CN109735563A

CN109735563A - 一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法

Info

Publication number: CN109735563A
Application number: CN201910151374.6A
Authority: CN
Inventors: 王晓峰; 刘建伟; 汪淑芬; �罗伯特
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明公开了一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法。所述方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因SlMs10³⁵及其连锁的标记基因SlF3H同时进行编辑，使这两个基因丧失功能，通过自交或杂交剔除转基因构建，得到的SlMs10³⁵及SlF3H同时丧失功能的番茄材料即为所述带绿茎标记的番茄核雄性不育系；其中，所述标记基因SlF3H为花青素合成基因。由于不育植株在幼苗期茎秆呈绿色，能够在植株未开花之前将不育植株挑选出来。本发明采用分子设计育种方法，获得非转基因带苗期标记性状的番茄核雄性不育系，可应用于将番茄杂交种母本改造成带绿茎标记的核不育系以应用于番茄杂交制种。

Description

一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，尤其涉及一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法。

背景技术

番茄(Lycopersiconesculentum Mill.)为自花授粉作物，具有明显的杂种优势，杂交一代种子整齐度高、抗逆性强，用雄性不育系的亲本做母本进行杂交种子生产，可省去人工去雄的过程、降低成本、提高种子纯度。但我国目前番茄杂种一代种子的生产仍采用人工去雄授粉，这需投入大量的人力物力，制种效率低、成本高，且种子纯度得不到保证。

为了获得适用于生产的番茄雄性不育，数十年来广大育种工作者对国内外已经发现逾60份番茄雄性不育的突变材料进行了研究，但这些材料均不同程度上存在缺陷，导致一直无法运用到育种生产上：1.无法保持100％的不育性，部分存在少量可育花粉；2.育性容易受环境的影响，在温度或光照波动的情况下，部分材料能够正常产生花粉；3.部分育性基因和不良性状连锁；4.在苗期无法准确的挑选出不育植株。

因此，需要研究创建育性稳定、无不良性状、带苗期标记的的新型不育系以解决上述问题。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，主要目的是解决番茄核雄性不育系的培育效率低和种子纯度低的问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种带苗期标记的番茄核雄性不育系的创建方法，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因SlMs10³⁵及其连锁的标记基因SlF3H同时进行编辑，使所述育性基因SlMs10³⁵和所述标记基因SlF3H丧失功能，得到的所述SlMs10³⁵和所述SlF3H同时丧失功能的番茄即为所述带绿茎标记的番茄核雄性不育系；其中，所述标记基因SlF3H为花青素合成基因。

作为优选，所述CRISPR/Cas9系统中包含2个sgRNA，分别为sgRNA-SlMs10³⁵和sgRNA-SlF3H；其中，所述sgRNA-SlMs10³⁵和所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列分别依次为所述受体番茄基因组中编码SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的DNA片段。

作为优选，所述SlMs10³⁵蛋白和所述SlF3H蛋白为a1或a2；

a1：所述SlMs10³⁵和所述SlF3H氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所表示的蛋白质；

a2：将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。

作为优选，所述SlMs10³⁵的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述SlF3H的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

其中，SEQ ID NO.3为SlMs10³⁵基因在番茄基因组中的序列，共由3302个核苷酸组成，其中1-2000位为启动子区域，第2001-2201位、第2299-2475位、第2573-2749位和第2928-3002位为外显子，第2202-2298位、第2476-2572位和2750-2927位为内含子，第3003-3302位为终止子；SEQ ID NO.4为SlF3H基因在番茄基因组中的序列，共由4365个核苷酸组成，其中1-2000位为启动子区域，第2001-2407位、第3026-3454位和第3523-4064位为外显子，第2408-3025位和第3455-3522位为内含子，第4065-4364位为终止子。

作为优选，所述sgRNA-SlMs10³⁵识别的靶序列位于所述SlMs10³⁵蛋白的编码基因中的任意位置；所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列位于所述SlF3H蛋白的编码基因中的任意位置，只要能够使核酸酶特异性切割靶序列从而使番茄丧失产生有功能的所述SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的能力即可。

作为优选，所述核酸酶为Cas9蛋白，所述靶序列为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示DNA分子序列中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种；所述SlMs10³⁵和SlF3H的靶序列依次为序列表中的SEQ ID NO.5和SEQID NO.6。

在本发明方法中，向所述番茄的子叶或下胚轴中导入所述遗传物质的方法为农杆菌侵染法、基因枪法或其它任何导入方法。

在本发明方法中获得的丧失产生有功能的SlMs10³⁵和SlF3H蛋白能力的番茄植株不能自交产生后代，通过与突变杂合植株杂交分离，获得后代为1:1系的带绿茎标记的番茄核雄性不育系。

在本发明中，所述带绿茎标记的番茄核雄性不育系体现为：植株在幼苗期，整体呈绿色，特别是茎由于缺乏花青素合成更为明显，而对照植株幼苗期茎呈现紫色；在花期，雄蕊不能产生可育的花粉，导致不育，需要人工授粉才能产生种子。

本发明利用CRISPR/Cas9系统同时定点突变番茄中的育性基因SlMs10³⁵和花青素合成基因SlF3H，获得了番茄带绿茎标记的核雄性不育材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对番茄育性基因SlMs10³⁵及其连锁标记基因SlF3H进行靶向突变；通过CRISPR/Cas9的靶向编辑作用，将SlMs10³⁵基因靶向突变，造成SlMs10³⁵蛋白功能缺失，影响花粉的形成，造成败育，创制出雄性不育植株；同时将SlF3H靶向突变，使其蛋白不能发挥正常功能，致使花青素不能正常合成，将苗期绿色茎秆性状连锁到SlMs10³⁵突变导致的雄性不育上，为番茄杂种优势的利用及制种流程改进提供了基础。本发明采用分子设计育种的方法，获得非转基因带苗期标记性状的番茄隐性核雄性不育系，本发明为充分发挥番茄的杂种优势提供了新的方法及材料。

附图说明

图1是本发明实施例2和实施例4提供的带苗期标记的番茄核雄性不育材料的创建及保存路线图；(绿色茎秆不育株(aabb)为带绿茎标记的番茄核雄性不育系，A表示SlMs10³⁵；B表示SlF3H；O表示CRISPR/Cas9转基因成分；♂表示父本；♂表示母本；×表示杂交；表示自交)

图2是本发明实施例提供的SlMs10³⁵和SlF3H基因结构示意图及编辑载体的构成；

图3是本发明实施例提供的CRISPR/Cas9系统介导的番茄材料5N21的SlMs10³⁵和SlF3H基因突变测序结果；

(注：“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量，序列中的小写字母表示插入的核苷酸，带下划线的核苷酸为靶点序列；)

图4是本发明实施例提供的slms10³⁵slf3h-Cas9植株茎杆性状图；

(野生型对照5N21呈现紫色，双基因突变植株呈现绿色)

图5是本发明实施例提供的slms10³⁵slf3h-Cas9植株花器官性状及花粉染色图；

图6是本发明实施例提供的PCR结合酶切检测SlF3H突变类型图；

图7是本发明实施例提供的slms10³⁵slf3h植株苗期图片。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pKSE401质粒：在文献“Hui-Li Xing,LiDong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,BingLiu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中已公开。

番茄材料5N11为多代自交系，公众可从西北农林科技大学园艺学院(即申请人)获得。

实施例1(SlMs10³⁵、SlF3H和SlDFR靶点的选择并构建CRISPR/Cas9基因编辑载体)

1、SlMs10³⁵和SlF3H靶点的选择

SlMs10³⁵和SlF3H基因在番茄数据库里的基因号分别为Solyc02g079810和Solyc02g083860，都位于番茄第二条染色体同一端，利用在线软件CRISPR-PLANT(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)在每个基因上各设计一个靶点用于构建基因编辑载体，选择的靶点序列如下，带下划线的为PAM区(前间隔序列邻近基序)。

SlMs10³⁵基因的靶点位于第二个外显子区域，靶点序列为：TGACGCCATCACCTACATTAGGG(序列5)；

SlF3H基因的靶点位于第二个外显子区域，靶点序列为：GAGCTAGAGACTATTCTAGATGG(序列6)；

2、重组载体的构建

(1)用限制性内切酶BsaI酶切pKSE401质粒，回收约15kb大小的酶切后的载体骨架，命名为pKSE01-B；

(2)由于SlMs10³⁵和SlF3H需要同时敲除，所以SlMs10³⁵的靶点与SlF3H的靶点需要装载到一个植物表达载体上；依据设计的靶点，利用tRNA串联策略，将人工合成序列sgRNA-SlMs1035+SlF3H，其核苷酸序列为SEQ ID NO.11；

(3)用限制性内切酶BsaI酶切包含有sgRNA-SlMs10³⁵+SlF3H片段的质粒，回收约250bp片段，并分别命名为SlMs10³⁵+SlF3H-B；将其与pKSE401-B连接，得到重组质粒pKSE401-SlMs10³⁵+SlF3H；

(4)将测序正确的重组质粒pKSE401-SlMs10³⁵+SlF3H转化入农杆菌GV3101，即可进行番茄遗传转化。

实施例2(转化番茄)

将实施例1中构建的重组质粒pKSE401-SlMs10³⁵+SlF3H利用农杆菌分别导入番茄材料5N21中；以5N21的无菌子叶为转化受体，利用含重组质粒的农杆菌介导转化，转化后经过组织培养获得完整的再生植株；

由于SlF3H基因丧失功能后植株不能产生花青素，在植株茎秆或幼嫩部位不会呈现紫色，据此可以将SlF3H基因发生编辑的植株挑选出来；

提取上述挑选出来的植株的基因组DNA，分别使用特异性引物扩增包含SlMs10³⁵和SlF3H靶位点的基因序列；对扩增出的PCR产物TA克隆到T载体pEASY-T1(北京全式金生物技术有限公司，CT101-01)上，每个样品挑选5个单克隆进行测序分析，在上述挑选出来的植株中能够检测到SlMs10³⁵和SlF3靶点处同时发生编辑的植株，部分测序结果如图3所示；

用于扩增含有SlMs10³⁵基因、SlF3H基因靶位点的引物序列如下：

上游引物SlMs10³⁵-F：atggaattccccagtacccc(序列7的第2001-2020位)；

下游引物SlMs10³⁵-R：gcctccatcagtttagttaatcca(序列8的第2644-2667位的反向互补序列)；

上游引物SlF3H-F：tcatagcagtggcggattacc(序列9的第2763-2785位)；

下游引物SlF3H-R：tcggtgtgtcgtttgagcc(序列10的第3303-3321位的反向互补序列)；

将含有遗传转化构建，并且SlMs10³⁵和SlF3H都检测到突变的植株命名为slms10³⁵slf3h-Cas9植株。

实施例3(slms10³⁵slf3h-Cas9植株表型鉴定)

在实施例2中获得的slms10³⁵slf3h-Cas9植株与野生型5N21一起种植于温室，观察茎的颜色、花的形态及花粉发育情况；如图4所示为种植的幼苗，野生型5N21茎呈现紫色，而slms10³⁵slf3h植株茎呈现出绿色；如图5所示至植株长到第二穗花开的时候，取植株当天完全开放的花进行观察，可见slms10³⁵slf3h植株的花小于野生型5N21，由于雄蕊的缩短，双突变体柱头明显外露；亚历山大染液对花粉进行染色，野生型5N21中可以观察到染成红的花粉，而slms10³⁵slf3h植株中不能观察到染上色的花粉。

实施例4(带绿茎标记的核雄性不育系的获得及保存)

遗传转化获得的T0代slms10³⁵slf3h植株由于不能产生花粉，本发明采用野生型5N21的花粉进行人工授粉；获得F1代植株中，由于CRISPR/Cas9系统仍然能够发挥功能，可以对未发生编辑的靶点进行编辑，所以F1代中存在CRISPR/Cas9转基因成分的植株仍然呈现绿茎不育表型；而不存在CRISPR/Cas9转基因成分的植株则表现出和野生型5N21一样的表型(即紫茎可育)，但是其基因型分为两种：一种是与野生型5N21一致的类型，另一种为SlMs10³⁵和SlF3H杂合突变类型；F1代植株基因组DNA，使用引物SlF3H-F和SlF3H-R进行PCR扩增并使用限制性内切酶XbaI对PCR产物进行酶切，琼脂糖电泳能够观察到三条带的即为SlF3H杂合突变，由于SlMs10³⁵与SlF3H连锁，则可以认为该植株为SlMs10³⁵和SlF3H杂合突变，即SlMs10³⁵(+/-)SlF3H(+/-)植株(如图6所示)；让该类型植株自交后产生F2代，F2代中可以分离出绿茎不育植株(slms10³⁵slf3h)，该类型植株即为带绿茎标记的番茄核雄性不育系。同样使用上述检测方法，F2代中检测出SlMs10³⁵(+/-)SlF3H(+/-)植株，并用该类植株的花粉给绿茎不育植株授粉，获得后代中即会1:1分离出绿茎不育植株(slms10³⁵slf3h)和紫茎可育植株(SlMs10³⁵(+/-)SlF3H(+/-))两种类型(如图7所示)，两种类型再杂交即可将绿茎不育(slms10³⁵slf3h)类型一直保持。

本发明的优点是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对番茄育性基因Ms10³⁵及其连锁标记基因SlF3H进行靶向突变；通过CRISPR/Cas9的靶向编辑作用，将Ms10³⁵基因靶向突变，造成Ms10³⁵蛋白功能缺失，影响花粉的形成，造成败育，创制出雄性不育植株；同时将SlF3H靶向突变，使其蛋白不能发挥正常功能，致使花青素不能正常合成，将苗期绿色茎秆性状连锁到Ms10³⁵突变导致的雄性不育上，为番茄杂种优势的利用及制种流程改进提供了基础。具体流程为设计双向导RNA介导的CRISPR/Cas9编辑载体，通过农杆菌转化到受体中，表达出Cas9与向导RNA复合体，对Ms10³⁵及SlF3H靶点进行剪切，当育性基因及标记基因同时被编辑时，表现出绿茎不育表型，通过杂交分离CRISPR/Cas9转基因成分后，后代中表现出绿茎不育表型植株即为带绿茎标记性状的番茄核雄性不育植株。

本发明提供的一种人工高效创制带绿茎标记性状的番茄核雄性不育系的方法。该方法基于双向导RNA引导的CRISPR/Cas9系统，在Ms10³⁵及SlF3H基因编码序列上各选择一个靶点，构建双sgRNA植物遗传转化载体，利用CRISPR/Cas9系统的定向编辑，在靶点位置造成In-del，通过测序及表型分析筛选出Ms10³⁵和SlF3H基因同时纯合突变的植株。由于番茄育性基因Ms10³⁵发生突变丧失产生正常蛋白的能力，导致花粉不能形成，表现出雄性不育；花青素合成基因SlF3H发生突变丧失产生正常蛋白的能力，导致无花青素合成，从而获得带绿茎标记性状的番茄核雄性不育系。由于不育植株在幼苗期茎秆呈绿色，能够在植株未开花之前将不育植株挑选出来，解决了番茄不育系不能运用到实际育种生产中的难题。

本发明采用分子设计育种的方法，获得非转基因带苗期标记性状的番茄核雄性不育系，可以应用于番茄杂交种母本转育成隐性核不育系以应用于制取番茄杂交种。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 209

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 1

Met Glu Phe Pro Ser Thr Pro Phe Asp Asn Ser Asn Asn Ser Glu Glu

1 5 10 15

Arg Glu Val Gly Arg Arg Thr Asp Lys Arg Lys Gln Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Val Lys Glu Tyr Lys Ser Lys Asn Leu Lys Ala Glu Arg Asn Arg Arg

35 40 45

Gln Lys Leu Ser Glu Arg Leu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Val Pro Asn

50 55 60

Ile Thr Asn Met Thr Lys Glu Thr Ile Ile Thr Asp Ala Ile Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Arg Glu Leu Gln Met Asn Val Asp Asn Leu Ser Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Glu Met Glu Ala Thr Gln Gly Glu Glu Leu Glu Thr Lys Asn Glu Glu

100 105 110

Ile Ile Asp Thr Ala Asp Glu Met Gly Lys Trp Gly Ile Glu Pro Glu

115 120 125

Val Gln Val Ala Asn Ile Gly Pro Thr Lys Leu Trp Ile Lys Ile Val

130 135 140

Cys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Leu Thr Lys Leu Met Glu Ala Met Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gly Phe Asp Ile Asn Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ser Lys Gly

165 170 175

Ala Ile Leu Ile Thr Ser Ser Val Glu Val Val Arg Gly Gly Leu Thr

180 185 190

Glu Ala Asn Arg Ile Arg Glu Ile Leu Leu Glu Ile Ile His Gly Ile

195 200 205

Tyr

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 2

Met Ala Pro Ser Thr Leu Thr Ala Leu Ala Asn Glu Lys Thr Leu Glu

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ile Arg Asp Glu Glu Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn

20 25 30

Lys Phe Ser Asp Glu Ile Pro Val Ile Ser Leu Gln Gly Ile Asp Asp

35 40 45

Val Asn Gly Arg Arg Ser Glu Ile Cys Glu Arg Ile Val Asn Ala Cys

50 55 60

Glu Asp Trp Gly Val Phe Gln Val Ile Asp His Gly Val Asp Ala Gln

65 70 75 80

Leu Ile Ser Gln Met Thr Lys Leu Ala Lys Glu Phe Phe Glu Leu Pro

85 90 95

Pro Glu Glu Lys Leu Arg Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys Gly Gly

100 105 110

Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Gly Glu Val Val Gln Asp Trp Arg

115 120 125

Glu Ile Val Thr Tyr Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Arg Asp Tyr Ser

130 135 140

Arg Trp Pro Asp Lys Pro Gln Gly Trp Ile Gly Val Thr Glu Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Met Asp Leu Ala Cys Lys Leu Leu Glu Val Leu Ser

165 170 175

Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys Val Asp

180 185 190

Met Asp Gln Lys Val Val Val Asn Phe Tyr Pro Lys Cys Pro Glu Pro

195 200 205

Asp Leu Thr Leu Gly Leu Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Leu Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Lys Asp Asn

225 230 235 240

Gly Lys Thr Trp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys Asn

245 250 255

Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Ser Ser Arg Leu Ser Ile

260 265 270

Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Pro Asp Ala Lys Val Tyr Pro Leu Lys

275 280 285

Ile Arg Glu Gly Glu Lys Ser Ile Met Asp Glu Pro Ile Thr Phe Ala

290 295 300

Glu Met Tyr Arg Arg Lys Met Ser Lys Asp Leu Glu Leu Ala Arg Leu

305 310 315 320

Lys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Lys Ile Gln Thr Glu Glu Ala Lys Leu

325 330 335

Glu Ser Lys Pro Ile Glu Glu Ile Leu Ala

340 345

<210> 3

<211> 3302

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 3

tcagcttcag aaaacctttt tctttcataa aatgcggtta atgacgtgtt acaagtgaca 60

atattcggct taatcccatg attttcaatc tcatccatca aatacacagc agaatccaac 120

aaaccagccc tgcacagtgc cttaatcgca gtggcatacg acaccagatc aggctgaatt 180

gacaatttcg ggggcaattc gcgaaacaag ccgccaattt catcatattt ctctgattta 240

agatatgctt ccagtagggc attgaaggaa aagacagtgc gcggacaatt taggtgaggc 300

atttcgtcaa acagcttacg tgcacgatga tccattttcg ctctgccata gagaagaata 360

agacgggcaa caaaggcttc gttacgaata tcaggatact tttttttgat gttcaatgat 420

atctataatg ccggatttgt gtttggcttc ggtaagttgg tgaatggcga tttcataatg 480

gaagcgcgat tcagtcggaa tttggggcat tccgatgatt ttttgaaaga gtctaccatt 540

gcttgggctc gatcggtggg tcttgaacaa gtaatgatct gatttattgc tctttcattt 600

ccggcgaaga tgcctttcac acggcggaga gatgaagaag tagacatttg atgcttattt 660

tgatttttgg cgctgagcaa gacgttagaa agaaagaaaa aattcaatta tacccctaac 720

gtttattatt tggtttatat atggcatttg ttaacttacc gcataatagc tgaaagaatc 780

tgattatttt ggtacaataa attacaacaa taaaacaaag agccttattc aacgttgtta 840

tgttacgaag gacttatgtg atacttcctg aagagtaaaa gctcctatgg ccttttccca 900

taccagcatt ataagttgtt gcttcgtatt tttgtatttg tatttaattt ctctttttta 960

taaataaatg ataaaattac attcacatca tctacactag atatattgtt gtatcatatt 1020

ttggtttttg agtggttaaa gtacaaaata catacatgga ataccattaa ctctttctag 1080

tgatttacaa aatgaagttg tactttaaaa gaaattattc atgtcaggtg taaaaaagaa 1140

aaagtgaaag gagaataaaa tttctactta aagcagctct ggtcactcat ttgtacttta 1200

caatgccagt aatactagta acaaccacaa agtagtcaca aacataacta gcaagaacat 1260

tacccacttc tattcttctt tctgtttgat tccttttctt tcgggtggtt gttactcttt 1320

aaccctatag ccttttacga gtcctcataa cggaggtggg ttttattaag ttgacaacta 1380

ggcgtaaata atcaaaccat gaggattcca actattatgc atactagttg gttggcgatg 1440

tctatattca atcattgtta tgctatatgc atactagtta gtatgtaaac ataaaaaaag 1500

tacttgttca acttagtccc aaacaagtta aactcggggt atatgaatat ttactgacca 1560

tatttcccgt ttgaatttat ctctttcggg ataacaataa cagtgaaaag tgtaattaga 1620

ccaaaactga aaagggttgt agtgtctgaa cctacaaaaa aaaactctac acactctctc 1680

tttctcatgc caaaaatgag tccttccaag acaccccaag tacattgtga tcaattagga 1740

aatgcccaac aaactacaac aagaagattc ccacaaccaa gaaacgtttc tgttgtgagg 1800

agcgcaccta tataaaccta ttctctgcct acaaaaaaaa aaacccagtg cagtactgcc 1860

tcttctttta gctgcactca acatattaat cattagcacc aatactctcc atctatagat 1920

ttcctttcta atttaggaat tcattttaac atatttataa caatattctc ttttaaatgg 1980

tagtaattag gtgtgctaaa atggaattcc ccagtacccc atttgataat tcaaacaact 2040

ctgaagaaag ggaagtagga agaagaacag ataaaaggaa gcaaattgat ggtgaagtta 2100

aagaatacaa atccaagaac cttaaggctg agagaaatag gcgtcaaaaa cttagcgaaa 2160

ggcttcttca attacgctca ttggtcccaa acataacaaa tgcaatgaat caaaaacctt 2220

cattctttac atagtttcat aaagaatgaa tttttttaaa aaaaatctaa aaaagtttaa 2280

attcttgtct gatttcagat gacaaaagaa accataatca ctgacgccat cacctacatt 2340

agggagctac aaatgaatgt ggacaaccta agtgagcagc ttcttgaaat ggaagcaact 2400

cagggggagg aactggagac aaaaaatgaa gagattatcg atactgcaga cgagatgggt 2460

aaatggggca tagaggtagg taactttatg tataaaacca aagtttcaat ctttgatatt 2520

cttgaattat aaggacagta aaacaacttt gatctttgtt tttctaaaac agcctgaagt 2580

tcaagtggct aacattggcc caactaagct ttggataaaa atagtctgcc aaaagaaaag 2640

aggtggatta actaaactga tggaggcaat gaatgctctt ggatttgata taaatgacac 2700

cagtgccact gcctctaaag gagctattct tattacttca tctgtggagg taggagaaac 2760

atatgttaaa aaagtaatct ttttagtagc gataaagaaa ctattgcccg aaaatatcaa 2820

gatttgtaat agtacaaaaa ggagatcttg cttagcacct tgtactgtgt gtgctgcaat 2880

tattagcaac ataaacaatt tataaatctt tctgtgtatt atttcaggtg gttagaggtg 2940

gactaactga agctaatcga atcagagaga tcttactgga gatcatccac ggaatctact 3000

agaaccagca tgaaaatccc ctaaatctta atagctttag tctcattgga gaaatgccag 3060

agtacctcta atttttagtt atggtgtcaa aaaaaggatt caatcatgtt ttcaaaatat 3120

tgtatccaaa ttgtctgaaa aaagctagtg tgaactcttg tttttgcttt caaatattga 3180

tgaaacaact tatcatatgt tactaattac tctctcctat cttaattcta tagcatttca 3240

tatgcagtca agtttggctt aattcaactg aggcaaactt tgaaatagaa tatactactt 3300

tt 3302

<210> 4

<211> 4364

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 4

tgaaacctca tgagaggggt agctacctaa aaataatgaa gtgatgagat ctcaataagt 60

tctgtcgtat tgtgaatcga tacaaaatga tttatcgttg acgatatctt tgatacaata 120

acgctcaata ttgtaaaata taatgaggat atacattata catctattaa agcatgcttg 180

tgtagaaata attatcaagt gaaaaatgga atgatgtatc ttggtaagcg taaagcttat 240

ttgacttgca atctaggcac tagaagatgt catacatcta atattgaatg ttgttacttg 300

acaaaattga tatgaaaata tccgatgggt tcaaaatata aagcatatac aagtttttgg 360

aaaacttgtt tatcatcctc ataaggatta aatagattca aaatgcatag agcatataca 420

agtattatta tgcaagttga tgactagaat tgaaactctt ggcaattatt tgcttaaaga 480

agttgaagta aggaacttgc taaaatcttt gaccctgaag ggaagattta taaaagcaga 540

tagaagaaaa catatttcgt caaggttttt ctacactcat aagctcccaa gaatggtgag 600

atcaacatgc aagaggtctg ttcaagtaat attattgttg atttattcac caagtctcta 660

tcaactacaa ctttcaagaa gatggtgcac aagtttggaa aacgaagatt ctagtctctg 720

aattgatgtt gtcgttaggg ggagttaata cgcgatgtac tcttttttcc tcataaggtt 780

ttgtcccact gggttttcct tgtaagattt ttaatgaggc atccgtaatg cgtattatta 840

gatatgtgta ctttttttcc ttcactagat tttttcccat tgggttttat ctagtaaggt 900

tttaacgagt cacgtaatct gacattcaag ggggagtgtt ataaacactt tgtattatag 960

tgaatgtcta attatgtgga gtccttgtag gatatggtta ggaattctac ttggagacca 1020

agtaagattt tccccatttt ccttcattgt aaataagatt tgtgaaaaat ctatgaatcc 1080

tgaatatatt tcaagagaaa taaaaagtct tttctctttc tccctacttt cttctcttct 1140

aaatttatag aattttatag caatatacat gttttttgtt ttagttaggc aacgctggtt 1200

ggtaatagtc acgtgatttg tcctaactcc taactaacat tccatttcat tcaccctccg 1260

tttaatagtt gaaaaggtga atttttcata ttaaacaatt atcgtgtgat gtaaagaaaa 1320

tattgttagc aattggtggt aacattatta tagtggaaaa acaatttctt cgttgcgatt 1380

atttttcttc aagaaaaaaa aacaaattac ttagtaggaa ctacttttca acaaagcaac 1440

tacgcttttc ccctaaaata gtactagtac ttaatttttt ttaacccgtc ccaataaaaa 1500

taacacattt ttatattaag taaactcata ataaactgat attaaaactc ataataaact 1560

gatatacaac tacataaata tttatcactt attttatttc ataaatctta aaaaaataat 1620

tctattttaa atcgtgtcaa attaaactaa cttacacata tatcatataa aataaaatgg 1680

gtgtaaaatg gaacagaata caagagtaca taagtacctt tttacgaagt taaacaatat 1740

tcattttgag tgttacactt tacattttta atgtatttta caagaaataa aaataagata 1800

atcaatatca aaataaatat ttaacataat tttcaaacca agtatggtgg tacctaccct 1860

acaattggta agcaaaatac aattctagaa agagaacacg tgaaatgttg ttagttggca 1920

cgaagggtag taatagctcc acgcaaacac tcccttaaaa atctccaccc cttatttcac 1980

cttactactt accgttctct caacatttaa aaagggcacc tcataactct tttgaacaaa 2040

acaaaaaatg gcaccttcaa cactaacagc tttagctaat gaaaagaccc ttgaaacaag 2100

ttttattagg gatgaagaag aacgtccaaa agttgcttac aataaattta gtgacgaaat 2160

tccagtaata tcgttgcaag gtattgatga tgttaatgga agaagaagtg aaatatgtga 2220

gagaatcgta aatgcttgtg aagattgggg tgtttttcag gtaattgatc atggggttga 2280

tgctcaatta atatcacaaa tgacaaaatt agcgaaggaa tttttcgaat tgcctcctga 2340

ggaaaagctt cggtttgaca tgtctggtgg caagaaaggt ggcttcattg tctcaagcca 2400

cttacaggta acaattattt caccgcaact tattttttat tttgatttat aggaataaat 2460

agaaaaaaag ttagtgataa atttctaaat acagaaaaga tatacctacg gatgaaaaag 2520

tgtttgtaac agatcccctt tttttccgag gtagccgttg tatcgatagt ttgaaaaata 2580

taaagtttgt tttaattgtt atttaaattc tatgatattg tatatgtaga tgaaaaaaaa 2640

atattttttt aacgacaatt tgataggatc atgttattat tttagtattt tcagttaatt 2700

ttgtctttat ttattattga gttattttat tttatctatt tacaccattt ttattagtag 2760

ctcatcatag cagtggcgga ttaccggggt caacctgacc tccaggcggg aaattatagg 2820

gttgaaatta ttttttaggt agatgtatat agttaatgtc aaatttcttc agctacttcg 2880

tgtatctatt gaacctctta tttaaaattg gctccaccat tatttcgtac tttacttttt 2940

cttgtagatt cattattcaa aatatgggtg tataacgata taatataatt tatcaattta 3000

ctataacact acaattgttt tgtagggtga agtggttcaa gactggcgtg aaatagtgac 3060

ttacttttca taccccattc gagctagaga ctattctaga tggccagaca aaccacaagg 3120

ctggataggt gtaactgagc aatacagtga aaagttgatg gatttggctt gcaaattatt 3180

agaagtacta tcagaggcaa tgggcttaga gaaagaggct ttaaccaagg catgtgtcga 3240

tatggaccaa aaagtagttg tgaattttta cccaaagtgt ccagagcctg accttactct 3300

tgggctcaaa cgacacaccg atccaggaac cattacctta ttgttacaag accaagttgg 3360

tgggcttcaa gccactaaag ataatggcaa aacatggatc actgttcagc ccgttgaagg 3420

tgcttttgtg gttaatcttg gcgatcacgg tcatgtaagt tggtactaca tattccgata 3480

aaattaaaat tatgtgaatt taattatgtg aattttggac agtatttgag caatggaagg 3540

ttcaagaatg ctgatcatca agcagtggtg aattcgaata gcagtagatt atcgatagcc 3600

acattccaga atccagcacc agatgcaaaa gtgtatccgt taaaaattag agaaggagag 3660

aagtcaataa tggatgagcc gattacattt gcagaaatgt acaggaggaa aatgagtaag 3720

gatcttgagc tagctaggct gaagaaactg gccaaggaag agaagataca aactgaagag 3780

gccaagttgg agtccaagcc cattgaggaa attcttgctt aagtgtttta acacttgaaa 3840

caacaagcta tgcgcgtaat ttcttttatc agtattgtct tgaataacaa tcaatcatgt 3900

tcttgtgaat tggtgatgtt tttaatctta ttacaaaaca aacttagtgt tcctttattc 3960

aaattaaagt cttttagatg atgcataacg ccatttccta cggaggaagg taaaattata 4020

aaattggata tacataaaac tatactcgta gatccataag acttatatct cgcctcgtat 4080

tgtataaaat gtctcgtatc atgtctcctt ttaaaacacc ggaagatgct atattattag 4140

cccaagttta ctagcccagc tgctcaatta caagctgctc ttagcccaat tttccgagta 4200

tagaatggct atcgtttaat tttttatttt cttgacatat gaaaaagtgg tatgacaaga 4260

cttaagagtt gacttacatt agttgttccg tgtgaataat aaaaaaagtg aaaatggcgg 4320

aaaagatcaa atatgtcgtc cgttacgtat tttaatagca agtt 4364

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgacgccatc acctacatta ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctagaga ctattctaga tgg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaattcc ccagtacccc 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctccatca gtttagttaa tcca 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcatagcagt ggcggattac c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcggtgtgtc gtttgagcc 19

<210> 11

<211> 445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtctctatt gaacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca 60

gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcatg acgccatcac ctacattagt tttagagcta 120

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 180

gtgcaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg 240

gttcgattcc cggctggtgc agagctagag actattctag agttttagag ctagaaatag 300

caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcaac 360

aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat 420

tcccggctgg tgcagtttag agacc 445

Claims

1.一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因SlMs10³⁵及其连锁的标记基因SlF3H同时进行编辑，使所述育性基因SlMs10³⁵和所述标记基因SlF3H丧失功能，得到的所述SlMs10³⁵和所述SlF3H同时丧失功能的番茄即为所述带绿茎标记的番茄核雄性不育系；其中，所述标记基因SlF3H为花青素合成基因。

2.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中包含2个sgRNA，分别为sgRNA-SlMs10³⁵和sgRNA-SlF3H；其中，所述sgRNA-SlMs10³⁵和所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列分别依次为所述受体番茄基因组中编码SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的DNA片段。

3.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述SlMs10³⁵蛋白和所述SlF3H蛋白为a1或a2；

4.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述SlMs10³⁵的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述SlF3H的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

5.如权利要求2所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述sgRNA-SlMs10³⁵识别的靶序列位于所述SlMs10³⁵蛋白的编码基因中的任意位置；所述sgRNA-SlF3H识别的靶序列位于所述SlF3H蛋白的编码基因中的任意位置，只要能够使核酸酶特异性切割靶序列从而使番茄丧失产生有功能的所述SlMs10³⁵和SlF3H蛋白的能力即可。

6.如权利要求5所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述核酸酶为Cas9蛋白，所述靶序列为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示DNA分子序列中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种；所述SlMs10³⁵和SlF3H的靶序列依次为序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

7.如权利要求1所述的一种带绿茎标记的番茄核雄性不育系的创建方法，其特征在于，所述核雄性不育系的表型为幼苗期下胚轴呈现绿色且其植株不能产生花粉。