

Val Trp Val Tyr Phe His Ser Asn Ile Gln Glu Phe Asn Lys Val Glu

180 185 190

Cys Trp Gly Pro Leu Arg Asp Ala Thr Ser Pro Ser Ser Ser Ser Gly

195 200 205

Gly Val Gly Gly Val Lys Ser Thr Ser Phe Thr Ser Asn Ser Asn Lys

210 215 220

Lys Trp Glu Leu Pro Lys Pro Cys Glu Glu Ala Cys Ala Cys Cys Phe

225 230 235 240

Pro Pro Val Ser Val Met Pro Trp Leu Ser Ser Asn Leu Asp Gly Val

245 250 255

Gly Glu Glu Asn Gly Thr Ile Gln Gln Gly Leu Gln Glu Gln Gln Ser

260 265 270

Claims (10)

1.番茄雄性不育植株的制备方法，为方法A或方法B；

所述方法A包括如下步骤：降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量，得到雄性不育植物；

所述方法B包括如下步骤：沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲除编码SlNP1蛋白的基因，得到雄性不育植物：

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或编码SlNP1蛋白的基因，为突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。

3.番茄雄性不育植株的制备方法，为方法C或方法D；

所述方法C包括如下步骤：同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量，得到雄性不育植物；

所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因，得到雄性不育植物：

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SlSGR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因”，为同时突变番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。

5.番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变；

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：同时突变番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变；

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SlSGR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.番茄雄性不育系扩繁的方法，为方法E或方法F；

所述方法E包括如下步骤：按照权利要求1或2所述的方法制备番茄雄性不育植株，作为番茄雄性不育系；按照权利要求5所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁；

所述方法F为包括如下步骤：按照权利要求3或4所述的方法制备番茄雄性不育植株，作为番茄雄性不育系；按照权利要求6所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法F中，采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉后，对后代叶片进行乙烯利处理，通过肉眼观察叶片颜色选择区分不育系和保持系。

9.SlNP1蛋白相关生物材料在调控番茄育性或番茄育种中的应用；

所述相关生物材料为如下(1)或(2)：

(1)用于沉默或抑制目的植物中SlNP1蛋白的编码基因的表达或敲除SlNP1蛋白的编码基因的物质；

(2)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白的活性和/或含量的物质；

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

10.SlNP1蛋白相关生物材料和SlSGR1蛋白相关生物材料在培育番茄不育系或番茄育种中的应用；

所述相关生物材料为如下(1)或(2)：

(1)用于沉默或抑制目的植物中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的编码基因的表达或敲除SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的编码基因的物质；

(2)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量的物质；

所述SlNP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SlSGR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

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