CN110402814A - 一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法。该方法包括如下步骤：向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；番茄隐性核雄性不育系的不育是由于花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；同时满足A1)、A2)和A3)的转基因番茄即为番茄隐性核雄性不育保持系；A1)雄性可育；A2)表达标记蛋白；A3)表达盒甲和表达盒乙插入番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体的同一位点。以上述保持系为父本，上述不育系为母本进行杂交；杂交后代中能够表达标记蛋白的株系为雄性可育的保持系，不能够表达标记蛋白的株系为不育系。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法

技术领域

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法。

背景技术

番茄(Solanumlycopersicum)属茄科番茄属，是一种重要的经济作物和模式植物，也是北京市种植面积最大和产值较高的茄果类蔬菜作物。加强番茄相关的基础研究和应用研究对于推进北京都市型现代农业建设具有重要意义。

番茄作为一种严格的自花授粉作物，其杂种优势明显，杂种整齐度高、抗逆性强，因此在生产上主要以杂交种为主。目前番茄的杂交制种主要以人工去雄授粉的方式进行。利用雄性不育系作为母本进行杂交种子生产，可省去人工去雄的过程，降低成本，提高杂种种子纯度以及避免亲本流失。因此番茄雄性不育系的选育显得尤为迫切和重要。

雄性不育(Male sterility)指有性繁殖过程中，由于生理或遗传上的原因造成植物的雌性器官正常，雄性器官不正常，不能产生花粉或花粉败育而不能授粉的现象。雄性不育主要分为细胞质不育和和细胞核不育两种类型(王超等，2013；杨莉芳等，2013；马西青等，2013)。早在上世纪30年代开始，人们就开始了番茄雄性不育的相关研究。迄今为止，全世界范围内共报道了50余份番茄雄性不育材料，均属于细胞核基因控制的“核不育类型”(Susan et al.，1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。这其中包括至少3份功能不育类型(花药不开裂或柱头外露)、6份结构不育类型(雄蕊退化或无雄蕊)和40余份花粉败育类型(花粉发育缺陷)。人们在自然资源中没有发现细胞质不育类型的番茄雄性不育材料，但通过用远缘杂交或基因工程等手段获得了一些细胞质雄性不育类型。自然资源中现有的各类番茄雄性不育材料各有优缺点，限制了在杂交制种中的应用。柱头外露类型虽自花传粉有困难，在群体种植情况下，容易发生邻株、邻花之间的传粉，因此天然自花传粉率较高，从不育系的角度来看，不能完全避免自交的可能性。花药不开裂类型基本上可避免自交的可能性，但因花柱短于雄蕊花药筒，仍需要人工辅助授粉。无雄蕊或雄蕊退化类型也可完全避免自交，但这类材料中的农艺性状一般较差，很难应用(Susan et al.，1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。目前人们在自然资源中发现的40余份花粉败育类型在番茄杂交制种中具有较大的应用潜力，但这类材料一般受一对隐性核基因控制，绝大多数基因尚未克隆(Susan et al.，1997；Jeong et al.，2014)，也限制了应用。综上所述，目前番茄中现有的各类雄性不育材料无法有效应用于杂交种子生产，番茄杂交制种仍主要以人工去雄授粉的方式进行。

发明内容

本发明的目的为选育番茄隐性核雄性不育保持系。

本发明首先保护番茄隐性核雄性不育恢复系的选育方法，可包括如下步骤：

(1)向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；

(2)完成步骤(1)后，挑选雄性可育且表达标记蛋白的转基因番茄进行自交，如果某个番茄株系的后代全部雄性可育且表达标记蛋白，则该番茄株系为番茄隐性核雄性不育恢复系。

本发明还保护番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，可包括如下步骤：向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；

同时满足A1)、A2)和A3)的转基因番茄即为番茄隐性核雄性不育保持系；A1)雄性可育；A2)表达标记蛋白；A3)表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体。

上述任一所述的方法中，所述表达盒甲和所述表达盒乙可以同时导入，也可以分别导入。

上述任一所述的方法中，当所述表达盒甲和所述表达盒乙同时导入时，“向番茄隐性核雄性不育系导入表达盒甲和表达盒乙”可为向番茄隐性核雄性不育系导入重组质粒；所述重组质粒可含有表达盒甲的核苷酸序列和表达盒乙的核苷酸序列。

上述任一所述的方法中，所述表达盒甲和所述表达盒乙均可为单拷贝插入。

上述任一所述的方法中，所述花粉育性蛋白可为Solyc03g053130蛋白；所述Solyc03g053130蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列13所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与番茄花粉育性相关的蛋白质。

上述任一所述的方法中，所述标记蛋白可为ANT1蛋白；所述ANT1蛋白可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列14所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述的方法中，所述表达盒甲从上游至下游依次可包括启动子、花粉育性蛋白的编码基因。所述启动子可为水稻基因组中Solyc03g053130基因的启动子。所述花粉育性蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1529至3137位所示(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)。所述表达盒甲还可包括终止子，所述终止子位于花粉育性蛋白的编码基因的下游。所述终止子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第3138至4153位所示。所述水稻可为番茄品系M82。

上述任一所述的方法中，所述表达盒乙从上游至下游依次可包括启动子、标记蛋白的编码基因。所述启动子可为35S启动子。所述表达盒乙还可包括终止子，所述终止子位于标记蛋白的编码基因的下游。所述标记蛋白可为紫色标记蛋白(如ANT1蛋白)。所述ANT1蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。

上述任一所述的方法中，表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体具体可为表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体的同一位点。

上述任一所述重组质粒具体可为重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3。重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3具体可为将载体pCAMBIA2300-35S-OCS的限制性内切酶KpnI和PstI之间的DNA小片段替换为序列表中序列10所示的DNA分子、向限制性内切酶HindIII之间插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。序列10为紫色标记基因(即ANT1基因)的核苷酸序列。序列1中，自5’末端起，第1至1528位为Solyc03g053130基因的启动子，第1529至3137位为Solyc03g053130基因(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)，第3138至4153位为番茄品系M82基因组中Solyc03g053130基因的下游序列。

上述任一所述番茄隐性核雄性不育系可为利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中编码Solyc03g053130蛋白的基因进行编辑，进而使Solyc03g053130蛋白功能丧失或不能表达Solyc03g053130蛋白得到的不育系；所述CRISPR/Cas9系统可包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列为序列2所示的DNA分子。

上述任一所述番茄隐性核雄性不育系的基因组中编码Solyc03g053130蛋白的基因的第1606位均为T。

所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体。所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。在本发明的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为pKSE401-sgRNA，其为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的BsaI的酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体。

所述受体番茄可为番茄Moneymaker。上述任一所述番茄隐性核雄性不育系可为Solyc03g053130纯合突变植株(T₀-3-6号单株)，其为将番茄Moneymaker的两条同源染色体的Solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(T)，且保持番茄Moneymaker的基因组其它序列不变后得到的植株。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的Solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，在第一外显子上发生移码突变，突变序列如序列表的序列9所示。

上述任一所述番茄雄性不育系是指番茄植株中花粉皱缩、败育，自交不能正常收获种子，而用其它正常番茄植株的花粉为其授粉可以收获种子。

上述任一所述的方法中，通过番茄的表型即可判断是否表达了标记蛋白。

本发明还保护番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，可为将上述任一所述方法选育的番茄隐性核雄性不育恢复系和所述番茄隐性核雄性不育系进行杂交，杂交后代即为番茄隐性核雄性不育保持系。

本发明还保护c1)或c2)。

c1)上述任一所述表达盒甲和/或上述任一所述表达盒乙。

c2)上述任一所述重组质粒。

本发明还保护d1)或d2)或d3)。

d1)上述任一所述的方法在番茄育种中的应用也属于本发明的保护范围。

d2)上述任一所述表达盒甲和/或上述任一所述表达盒乙在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用也属于本发明的保护范围。

d3)上述任一所述重组质粒在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系的不育系可为上述任一所述所述番茄隐性核雄性不育系。

上述任一所述花粉育性蛋白的表达被抑制具体可为在基因水平上，花粉育性蛋白的编辑基因或RNA被抑制。

实验证明，以本发明提供的方法选育的番茄隐性核雄性不育保持系为父本，番茄隐性核雄性不育系为母本进行杂交，获得的杂交后代中，能够表达标记蛋白的株系即为雄性可育的保持系；不能够表达标记蛋白的株系即为不育系。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为Solyc03g053130基因的结构图。

图2为实施例1步骤二中2的T₀代转基因植物的分子鉴定。

图3为实施例1步骤二中2的T₀代转基因植物的突变类型。

图4为实施例1中步骤三的T₁代转基因番茄单株的分子鉴定。

图5为Solyc03g053130纯合突变植株的测序峰图。

图6为Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力检测。

图7为Solyc03g053130纯合突变植株的育性检测。

图8为重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3的结构示意图。

图9为T₀代紫色纯合突变植株的花粉活力检测。

图10为T₁代紫色纯合突变植株的叶色表型。

图11为T₀代紫色纯合突变植株的育性检测。

图12为利用紫色保持系快速筛选雄性不育株的示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pKSE401载体和pMD18-T载体均为Addgene载体库(http://www.addgene.org/)的产品。引物为Thermo Fisher Scientific公司合成。测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。

番茄品系LA1996、番茄品系M82和番茄Moneymaker均来源于美国Tomato GeneticsResource Center番茄遗传资源中心，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基是将胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)、氯化钠(NaCl)和水混匀得到的培养基，其中，胰蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为10g/L、酵母提取物在LB液体培养基中的浓度为5g/L，氯化钠在LB液体培养基中的浓度为10g/L。

MS液体培养基：将4.4g MS盐(北京华越洋生物，货号为M519)、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，高压灭菌。

种子生长培养基(1/2MS培养基)：将2.2g MS盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加入0.8％的琼脂，高压灭菌。

预(共)培养培养基(D1培养基)：将4.4g MS、1.0mg玉米素(Zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

筛选分化培养基(2Z培养基)：将4.4g MS盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、100mg肌醇、0.5mg叶酸和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

生根培养基：将4.4g MS盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，用1mol/L KOH调pH至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

实施例1、Solyc03g053130纯合突变植株的获得

一、构建含Solyc03g053130基因特异sgRNA靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体

1、序列1为Solyc03g053130基因的核苷酸序列，其结构如图1所示，1-1528bp为启动子序列，1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列。将序列1所示Solyc03g053130基因序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz 1706genome SL2.50，进行CRIPSR/Cas9靶点设计。最终选定序列1第1601-1619位(第一外显子)的反向互补序列作为对Solyc03g053130基因进行编辑的sgRNA靶点序列。

Solyc03g053130基因sgRNA靶点序列如下：5’-gggaaagaagaaacaagtg-3’(序列2)。

2、合成包含上述sgRNA靶点序列的引物对Oligo-01F和Oligo-R，引物序列如下：

Oligo-01F：5’-attggggaaagaagaaacaagtg-3’(序列3)；

Oligo-R：5’-aaaccacttgtttcttctttccc-3’(序列4)。

3、将上述引物对Oligo-01F和Oligo-R退火，并与经过BsaI酶切的载体pKSE401连接，得到重组载体pKSE401-sgRNA。将重组载体pKSE401-sgRNA转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献“Xing,H.L.，Dong,L.，Wang,Z.P.，Zhang,H.Y.，Han,C.Y.，Liu,B.，Wang,X.C.，and Chen,Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9toolkit for multiplexgenome editing in plants.BMC plant biology 14:327.”中的方法。

测序结果表明：重组载体pKSE401-sgRNA为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的BsaI酶切位点间，且保持pKSE401载体的其它序列不变得到的载体。

重组载体pKSE401-sgRNA即为含Solyc03g053130基因特异sgRNA靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

4、挑选测序正确的克隆，提取质粒，并转化根癌农杆菌LBA4404(北京华越洋生物，NRR01270)，获得含有重组载体pKSE401-sgRNA的根癌农杆菌LBA4404-C1。

二、针对Solyc03g053130进行编辑的T₀代转基因植物的获得和分子鉴定

1、针对Solyc03g053130进行编辑的T₀代转基因植物的获得

(1)转化外植体的准备

挑选饱满、粒大的番茄Moneymaker种子，先用40％NaCl浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍，最后播种于种子生长培养基上，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。种子萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀迅速将子叶切成小方块，将小方块接种于预培养培养基中，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天，得到可用于番茄转化的子叶小方块。

(2)侵染液的准备

将根癌农杆菌LBA4404-C1接种于含卡那酶素和利福平的LB液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，得到培养菌液1。将培养菌液1接种至新的LB液体培养基中(接种比为1:100)，28℃、200rpm培养，得到OD_600nm值约为0.8的培养菌液2。取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体。取菌体，用MS液体培养基重悬，得到OD_600nm值为0.4的稀释液。

向50mL稀释液中加入50μL浓度为0.074mol/L的乙酰丁香酮溶液，得到侵染液。

(3)外植体的转化、筛选与生根

(3-1)取步骤(1)获得的可用于番茄转化的子叶小方块，浸入步骤(2)制备的侵染液10min。

(3-2)完成步骤(3-1)后，将所述子叶小方块接种于D1培养基上(D1培养基上放无菌滤纸)，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天。

(3-3)完成步骤(3-2)后，将所述子叶小方块转移至2Z培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)8周(每2周继代一次)，产生抗性芽。

(3-4)待步骤(3-3)中不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下并转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。将生根的T₀代转基因植株移入土中常规管理。

将其中5株T₀代转基因植株分别命名为1号转基因植物(简称T₀-1)、2号转基因植物(简称T₀-2)、3号转基因植物(简称T₀-3)、5号转基因植物(简称T₀-5)和7号转基因植物(简称T₀-7)。

2、T₀代转基因植物的分子鉴定

(1)提取待测番茄(番茄Moneymaker、T₀-1、T₀-2、T₀-3、T₀-5或T₀-7)叶片的基因组DNA。

(2)以步骤(1)得到的待测番茄叶片的基因组DNA为模板，采用CAS9-F：5’-tcaactgagcaaagacacct-3’(序列5)和CAS9-R：5’-ctcgtacagcagagagtgtt-3’(序列6)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，72℃延伸10min。

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

电泳结果见图2(1为T₀-1，2为T₀-2，3为T₀-3，5为T₀-5，7为T₀-7，WT为番茄Moneymaker)。结果表明，番茄Moneymaker的PCR扩增产物中无特异条带，T₀-1、T₀-2、T₀-3、T₀-5和T₀-7的PCR扩增产物中含有一条大小为673bp的条带。由此可见，T₀-1、T₀-2、T₀-3、T₀-5和T₀-7均含有CAS9转基因片段。

(4)以步骤(1)得到的待测番茄叶片的基因组DNA为模板，采用C1-F：5’-tctccgaccagttacgtgtgac-3’(序列7)和C1-R：5’-atgcctatcaacgatcctcacat-3’(序列8)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，72℃延伸10min。

(5)将步骤(4)得到的PCR扩增产物插入pMD18-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α，随机挑选20个阳性克隆测序。

将番茄Moneymaker、T₀-1、T₀-2、T₀-3、T₀-5和T₀-7的测序结果进行比对。部分比对结果见图3(WT为番茄Moneymaker)。结果表明，T₀-1、T₀-2、T₀-3、T₀-5和T₀-7中的目标区段(target)发生多种突变类型。选择在目标区段插入1个碱基的T₀-3进行后续分析。

三、Solyc03g053130纯合突变植株的获得

1、将T₀-3自交，收获T₁代转基因番茄种子。将T₁代转基因番茄种子播种于苗盘中，培养，得到T₁代转基因番茄单株。将其中15个单株依次命名为T₁-3-1至T₁-3-15。

2、分别提取处于两叶一心期的T₁代转基因番茄单株或番茄Moneymaker植株的基因组DNA。

3、分别以步骤2得到的植株叶片的基因组DNA为模板，采用CAS9-F和CAS9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、将步骤3得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

电泳结果见图4(WT为番茄Moneymaker)。结果表明，T₁-3-6、T₁-3-8、T₁-3-10和T₁-3-13均不含有CAS9转基因片段。

5、以不含有CAS9转基因片段的单株(如T₁-3-6、T₁-3-8、T₁-3-10或T₁-3-13)叶片的基因组DNA为模板，采用C1-F和C1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物纯化并测序，鉴定出目标区段插入1个碱基的Solyc03g053130纯合突变植株(两条同源染色体的Solyc03g053130基因发生了相同的突变)，即T₁-3-6单株(图5中的突变体T₁-3-6)，图中显示为靶点序列插入1个碱基(腺嘌呤A)。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的Solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(T)，在第一外显子上发生移码突变，Solyc03g053130基因的突变序列如序列表的序列9所示。

Solyc03g053130纯合突变植株(即T₁-3-6单株或突变体T₁-3-6)为将番茄Moneymaker的两条同源染色体的Solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(T)，且保持番茄Moneymaker的基因组其它序列不变后得到的植株。

实施例2、Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力和育性检测

一、Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力检测

1、试剂的配置

二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)母液：将10mg FDA溶于5mL丙酮中，分装至1.5mL离心管中，-20℃避光保存。

BK buffer S15MOPS(pH7.5)缓冲液：将5mL MOPS(100mM，pH7.5)、7.5g蔗糖、6.35μL Ca(NO₃)₂(1M)、4.05μL MgSO₄(1M)和5μL KNO₃(1M)溶于水中，然后用水定容至50mL。分装至1.5mL离心管中，-20℃避光保存。

2、花粉二乙酸荧光素染色及观察

(1)将1μL FDA母液加至1mL BK buffer S15MOPS缓冲液中，混匀，取1滴至洁净的载玻片上。

(2)用镊子从待测番茄植株(番茄Moneymaker植株或Solyc03g053130纯合突变植株)的花药中取少量花粉，置于混合液滴上，盖上盖玻片，利用荧光共聚焦显微镜在蓝光(波长495nm)下观察。

检测结果如图6所示(野生型为番茄Moneymaker植株，突变体为Solyc03g053130纯合突变植株)。从图中可以看出：与番茄Moneymaker植株的花粉相比，Solyc03g053130纯合突变植株的花粉体积小且皱缩；蓝光下，番茄Moneymaker植株的花粉呈绿色，而Solyc03g053130纯合突变植株的花粉无染色信号，说明Solyc03g053130纯合突变植株的花粉无活力。

二、Solyc03g053130纯合突变植株的育性检测

Solyc03g053130纯合突变植株无法自交结实。以番茄Moneymaker为父本，Solyc03g053130纯合突变植株为母本进行杂交，可以获得有活力的F1种子。而以番茄Moneymaker为母本，Solyc03g053130纯合突变植株为父本进行杂交，无法获得F1种子(图7)。说明Solyc03g053130纯合突变植株雄性不育，雌性正常。

实施例3、T₀代紫色纯合突变植株的获得

一、构建同时包含育性恢复基因表达盒和紫色标记基因表达盒的重组载体(即重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3)

重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3的结构示意图见图8(p35S为35S启动子，ANT1为紫色标记基因，导入ANT1基因的植物的植株(如叶片、茎)呈现紫色；pLAP3-LAP3为Solyc03g053130基因及其启动子)。

1、以番茄品系LA1996叶片的总RNA为模板，反转录，得到番茄品系LA1996的cDNA。

2、以番茄品系LA1996的cDNA为模板，采用2300-ANT1-F：5’-CGGGGTACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCA-3’(下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点)和2300-ANT1-R：5’-AACTG CAGTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTC-3’(下划线为限制性内切酶PstI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶KpnI和PstI酶切，回收约837bp的DNA片段。

4、取载体pCAMBIA2300-35S-OCS(Wu S，Yu Z，Wang F.2007.Cloning，characterization，and transformation of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene(ZmPEAMT1)in maize(Zea mays L.).Mol Biotechnol 36:102-112)，用限制性内切酶KpnI和PstI酶切，回收约9000bp的载体骨架。

5、将步骤3回收的DNA片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒pCAMBIA2300-35S-ANT1。

6、以番茄品系M82叶片的基因组DNA为模板，采用MS45-F6-wf：5’-CAATTTACTGATTGTCCAAGCTTGTAGATGTTCTTGTCATGATGAC-3’和MS45-R1-wf：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGTCATTGATATGCATTTCAAAACTC-3’组成的引物对进行PCR扩增，回收约4153bp的DNA片段。

7、采用In-fusion HD Cloning Kit(Clontech)将步骤6回收的DNA片段连入重组质粒pCAMBIA2300-35S-ANT1的限制性内切酶HindIII的识别位点，得到重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3。

将重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3为将载体pCAMBIA2300-35S-OCS的限制性内切酶KpnI和PstI之间的DNA小片段替换为序列表中序列10所示的DNA分子、向限制性内切酶HindIII之间插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

序列10为紫色标记基因(即ANT1基因)的核苷酸序列。

序列1中，自5’末端起，第1至1528位为Solyc03g053130基因的启动子，第1529至3137位为Solyc03g053130基因(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)，第3138至4153位为番茄品系M82基因组中Solyc03g053130基因的下游序列。

重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3表达Solyc03g053130蛋白和ANT1蛋白。Solyc03g053130蛋白的氨基酸序列如序列表中序列13所示。ANT1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列14所示。

8、将重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3转化根癌农杆菌LBA4404(北京华越洋生物，NRR01270)，获得含有重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3的根癌农杆菌LBA4404-B。

二、T₀代紫色纯合突变植株的获得

1、T₀代转基因植株的获得

(1)转化外植体的准备

以Solyc03g053130纯合突变植株为母本，番茄moneymaker为父本，进行杂交，得到杂交一代。将杂交一代进行自交，得到番茄雄性不育系F2群体。

挑选饱满、粒大的番茄雄性不育系F2群体的种子，先用40％NaCl浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍，最后播种于种子生长培养基上，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。种子萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀迅速将子叶切成小方块，将小方块接种于预培养培养基中，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天，得到可用于番茄转化的子叶小方块。

(2)侵染液的准备

将根癌农杆菌LBA4404-B接种于含卡那酶素和利福平的LB液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，得到培养菌液1。将培养菌液1接种至新的LB液体培养基中(接种比为1:100)，28℃、200rpm培养，得到OD_600nm值约为0.8的培养菌液2。取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体。取菌体，用MS液体培养基重悬，得到OD_600nm值为0.4的稀释液。

向50mL稀释液中加入50μL浓度为0.074mol/L的乙酰丁香酮溶液，得到侵染液。

(3)外植体的转化、筛选与生根

(3-1)取步骤(1)获得的可用于番茄转化的子叶小方块，浸入步骤(2)制备的侵染液10min。

(3-2)完成步骤(3-1)后，将所述子叶小方块接种于D1培养基上(D1培养基上放无菌滤纸)，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天。

(3-3)完成步骤(3-2)后，将所述子叶小方块转移至2Z培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)8周(每2周继代一次)，产生抗性芽。

(3-4)待步骤(3-3)中不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下并转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。将生根的T₀代转基因植株移入土中常规管理。

2、T₀代转基因植物的分子鉴定

待测番茄植株分别为Solyc03g053130纯合突变植株、番茄moneymaker植株和20株步骤1获得的叶色为紫色的T₀代转基因植株。

(1)提取待测番茄植株的基因组DNA。

(2)以待测番茄植株的基因组DNA为模板，采用Cl-JC-F1-1：5’-GCCTTGAACTTCCGGTATGGACTAGC-3’(序列11)和Cl-JC-R1-1：5’-TTCTTGTCTCCATGCCAACTTTCCATG-3’(序列12)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1845bpPCR扩增产物。然后用Cl-JC-R1-1对PCR扩增产物进行测序。

PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，35个循环，72℃延伸10min。

(3)将20株T₀代转基因植株的测序结果分别和番茄moneymaker植株的测序结果进行比对。选取两条同源染色体上的Solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶的纯合突变植株进行后续分析。

最终鉴定到5株Solyc03g053130纯合突变且叶色为紫色的T₀代转基因植物(即T₀代紫色纯合突变植株)，分别命名为T₀-1-1、T₀-2-2、T₀-3-3、T₀-4-4和T₀-5-5。

实施例4、T₀代紫色纯合突变植株的花粉活力及T₁代紫色纯合突变植株的叶色表型和育性检测

一、T₀代紫色纯合突变植株的花粉活力检测

(1)将1μL FDA母液加至1mL BK buffer S15MOPS缓冲液中，混匀，取1滴至洁净的载玻片上。

(2)用镊子从待测番茄植株(Solyc03g053130纯合突变植株、番茄Moneymaker植株、T₀-1-1、T₀-2-2、T₀-3-3、T₀-4-4或T₀-5-5)的花药中取少量花粉，置于混合液滴上，盖上盖玻片，利用荧光共聚焦显微镜在蓝光(波长495nm)下观察。

部分检测结果如图9所示(1为番茄Moneymaker植株，2为Solyc03g053130纯合突变植株，3为T₀-3-3，4为T₀-5-5)。结果表明，与番茄Moneymaker植株的花粉相比，Solyc03g053130纯合突变植株的花粉体积小且皱缩；蓝光下，番茄Moneymaker植株的花粉呈绿色，而Solyc03g053130纯合突变植株的花粉无染色信号，说明Solyc03g053130纯合突变植株的花粉无活力。相比而言，T₀-1-1、T₀-2-2、T₀-3-3、T₀-4-4和T₀-5-5的花粉活力与番茄Moneymaker植株的花粉没有差异。由此可见，重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3的导入恢复了Solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力。

二、T₁代紫色纯合突变植株的叶色表型和育性检测

1、将T₀-1-1自交，得到T₁-1-1种子。将T₀-2-2自交，得到T₁-2-2种子。将T₀-3-3自交，得到T₁-3-3种子。将T₀-4-4自交，得到T₁-4-4种子。将T₀-5-5自交，得到T₁-5-5种子。取常规培养生长4周的待测番茄植株(Solyc03g053130纯合突变植株、番茄Moneymaker植株、T₁-1-1、T₁-2-2、T₁-3-3、T₁-4-4或T₁-5-5)，观察叶色表型。

部分结果见图10(1为番茄Moneymaker植株，2为Solyc03g053130纯合突变植株，3为T₁-3-3，4为T₁-5-5)。结果表明，番茄Moneymaker植株和Solyc03g053130纯合突变植株的叶色为绿色，T₁-1-1、T₁-2-2、T₁-3-3、T₁-4-4和T₁-5-5的叶色为紫色。

2、将待测番茄植株(Solyc03g053130纯合突变植株、番茄Moneymaker植株、T₀-1-1、T₀-2-2、T₀-3-3、T₀-4-4或T₀-5-5)进行自交，观察。

部分结果见图11(1为番茄Moneymaker植株，2为T₀-3-3，3为T₀-5-5)。结果表明，番茄Moneymaker植株、T₀-1-1、T₀-2-2、T₀-3-3、T₀-4-4和T₀-5-5均可以自交结实；Solyc03g053130纯合突变植株无法自交结实。

上述结果表明，重组质粒pCAMBIA2300-p35S-ANT1-pLAP3-LAP3的导入恢复了Solyc03g053130纯合突变植株的雄性育性。

实施例5、紫色保持系的制备

1、将T₀-1-1自交，得到T₁-1-1种子。将T₀-2-2自交，得到T₁-2-2种子。将T₀-3-3自交，得到T₁-3-3种子。将T₀-4-4自交，得到T₁-4-4种子。将T₀-5-5自交，得到T₁-5-5种子。

2、将50粒T₁代转基因番茄种子(T₁-1-1种子、T₁-2-2种子、T₁-3-3种子、T₁-4-4种子或T₁-5-5种子)播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。如果叶色为紫色的植株数和叶色为绿色的植株数约为3:1，则相应的T₀代紫色纯合突变植株为单拷贝插入。

结果表明，T₁-3-3种子和T₁-4-4种子获得的植株(分别命名为T₁-3-3植株和T₁-4-4植株)中，叶色为紫色的植株数和叶色为绿色的植株数约为3:1。因此，T₀-3-3和T₀-4-4均为转基因插入单拷贝的株系。

3、取T₁-3-3中叶色为紫色的植株，继续自交，得到T₂-3-3种子。取T₁-4-4中叶色为紫色的植株，继续自交，得到T₂-4-4种子。

4、将50粒T₂代转基因番茄种子(T₂-3-3种子或T₂-4-4种子)播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。如果苗盘中的植物叶色均为紫色，则苗盘中的植物即为纯合恢复系转基因植物。

5、将纯合恢复系转基因植物和Solyc03g053130纯合突变植株(即Solyc03g053130纯合突变不育系)杂交，杂交后代即为Solyc03g053130纯合突变不育系的紫色保持系。

6、以紫色保持系为父本，Solyc03g053130纯合突变不育系为母本，杂交，得到杂交F1代。将杂交F1代的种子播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。其中叶色为紫色的为紫色保持系，叶色为绿色的为非转基因的雄性不育系(与Solyc03g053130纯合突变不育系完全一致)。

利用紫色保持系快速筛选雄性不育株(即Solyc03g053130纯合突变不育系)的示意图见图12。

<110> 北京市农林科学院 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>4153

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>1

gtagatgttc ttgtcatgat gacttccagg ttttgggaat aatagatgtt gaatattgat 60

agttattgaa ttggttttta ttaatgagtt taagtcttcc gcattacttt ttgttgttat 120

tacattgaaa tgttaaggtt tagattggtt ggttcgctca cataggaggg taagtgtggg 180

tgccagtcgc ggcccggatt tgggtcgtga cataaaggtt gggactggtt catgtaaatt 240

ctgttggttg tttgacgcta ctattttaag tatttctata cttagtcaat ttttgtgggt 300

gcaagtaggc tgagtgttac agacgtttgt aagactgcct agagtggtgt gcgataaaaa 360

taatcgaccc tctttcagat agcgttgcag tatgtgttgc ttcttttttt ttttgcaggg 420

acaatccgta gttgttgact ccgtcatttt ttaaactcgg tttagtagtg aaaactgaaa 480

actcagttta ggtaacatga gatcctttat ctaaaattcc cagtttctaa ctttgctttc 540

atcttcaaat gataaataga gtgttagatt catgaagtaa tcatggattc aagttagaat 600

cacttaactc aatcttgtgg gtgaaaatca agaacagaat gtcaaatgaa attactcaaa 660

tgaagggctg gtttgttcaa cttgaaccac gggtgaattg aaatagccat ctatcatttt 720

ctttcagtac tctcgttatg atttccagct acgtcccatg ctatgtatta aaatgattag 780

tagttctatg acttaggcct catttgttta cacttgatga agtttgaaac tcaatcattc 840

acacattggg ctattaagtg cattttaaaa aaaaatcaaa tctgaaagca tctctatgag 900

agagtcttat catgtttacc atggatgttt ctcttaattg gtagtggttc gagggatgcc 960

atgtcacaac gttaagtttc agatttgggt tgtggaatat gttgaaacca agttcctatt 1020

tcggccttgg tttgtttagt tggttcagcg caatctgttt agtttgatcc tacatgagta 1080

gacttggtcc aacagcccat atttatgtga attttcagat tccttttatt gtactgcatt 1140

tgtgtctaaa tataaatagt atatactata gtcaatttta cgagctgacg ttacctattc 1200

ctcttctctc atttaaaaca agtaatctta tttacttgat gagtgtcgta gtttgaatga 1260

tgatctaact catagaacaa atggttgctg ctcactatca tattggaatt gaccaaaaaa 1320

ataaatgaat gcaccttctg atttcattat tatcaataac aagtaggaat gcagaaaaca 1380

tgactaacaa atggacaact tacttctaac aacaagtgga tcacaaacat tgtgtgtctt 1440

ccttcatcct ataacattgt gaaatcttac atttccagtt taaacagctt aaatttcagc 1500

atccatattc cccaccttcc tgccaccgat gcctatcaac gatcctcaca tggagaagag 1560

gatccaattg ataagaagcc agcttgtttc acaacgtcct cacttgtttc ttctttccct 1620

agcctttgct ttccttgtgg cagatccatt tggtttaagt ccagtagggg acactgactt 1680

taatccagta aagaatgaca ttgcaccata caaacaagtc atggaaagtt ggcatggaga 1740

caagaataat cggttaggcc tcggcaatct ggagtttgtt aatgaaattt acggtcctga 1800

atcattagaa tttgatattt tgggtcatgg cccatatgcc ggactagctg atgggcgtat 1860

tgtacggtgg atgggggagg atgctggttg ggaaacattt gcagtcgtca cacgtaactg 1920

gtaagcatct gaattatata cctttatgga catattgaat atgttgtgaa gatggatata 1980

attgcaatgt atttttgttt aggaagtggg aggatagagt gtatatatat atactctata 2040

gtattattct tttaaatttc atttatctcc ctgtcgttgt cgtataaggt cggagaagct 2100

ttgtgctaaa ggaaaggatt caacaacacc taagcaatat agagttgagc cagaatgtgg 2160

caggcccctt gggctaaggt tcaataaaca gacaggggat ttgtacatag cagatgcata 2220

ctatggactc ctagttgtgg gtcctgaagg aggcgtggca acgtccttgg ctacacatgt 2280

tgaagggaaa cgaatactct tcgccaacga ccttgatatc catacaaatg gctccatctt 2340

cttcacagac actagcaaga aatacaacag agtgtaggtt aacaaatctt ttttttatca 2400

aatactacaa ttgtagtggt ttatattact cttctttcat tatataaatt tcttatgtag 2460

gaaccatttt ctcataatgt tagaaggaga agacagtggt agacttctta ggtatgatat 2520

tgctacgaaa tctactaatg ttgtcttgga tggattgacg ttccctaacg gagtacaatt 2580

atccaaggat caaacttttc ttctcttcac tgaaacaacc aattgcaggt atccatcatc 2640

cctctacaag tgtttgttta attcagacgt aaatcaccta aacgtgtaat tcaccgagac 2700

aacaaatatt ataaatacct tgctgttata tgttcaggct gatgaaatac tggatagaag 2760

gtccaaagag agggatagtt gagattgttg caaaccttcc aggatttcca gacaacgtaa 2820

gggtgaacga aaaaggtcaa ttctgggttg caatagattg ttgtcgaact cgtgcacaag 2880

aagtgctgat aaataatcca tggatgagaa gcatttactt tagattaccg attcagatgc 2940

gttacctggc tagattgatg gggatgaaaa tgtacactgt tatatcactc ttcaatgaaa 3000

atggagaaat tattgatgtt cttcaagata aaaaaggtgt agttatgaag ttggttagtg 3060

aagttagaga agtaaatggc aagctatgga ttgggactgt ggctcataac catattgcta 3120

cccttccata cccataaata aaactacgtt ttgccttccc ttttttttat aaattaattt 3180

tgcaatctta gtctggcttc cttcatttat gtgtaacaaa actaatgaat aataccccaa 3240

cacttgttta acccattctt cacatatttt tttatactag tcttagaaac gtgcgttgca 3300

agtttgatcc ctactattat ataaaactta tataagccta acttcataga tataaaaatg 3360

atcgcgttta ctaattaagc tgttaacatc ccaaaagatt gattgcagtc tccttgaaga 3420

taccaacatg ccttctctca ttgcaacctc cattagaagt agtaagaatt tgtacactat 3480

atattttgtt tctgtaagca acaaaagaat atatgagtaa taaagtgctt atttttataa 3540

gaaaaaagct aaacctaata atagtgaaag ataaaaccaa cagaaatata gtgacagtta 3600

gagatggaac tttttttgtt tcttccaagt gggaaaaagt ctcttcataa tgtatacaat 3660

gacaccattt ataggatatg attaagtaaa atcaaagagt gttttaaata tgacattaat 3720

ttcttgagaa tgtggaaaag tttatacaag tgtgaaagat taatgaggag atagtcaagg 3780

tgtatagtat taatacacat aacgaaaaaa aattgaccta gaaattattg agttgcattt 3840

ttaaacaata tatttacaat aacgttgtag tattttattt ttttatattt tgcatctgat 3900

ggagaaatga aaactttttt aagagccttt actaatatta taattaattg tttttacaat 3960

acttcatttt tgtattttat tatatcaaaa taagtgaatt ataaatatca gatttctgta 4020

aatgaagaaa gtgtaatggg atgataaagt gttaaagtat atatttagtg aaagctttat 4080

taagaagaca aacatgcaaa tattaatcta aaaattcaat tctatattga gttttgaaat 4140

gcatatcaat gac 4153

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>2

gggaaagaag aaacaagtg 19

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>3

attggggaaa gaagaaacaa gtg 23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>4

aaaccacttg tttcttcttt ccc 23

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>5

tcaactgagc aaagacacct 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>6

ctcgtacagc agagagtgtt 20

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>7

tctccgacca gttacgtgtg ac 22

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>8

atgcctatca acgatcctca cat 23

<210>9

<211>4154

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>9

gtagatgttc ttgtcatgat gacttccagg ttttgggaat aatagatgtt gaatattgat 60

agttattgaa ttggttttta ttaatgagtt taagtcttcc gcattacttt ttgttgttat 120

tacattgaaa tgttaaggtt tagattggtt ggttcgctca cataggaggg taagtgtggg 180

tgccagtcgc ggcccggatt tgggtcgtga cataaaggtt gggactggtt catgtaaatt 240

ctgttggttg tttgacgcta ctattttaag tatttctata cttagtcaat ttttgtgggt 300

gcaagtaggc tgagtgttac agacgtttgt aagactgcct agagtggtgt gcgataaaaa 360

taatcgaccc tctttcagat agcgttgcag tatgtgttgc ttcttttttt ttttgcaggg 420

acaatccgta gttgttgact ccgtcatttt ttaaactcgg tttagtagtg aaaactgaaa 480

actcagttta ggtaacatga gatcctttat ctaaaattcc cagtttctaa ctttgctttc 540

atcttcaaat gataaataga gtgttagatt catgaagtaa tcatggattc aagttagaat 600

cacttaactc aatcttgtgg gtgaaaatca agaacagaat gtcaaatgaa attactcaaa 660

tgaagggctg gtttgttcaa cttgaaccac gggtgaattg aaatagccat ctatcatttt 720

ctttcagtac tctcgttatg atttccagct acgtcccatg ctatgtatta aaatgattag 780

tagttctatg acttaggcct catttgttta cacttgatga agtttgaaac tcaatcattc 840

acacattggg ctattaagtg cattttaaaa aaaaatcaaa tctgaaagca tctctatgag 900

agagtcttat catgtttacc atggatgttt ctcttaattg gtagtggttc gagggatgcc 960

atgtcacaac gttaagtttc agatttgggt tgtggaatat gttgaaacca agttcctatt 1020

tcggccttgg tttgtttagt tggttcagcg caatctgttt agtttgatcc tacatgagta 1080

gacttggtcc aacagcccat atttatgtga attttcagat tccttttatt gtactgcatt 1140

tgtgtctaaa tataaatagt atatactata gtcaatttta cgagctgacg ttacctattc 1200

ctcttctctc atttaaaaca agtaatctta tttacttgat gagtgtcgta gtttgaatga 1260

tgatctaact catagaacaa atggttgctg ctcactatca tattggaatt gaccaaaaaa 1320

ataaatgaat gcaccttctg atttcattat tatcaataac aagtaggaat gcagaaaaca 1380

tgactaacaa atggacaact tacttctaac aacaagtgga tcacaaacat tgtgtgtctt 1440

ccttcatcct ataacattgt gaaatcttac atttccagtt taaacagctt aaatttcagc 1500

atccatattc cccaccttcc tgccaccgat gcctatcaac gatcctcaca tggagaagag 1560

gatccaattg ataagaagcc agcttgtttc acaacgtcct cactttgttt cttctttccc 1620

tagcctttgc tttccttgtg gcagatccat ttggtttaag tccagtaggg gacactgact 1680

ttaatccagt aaagaatgac attgcaccat acaaacaagt catggaaagt tggcatggag 1740

acaagaataa tcggttaggc ctcggcaatc tggagtttgt taatgaaatt tacggtcctg 1800

aatcattaga atttgatatt ttgggtcatg gcccatatgc cggactagct gatgggcgta 1860

ttgtacggtg gatgggggag gatgctggtt gggaaacatt tgcagtcgtc acacgtaact 1920

ggtaagcatc tgaattatat acctttatgg acatattgaa tatgttgtga agatggatat 1980

aattgcaatg tatttttgtt taggaagtgg gaggatagag tgtatatata tatactctat 2040

agtattattc ttttaaattt catttatctc cctgtcgttg tcgtataagg tcggagaagc 2100

tttgtgctaa aggaaaggat tcaacaacac ctaagcaata tagagttgag ccagaatgtg 2160

gcaggcccct tgggctaagg ttcaataaac agacagggga tttgtacata gcagatgcat 2220

actatggact cctagttgtg ggtcctgaag gaggcgtggc aacgtccttg gctacacatg 2280

ttgaagggaa acgaatactc ttcgccaacg accttgatat ccatacaaat ggctccatct 2340

tcttcacaga cactagcaag aaatacaaca gagtgtaggt taacaaatct tttttttatc 2400

aaatactaca attgtagtgg tttatattac tcttctttca ttatataaat ttcttatgta 2460

ggaaccattt tctcataatg ttagaaggag aagacagtgg tagacttctt aggtatgata 2520

ttgctacgaa atctactaat gttgtcttgg atggattgac gttccctaac ggagtacaat 2580

tatccaagga tcaaactttt cttctcttca ctgaaacaac caattgcagg tatccatcat 2640

ccctctacaa gtgtttgttt aattcagacg taaatcacct aaacgtgtaa ttcaccgaga 2700

caacaaatat tataaatacc ttgctgttat atgttcaggc tgatgaaata ctggatagaa 2760

ggtccaaaga gagggatagt tgagattgtt gcaaaccttc caggatttcc agacaacgta 2820

agggtgaacg aaaaaggtca attctgggtt gcaatagatt gttgtcgaac tcgtgcacaa 2880

gaagtgctga taaataatcc atggatgaga agcatttact ttagattacc gattcagatg 2940

cgttacctgg ctagattgat ggggatgaaa atgtacactg ttatatcact cttcaatgaa 3000

aatggagaaa ttattgatgt tcttcaagat aaaaaaggtg tagttatgaa gttggttagt 3060

gaagttagag aagtaaatgg caagctatgg attgggactg tggctcataa ccatattgct 3120

acccttccat acccataaat aaaactacgt tttgccttcc ctttttttta taaattaatt 3180

ttgcaatctt agtctggctt ccttcattta tgtgtaacaa aactaatgaa taatacccca 3240

acacttgttt aacccattct tcacatattt ttttatacta gtcttagaaa cgtgcgttgc 3300

aagtttgatc cctactatta tataaaactt atataagcct aacttcatag atataaaaat 3360

gatcgcgttt actaattaag ctgttaacat cccaaaagat tgattgcagt ctccttgaag 3420

ataccaacat gccttctctc attgcaacct ccattagaag tagtaagaat ttgtacacta 3480

tatattttgt ttctgtaagc aacaaaagaa tatatgagta ataaagtgct tatttttata 3540

agaaaaaagc taaacctaat aatagtgaaa gataaaacca acagaaatat agtgacagtt 3600

agagatggaa ctttttttgt ttcttccaag tgggaaaaag tctcttcata atgtatacaa 3660

tgacaccatt tataggatat gattaagtaa aatcaaagag tgttttaaat atgacattaa 3720

tttcttgaga atgtggaaaa gtttatacaa gtgtgaaaga ttaatgagga gatagtcaag 3780

gtgtatagta ttaatacaca taacgaaaaa aaattgacct agaaattatt gagttgcatt 3840

tttaaacaat atatttacaa taacgttgta gtattttatt tttttatatt ttgcatctga 3900

tggagaaatg aaaacttttt taagagcctt tactaatatt ataattaatt gtttttacaa 3960

tacttcattt ttgtatttta ttatatcaaa ataagtgaat tataaatatc agatttctgt 4020

aaatgaagaa agtgtaatgg gatgataaag tgttaaagta tatatttagt gaaagcttta 4080

ttaagaagac aaacatgcaa atattaatct aaaaattcaa ttctatattg agttttgaaa 4140

tgcatatcaa tgac 4154

<210>10

<211>825

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>10

atgaacagta catctatgtc ttcattggga gtgagaaaag gttcatggac tgatgaagaa 60

gattttcttt taagaaaatg tattgataag tatggtgaag gaaaatggca tcttgttccc 120

ataagagctg gtctgaatag atgtcggaaa agttgtagat tgaggtggct gaattatcta 180

aggccacata tcaagagagg tgactttgaa caagatgaag tggatctcat tttgaggctt 240

cataagctct taggcaacag atggtcactt attgctggta gacttccagg aaggacagct 300

aacgatgtga aaaactattg gaacactaat cttctaagga agttaaatac tactaaaatt 360

gttcctcgtg aaaagactaa caataagtgt ggagaaatta gtactaagat tgaaattata 420

aaacctcaac cacgaaagta tttctcaagc acaatgaaga atattacaaa caatattgta 480

attttggacg aggaggaaca ttgcaaggaa ataaaaagtg agaaacaaac tccagatgca 540

tcgatggaca acgtagatca atggtggata aatttactgg aaaattgcaa tgacgatatt 600

gaagaagatg aagaggttgt aattaattat gaaaaaacac taacaagttt gttacatgaa 660

gaaaaatcac caccattaaa tattggtgaa ggtaactcca tgcaacaagg acaaataagt 720

catgaaaatt ggggtgaatt ttctcttaat ttacaaccca tgcaacaagg agtacaaaat 780

gatgattttt ctgctgaaat tgacttatgg aatctacttg attaa 825

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>11

gccttgaact tccggtatgg actagc 26

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213> Artificial sequence

<400>12

ttcttgtctc catgccaact ttccatg 27

<210>13

<211>414

<212>PRT

<213> Artificial sequence

<400>13

Met Pro Ile Asn Asp Pro His Met Glu Lys Arg Ile Gln Leu Ile Arg

1 5 10 15

Ser Gln Leu Val Ser Gln Arg Pro His Leu Phe Leu Leu Ser Leu Ala

20 25 30

Phe Ala Phe Leu Val Ala Asp Pro Phe Gly Leu Ser Pro Val Gly Asp

35 40 45

Thr Asp Phe Asn Pro Val Lys Asn Asp Ile Ala Pro Tyr Lys Gln Val

50 55 60

Met Glu Ser Trp His Gly Asp Lys Asn Asn Arg Leu Gly Leu Gly Asn

65 70 75 80

Leu Glu Phe Val Asn Glu Ile Tyr Gly Pro Glu Ser Leu Glu Phe Asp

85 90 95

Ile Leu Gly His Gly Pro Tyr Ala Gly Leu Ala Asp Gly Arg Ile Val

100 105 110

Arg Trp Met Gly Glu Asp Ala Gly Trp Glu Thr Phe Ala Val Val Thr

115 120 125

Arg Asn Trp Ser Glu Lys Leu Cys Ala Lys Gly Lys Asp Ser Thr Thr

130 135 140

Pro Lys Gln Tyr Arg Val Glu Pro Glu Cys Gly Arg Pro Leu Gly Leu

145 150 155 160

Arg Phe Asn Lys Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Ile Ala Asp Ala Tyr Tyr

165 170 175

Gly Leu Leu Val Val Gly Pro Glu Gly Gly Val Ala Thr Ser Leu Ala

180 185 190

Thr His Val Glu Gly Lys Arg Ile Leu Phe Ala Asn Asp Leu Asp Ile

195 200 205

His Thr Asn Gly Ser Ile Phe Phe Thr Asp Thr Ser Lys Lys Tyr Asn

210 215 220

Arg Val Asn His Phe Leu Ile Met Leu Glu Gly Glu Asp Ser Gly Arg

225 230 235 240

Leu Leu Arg Tyr Asp Ile Ala Thr Lys Ser Thr Asn Val Val Leu Asp

245 250 255

Gly Leu Thr Phe Pro Asn Gly Val Gln Leu Ser Lys Asp Gln Thr Phe

260 265 270

Leu Leu Phe Thr Glu Thr Thr Asn Cys Arg Leu Met Lys Tyr Trp Ile

275 280 285

Glu Gly Pro Lys Arg Gly Ile Val Glu Ile Val Ala Asn Leu Pro Gly

290 295 300

Phe Pro Asp Asn Val Arg Val Asn Glu Lys Gly Gln Phe Trp Val Ala

305 310 315 320

Ile Asp Cys Cys Arg Thr Arg Ala Gln Glu Val Leu Ile Asn Asn Pro

325 330 335

Trp Met Arg Ser Ile Tyr Phe Arg Leu Pro Ile Gln Met Arg Tyr Leu

340 345 350

Ala Arg Leu Met Gly Met Lys Met Tyr Thr Val Ile Ser Leu Phe Asn

355 360 365

Glu Asn Gly Glu Ile Ile Asp Val Leu Gln Asp Lys Lys Gly Val Val

370 375 380

Met Lys Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Asn Gly Lys Leu Trp Ile

385 390 395 400

Gly Thr Val Ala His Asn His Ile Ala Thr Leu Pro Tyr Pro

405 410

<210>14

<211>274

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<400>14

Met Asn Ser Thr Ser Met Ser Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ser Trp

1 5 10 15

Thr Asp Glu Glu Asp Phe Leu Leu Arg Lys Cys Ile Asp Lys Tyr Gly

20 25 30

Glu Gly Lys Trp His Leu Val Pro Ile Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys

35 40 45

Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro His Ile

50 55 60

Lys Arg Gly Asp Phe Glu Gln Asp Glu Val Asp Leu Ile Leu Arg Leu

65 70 75 80

His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro

85 90 95

Gly Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Asn Leu Leu

100 105 110

Arg Lys Leu Asn Thr Thr Lys Ile Val Pro Arg Glu Lys Thr Asn Asn

115 120 125

Lys Cys Gly Glu Ile Ser Thr Lys Ile Glu Ile Ile Lys Pro Gln Pro

130 135 140

Arg Lys Tyr Phe Ser Ser Thr Met Lys Asn Ile Thr Asn Asn Ile Val

145 150 155 160

Ile Leu Asp Glu Glu Glu His Cys Lys Glu Ile Lys Ser Glu Lys Gln

165 170 175

Thr Pro Asp Ala Ser Met Asp Asn Val Asp Gln Trp Trp Ile Asn Leu

180 185 190

Leu Glu Asn Cys Asn Asp Asp Ile Glu Glu Asp Glu Glu Val Val Ile

195 200 205

Asn Tyr Glu Lys Thr Leu Thr Ser Leu Leu His Glu Glu Lys Ser Pro

210 215 220

Pro Leu Asn Ile Gly Glu Gly Asn Ser Met Gln Gln Gly Gln Ile Ser

225 230 235 240

His Glu Asn Trp Gly Glu Phe Ser Leu Asn Leu Gln Pro Met Gln Gln

245 250 255

Gly Val Gln Asn Asp Asp Phe Ser Ala Glu Ile Asp Leu Trp Asn Leu

260 265 270

Leu Asp

Claims (10)

1.番茄隐性核雄性不育恢复系的选育方法，包括如下步骤：

(1)向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；

(2)完成步骤(1)后，挑选雄性可育且表达标记蛋白的转基因番茄进行自交，如果某个番茄株系的后代全部雄性可育且表达标记蛋白，则该番茄株系为番茄隐性核雄性不育恢复系。

2.番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，包括如下步骤：向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；

同时满足A1)、A2)和A3)的转基因番茄即为番茄隐性核雄性不育保持系；

A1)雄性可育；

A2)表达标记蛋白；

A3)表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲和所述表达盒乙可以同时导入，也可以分别导入。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：当所述表达盒甲和所述表达盒乙同时导入时，“向番茄隐性核雄性不育系导入表达盒甲和表达盒乙”为向番茄隐性核雄性不育系导入重组质粒；所述重组质粒含有表达盒甲的核苷酸序列和表达盒乙的核苷酸序列。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：

所述花粉育性蛋白为Solyc03g053130蛋白；所述Solyc03g053130蛋白为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列13所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与番茄花粉育性相关的蛋白质；

所述标记蛋白为ANT1蛋白；所述ANT1蛋白为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列14所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述番茄隐性核雄性不育系为利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中编码Solyc03g053130蛋白的基因进行编辑，进而使Solyc03g053130蛋白功能丧失或不能表达Solyc03g053130蛋白得到的不育系；所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列为序列2所示的DNA分子。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述番茄隐性核雄性不育系的基因组中编码Solyc03g053130蛋白的基因的第1606位均为T。

8.番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，为将权利要求1、3、4、5、6或7所述方法选育的番茄隐性核雄性不育恢复系和所述番茄隐性核雄性不育系进行杂交，杂交后代即为番茄隐性核雄性不育保持系。

9.c1)或c2)：

c1)权利要求1至4中所述表达盒甲和/或所述表达盒乙；

c2)权利要求4中所述重组质粒。

10.d1)或d2)或d3)：

d1)权利要求1至8任一所述的方法在番茄育种中的应用；

d2)权利要求1至4中所述表达盒甲和/或所述表达盒乙在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用；

d3)权利要求4中所述重组质粒在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用。