CN101248183A - 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了在植株中介导雄性生育力的核苷酸序列以及示出的DNA分子和氨基酸序列。本发明还鉴定了启动子序列及其必要区域。所述核苷酸序列可用于在植株中介导雄性生育力。在一种此类方法中，在与第二植株杂交后，导致雄性不育的等位基因的纯合隐性状态被保持，其中，所述第二植株含有恢复性的转基因构建体，所述构建体具有能逆转纯合状态的核苷酸序列。所述恢复性序列与编码抑制雄性配子功能或形成的产物的半合序列相连。保持系植株仅产生不含恢复性转基因构建体的可育雄性配子。还通过自体授精以及选择含有所述构建体的种子或植物来提供保持系植株的增加。

Description

介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法

发明背景

杂交植物育种的发展使得生产出的作物品质和数量都可能有相当的进展。因为杂交流程的使用，使得增加的产量和想要的特征(例如对疾病和昆虫的抗性、耐热性和耐旱性以及植物组成的变化)组合都成为可能。通常，这些流程很依赖于提供向雌性亲本贡献花粉的雄性亲本，以生产出由此得到的杂交体。

通过利用了植物授粉方法的优点的技术，来对田间作物进行育种。如果来自一朵花的花粉被转移到同一植株的同一朵或另一朵花上，那么就是在对该植株进行自花授粉。如果花粉来自不同植株的花，那么植物就被异花授粉了。

在Brassica中，植株通常是自身不育的，其仅能被异花授粉。在自花授粉的物种(例如大豆和棉花)中，雄性和雌性植株处于解剖学上的并置关系。在天然授粉期间，给定的花的雄性繁殖器官对同一朵花的雌性繁殖器官授粉。

玉米植株(Zea mays L.)展现出独特的情形，它们既可通过自花授粉技术也可通过异花授粉来繁育。玉米在同一植株上具有位于雄穗(tassel)上的雄花和位于耳穗上的雌花。其可自花授粉或异花授粉。当风将花粉从雄穗吹到从初始(incipient)耳穗顶端突出的穗丝上时，玉米中就发生了天然授粉。

控制植株生育力的可靠方法将为改进植物育种提供机会。这尤其可用于开发玉米杂交体，其依赖于某种雄性不育系统，并且其中，雌性不育系统将降低生产成本。

对玉米杂交体的开发需要开发纯合的近交系，杂交这些近交系，并且对杂交加以评估。谱系育种和轮回(recurrent)选择是用于从种群开发近交系的两种育种方法。育种程序将来自两个或多个近交系或多种基础广泛的来源的目标性状组合进育种库，通过自交和对目标表型的选择从所述库中开发出新的近交系。杂交体玉米品种是两种此类近交系的杂交，每种都可能具有另一种所缺乏的一种或多种目标特征，或补足另一种的一种或多种目标特征。将新的近交系与其它近交系杂交，对从这些杂交获得的杂交体加以评估，以确定出具有商业潜能的那些。第一代的杂交体后代被命名为F₁。在对杂交体的开发中，仅考察F₁杂交体植株。F₁杂交体比其近交系亲本更健壮。这种杂交体的健壮或者杂种优势可以多种途径体现，包括增加的营养生长和增加的产量。

可通过包括人工去雄(detassel)在内的雄性不育系统来产生杂交体玉米种子。为产生杂交体种子，从正在生长的雌性近交亲本(其可与雄性近交亲本以多种不同的排列图案种植)除去雄穗。随后，只要对外来玉米花粉来源进行了足够的分离，雌性近交系的耳穗将仅被来自雄性近交系的花粉受精。得到的种子因此是杂交体(F₁)，其将形成杂交体植株。

植物开发中的环境变化可能导致在对雌性亲本的人工去雄完成后植株又雄穗化。或者，去雄者可能没有完全除去雌性近交植株的雄穗。在任何事件中，结果是雌性植株将成功脱落花粉，一些雌性植株将被自花授粉。这将导致随着正常生产的杂交体种子收获雌性近交系种子。雌性近交系种子生产力不如F₁种子。此外，雌性近交系种子的存在对生产杂交体的公司来说可能代表着种质安全风险。

或者，可通过机器对雌性近交植株去雄。机械去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植物造成更多的伤害。因此，目前没有令人完全满意的去雄形式，人们仍需要替代方法，以进一步降低生产成本，消除杂交体种子生产中的雌性亲本自花授粉。

可靠的遗传雄性不育系统提供了好处。通过使用胞质雄性不育(CMS)近交系，在一些基因型中得以避免繁重的去雄过程。在不存在生育力恢复基因时，CMS近交系的植株是雄性不育的，这是来自胞质基因组而非细胞核基因组的因子的结果。因此，该特征在玉米植株中排他性地通过雌性亲本遗传，因为仅雌性向受精种子提供胞质。用来自并非雄性不育的另一近交系的花粉来使CMS植株受精。来自第二近交系的花粉可或可不贡献使得杂交体植株雄性可育的基因。通常，来自经去雄的正常玉米的种子和同一杂交体的CMS生产的种子必须被掺合，以确保在杂交体植株生长时有足够的花粉负载用于受精以及确保胞质多样性。

CMS可能有其它缺陷。一是历史上观察到的CMS的特定变种与某些作物疾病易感性之间的关系。该问题阻碍了该CMS变体在生产杂交体玉米中的广泛使用，并且对一般意义上的CMS在玉米中的使用产生了负面影响。

Brar，et al的美国专利4,654,465和4,727,219中公开了一种类型的遗传不育性。但是，这种类型的遗传雄性不育需要在基因组内的多个不同位置保持多种突变体基因，并且需要复杂的标记系统来跟踪基因以及方便地使用系统。Patterson还描述了一种可能有用的染色体易位基因系统，但是该系统很复杂(见美国专利No.3,861,709和3,710,511)。

人们进行了很多尝试，试图改进这些缺陷。例如，Fabijanski，et al.开发了在植株中产生雄性不育的方法(见，EPO 89/3010153.8公开号329,308和作为WO 90/08828公开的PCT申请PCT/CA90/00037)。一种方法包括向植株中递送编码与雄性组织特异性启动子相关的细胞毒素物质的基因。另一种方法涉及反义系统，其中，对于生育力来说关键的基因被鉴定出来，该基因的反义序列被插入进植株。Mariani，et al.还展示了若干种细胞毒素反义系统。见EP 89/401,194。还有些系统使用“遏制子”基因，这些基因抑制对于雄性不育来说另一关键基因的表达。PCT/GB90/00102，作为WO 90/08829公开。

该系统的另一改进如美国专利No.5,478,369所述，其中通过使植物天然具有的、对于雄性生育力来说关键的基因沉默，用与诱导型启动子(控制下述基因表达)相连的对雄性生育力关键的基因来替换天然DNA，从而实现了赋予可控制的雄性不育的方法。因此，该植株是组成上不育的，仅在启动子被诱导并且其所附的雄性生育力基因表达时才会变得有生育力。

在多种情况下，雄性不育植株性状通过保持纯合隐性状态来表现。当必须用转基因的恢复基因来保持时，保持纯合状态会导致困难产生。例如，对于雄性不育来说关键的基因中的天然突变可向植株赋予雄性不育表型(当该突变体等位基因是纯合状况时)。如果向植株中引入该基因的非突变体形式，可以对这种不育加以恢复。但是，这种形式的恢复会去除想要的纯合隐性状态，恢复完全的雄性生育力，并且妨碍了对纯的雄性不育母系的保持。在消除了含有恢复基因的花粉产生的情况下，该问题得以避免，由此提供了仅产生不含恢复基因的花粉的保持系植株，后代保留了纯合状态。该手段的一个例子如Dellaporta et al.，6,743,968所示，其中，产生了具有半合构建体的植株，该构建体包含产生对细胞致命的产物的基因，该基因与花粉特异性启动子相连，并且该构建体包含恢复基因。当与纯合隐性雄性不育植株杂交时，后代由此保留了纯合隐性状态。

如前文所述，采用雄性不育系统的很多工作的一个重要方面在于对影响雄性生育力的基因的鉴定。

此类基因可用于多种系统，以控制雄性生育力，包括本文所述的那些系统。之前已在Arabidopsis thaliana中鉴定得到了一种雄性生育力基因，其被用于产生雄性不育植株。Aarts，et al.，“Transposon Tagging of aMale Sterility Gene in Arabidopsis”，Nature，363：715-717(Jun.24，1993)。美国专利No.5,478,369一文公开了影响雄性生育力的一种此类基因。在本发明中，发明人提供了新颖的DNA分子和所编码的氨基酸序列，它们对于植株中雄性生育力来说是关键的。它们可用于下述任何系统，其中，控制生育力是有用的，所述系统包括上文所述的那些。

因此，本发明的一个目的是提供一种核酸序列，其表达对于植株中雄性生育力来说是关键的。

本发明的另一目的是提供编码下述氨基酸序列的DNA分子，所述氨基酸序列的表达对于植株中雄性生育力来说是关键的。

本发明的又一目的是提供此类核苷酸序列的启动子及其必要序列。

本发明的还一目的是提供使用此类DNA分子介导植株中雄性生育力的方法。

本发明的其它目的在下文说明书和权利要求书中将是显而易见的。

发明内容

本发明涉及核酸序列，以及特别地，对雄性生育力来说关键的DNA分子和所述DNA分子编码的氨基酸序列。本发明鉴定出了DNA的启动子及其必要序列。本发明还涉及此类DNA分子用于在植物中介导生育力的用途。

附图说明

图1是雄性生育力基因Ms26的基因座图谱。

图2A是用Mu8探针杂交的ms26-m2::Mu8家族的Southern杂交印迹；图2B是用从ms26克隆分离的PstI片段杂交的ms26-m2::Mu8家族的Southern杂交印迹。

图3是用从ms26克隆分离的PstI片段杂交的Northern杂交印迹分析凝胶。

图4A-4D是Ms26的序列(cDNA是SEQ ID NO：1，蛋白质是SEQID NO：2)。

图5A-5C是基因组Ms26序列(也称为SEQ ID NO：7)。

图6A-6D是对基因组Ms26序列(SEQ ID NO：7的1051-3326位)与Ms26的cDNA(SEQ ID NO：1)的比较。

图7A是Northern分析凝胶，其显示了多种植物组织中的表达，图7B是显示了小孢子发生的表达阶段的凝胶。

图8是Ms26的全长启动子(SEQ ID NO：5)。

图9是条形图，其显示了对Ms26启动子的选定区域缺失之后的荧光素酶活性。

图10显示了Ms26启动子的必要区域(SEQ ID NO：6)。

图11是条形图，其显示了通过限制性位点接头扫描对Ms26的必要启动子片段中选定的小(9-10bp)区域进行取代后的荧光素酶活性。

图12A和12B是对来自高粱圆锥花序(sorghum panicle)的Ms26直向同源体的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)与Ms26玉米cDNA(SEQ ID NO：1的201-750位残基)，以及对高粱蛋白序列(SEQ ID NO：4)和Ms26玉米蛋白(SEQ ID NO：2的87-244位残基)的比较。

图13是对雄性不育基因ms26图谱定位的图示。

图14显示了对ms26-ref等位基因切割区域(SEQ ID NO：8)和野生型Ms26(SEQ ID NO：9)之间的比较。

图15显示了ms26-ref中的转座子序列(SEQ ID NO：10)。

图16显示了整条ms26-ref序列(SEQ ID NO：11)。

图17A显示了对CYP704B1、P450基因(SEQ ID NO：12)和Ms26(SEQ ID NO：13)的经翻译的蛋白质序列的比对；图17B显示了对选用的P450的系统发生树分析。

图18展示了半结合结构域框移(frame shift)，其显示了对Ms26cDNA(SEQ ID NOs：14和28-29)、可育植株(SEQ ID NOs：15和30-31)以及不育植株(SEQ ID NOs：16和32-33)中外显子5的基因组区域的经翻译序列的比对。

图19显示了水稻Ms26cDNA(SEQ ID NO：17)和蛋白(SEQ ID NO：18)。

图20显示了对玉米(SEQ ID NO：5的650-1089位残基)、高粱(SEQID NO：19)和水稻(SEQ ID NO：20)的Ms26启动子的比对。

图21显示了对玉米Ms26蛋白(SEQ ID NO：21)、水稻Ms26蛋白(SEQID NO：18)和高粱Ms26蛋白(SEQ ID NO：22)以及共有序列的比对。

图22是PHP 18091的质粒图谱，该质粒含有Ms45生育力基因，其具有花粉启动子、细胞毒素基因和选择标记。

图23是PHP 24101的质粒图谱，该质粒含有Ms26生育力基因，其具有花粉启动子、细胞毒素基因和选择标记。

图24展示了Zea mays α-淀粉酶1编码区域的序列。

发明详述

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

遗传雄性不育是对于小孢子发生的特定步骤来说关键的基因之一被突变、遏制或受到其它影响的结果，该术语应用于花粉萌发(formulation)的整个过程。这些基因可被合称为雄性生育力基因(或者，雄性不育基因)。在基因功能影响生育力的总途径中有很多步骤。这看起来得到了玉米中遗传雄性不育频率的恰当支持。在从骨干近交系(elite inbreds)到未改变的种群的范围内的材料中，没有发现雄性不育突变体的新等位基因。

在专利No.5,478,369中描述了一种方法，通过这种方法对Ms45雄性不育基因加上标签，并且在玉米第9染色体上克隆。之前描述了第9染色体上的雄性不育基因，ms2，其还没有被克隆和测序。其并非是‘369专利中提到的基因的等位基因。见Albertsen，M.and Phillips，R.L，“Developmental Cytology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize”Canadian Journal of Genetics & Cytology 23：195-208(Jan.1981)。在此之前被克隆的唯一一个生育力基因是前文Aarts，et al.所述的Arabadopsis基因。

之后被发现对于雄性生育力来说关键的基因的例子很多，其包括Arabidopsis ABORTED MICROSPORES(AMS)基因，Sorensen et al.，ThePlant Journal(2003)33(2)：413-423)；Arabidopsis MS1基因(Wilson et al.，The Plant Journal(2001)39(2)：170-181)；NEF1基因(Ariizumi et al.，ThePlant Journal(2004)39(2)：170-181)；Arabidopsis AtGPAT1基因(Zheng etal.，The Plant Cell(2003)15：1872-1887)；Arabdiopsis dde2-2突变(其显示出丙二烯氧化物合酶(syntase)基因的缺陷)(Malek et al.，Planta(2002)216：187-192)；Arabidopsis匿名(faceless)花粉-1基因(flp1)(Ariizumi et al，Plant Mol.Biol.(2003)53：107-116)；Arabidopisis MALEMEIOCYTE DEATH1基因(Yang et al.，The Plant Cell(2003)15：1281-1295)；绒毡层特异性锌指基因TAZ1(Kapoor et al.，The Plant Cell(2002)14：2353-2367)和TAPETUM DETERMINANT1基因(Lan et al，The Plant Cell(2003)15：2792-2804).

下表列出了多种已知的来自Zea mays的雄性生育力突变体或基因。

基因名称	其它名称	参考文献
			ms1雄性不育1	雄性不育1，ms1	Singleton，WR and Jones，DF.1930.J Hered21：266-268
ms10雄性不育10	雄性不育10，ms10	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
			ms11雄性不育11	ms11，雄性不育11	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
ms12雄性不育12	ms12，雄性不育12	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
			ms13雄性不育13	ms*-6060，雄性不育13，ms13	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
ms14雄性不育14	ms14，雄性不育14	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
			ms17雄性不育17	ms17，雄性不育17	Emerson，RA.1932.

		Science 75：566
			ms2雄性不育2	雄性不育2，ms2	Eyster，WH.1931.JHered 22：99-102
ms20雄性不育20	ms20，雄性不育20	Eyster，WH.1934.Genetics of Zea mays.Bibliographia Genetica11：187-392
			ms23雄性不育23	：ms*-6059，ms*-6031，ms*-6027，ms*-6018，ms*-6011，ms35，雄性不育23，ms*-Bear7，ms23	West，DP and Albertsen，MC.1985.MNL 59：87
ms24雄性不育24	ms24，雄性不育24	West，DP and Albertsen，MC.1985.MNL 59：87
			ms25雄性不育25	ms*-6065，ms*-6057，ms25，雄性不育25，ms*-6022	Loukides，CA；Broadwater，AH；Bedinger，PA.1995.Am J Bot 82：1017-1023
ms27雄性不育27	ms27，雄性不育27	Albertsen，MC.1996.MNL 70：30-31
			ms28雄性不育28	ms28，雄性不育28	Golubovskaya，IN.1979.MNL 53：66-70
ms29雄性不育29	雄性不育29，ms*-JH84A，ms29	Trimnell，MR et al.1998.MNL 72：37-38
			ms3雄性不育3	第3组，ms3，雄性不育3	Eyster，WH.1931.JHered 22：99-102
ms30雄性不育30	ms30，msx，ms*-6028，ms*-Li89，雄性不育30，ms*-L189	Albertsen，MC et al.1999.MNL 73：48
			ms31雄性不育31	ms*-CG889D，ms31，雄性不育31	Trimnell，MR et al.1998.MNL 72：38
ms32雄性不育32	雄性不育32，ms32	Trimnell，MR et al.1999.MNL 73：48-49
			ms33雄性不育33	：ms*-6054，ms*-6024，ms33，	Patterson，EB.1995.

	ms*-GC89A，ms*-6029，雄性不育6019，Group7，ms*-6038，ms*-Stan1，ms*-6041，ms*-6019，雄性不育33	MNL 69：126-128
			ms34雄性不育34	第1组，ms*-6014，ms*-6010，雄性不育34，ms34，ms*-6013，ms*-6004，雄性不育6004	Patterson，EB.1995.MNL 69：126-128
ms36雄性不育36	雄性不育36，ms*-MS85A，ms36	Trimnell，MR et al.1999.MNL 73：49-50
			ms37雄性不育37	ms*-SB177，ms37，雄性不育37	Trimnell，MR et al.1999.MNL 73：48
ms38雄性不育38	ms30，ms38，ms*-WL87A，雄性不育38	Albertsen，MC et al.1996.MNL 70：30
			ms43雄性不育43	ms43，雄性不育43，ms29	Golubovskaya，IN.1979.Int Rev Cytol 58：247-290
ms45雄性不育45	第6组，雄性不育45，ms*-6006，ms*-6040，ms*-BS1，ms*BS2，ms*-BS3，ms45，ms45′-9301	Albertsen，MC；Fox，TW；Trimnell，MR.1993.ProcAnnu Corn Sorghum IndRes Conf 48：224-233
			ms48雄性不育48	雄性不育48，ms*-6049，ms48	Trimnell，M et al.2002.MNL 76：38
ms5雄性不育5	：ms*-6061，ms*-6048，ms*-6062，雄性不育5，ms5	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
			ms50雄性不育50	ms50，雄性不育50，ms*-6055，ms*-6026	Trimnell，M et al.2002.MNL 76：39
ms7雄性不育7	ms7，雄性不育7	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
			ms8雄性不育8	雄性不育8，ms8	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431
ms9雄性不育9	第5组，雄性不育9，ms9	Beadle，GW.1932.Genetics 17：413-431

因此，本发明包括使用本文所示的序列来影响植株的雄性生育力，即，通过使用本发明的基因操作基因组来控制雄性生育力。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明的序列一起使用，例如，将突变体序列引入植株以导致不育、使天然序列突变、向植株中引入序列的反义序列、使用发卡形式、将其与其它序列连接起来控制其表达，或者本领域技术人员已知可用于影响植株的雄性生育力的多种方法中的任何方法。

本文所述的Ms26基因位于玉米第1染色体上，其显性等位基因对雄性生育力来说是关键的。基因座图谱如图1所示。其可用于上文所述的系统或者其它影响雄性生育力的系统。

针对不育共分离(cosegregating)的玉米家族被命名为ms^*-SBMu200，其被发现具有大约5.5Kb的EcoRI片段，该片段能与Mu8探针杂交(图2A)。分离出了含有Mu8转座子的来自该家族的基因组克隆。从该转座子边界制造的探针被发现能与同样的～5.5Kb的EcoR1片段杂交(图2B)。该探针被用于从雄穗cDNA文库分离cDNA克隆。cDNA为1906bp，Mu插入发生于基因的外显子1。还用该探针在RFLP图谱定位种群中对该突变进行定位。该突变被定位于第1染色体的短臂上，靠近Ms26。ms26-ref和ms^*-SBMu200之间的等位杂交显示它们是等位基因，这表明这些突变发生于同一基因上。ms^*-SBMu200等位基因被重新命名为ms26-m2::Mu8。克隆得到了Ms26基因的两个传统等位基因，一个在第二外显子中含有被命名为ms26-m3::Mu^*的增变子(mutator)元件，另一个在来自ms26-ref等位基因的第五外显子上含有未知转座子。图5(下文将进一步讨论)示出了基因组核苷酸序列。Northern杂交印迹分析确定的表达模式显示了雄穗特异性，其具有在小孢子发生中大致从四分体(quartet)至四分体释放阶段的峰表达。

本领域技术人员显而易见，保留有基因的雄性不育控制属性的、本文所示的整条序列的变化、突变、衍生(包括较其更小的片段)都可使用。本领域普通技术人员可以容易地通过向纯合植株引入Ms26的稳定雄性不育等位基因，接着观察该植株的雄性组织发育，来获得变体或片段。

本发明的序列可分离自任何植物，包括但不限于玉米(Zea mays)、芥菜(Brassica napus，Brassica rapa ssp.)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、黍(Panicumspp.)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)红薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、蔬菜、装饰植物和针叶树。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、紫花苜蓿、水稻、棉花和高粱。

可按照公知方法，基于与本文所示的编码序列的同源编码区域，来从其它植物分离序列。在这些技术中，已知编码序列的全部或部分被用作为探针，该探针能与克隆自选定生物的基因组DNA片段集合(即，基因组文库)中存在的其它序列选择性杂交。本领域中易于获得关于核酸序列杂交的方法。对于核酸杂交的广泛指导见Tijssen ，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，NewYork(1993)和Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。

因此，本发明还包括能在严谨条件下与Ms26核苷酸序列选择性杂交的那些核苷酸序列。提到与Ms26“选择性杂交”的序列时，该术语包括提到下述情况：在严谨杂交条件下，核酸序列与特定的核酸靶序列杂交至被检测为比其与非靶核酸的杂交更高的程度。

术语“严谨条件”或“严谨杂交条件”包括提到下述条件，在所述条件下，探针将与其靶序列杂交至被检测为比其与其它序列的杂交更高的程度。严谨条件随靶序列变化，其还将根据多核苷酸的结构变化。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可对严谨度条件加以调节，使得允许在序列中出现一些错配，从而可检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，这种类型的探针长度为大约1000至大约250个核苷酸。

关于核酸杂交的广泛指导见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，New York(1993)和Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。还见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

通常，对应于本发明的核苷酸序列并且能与本文公开的核苷酸序列杂交的序列将与公开的序列至少50％同源，70％同源，甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源。这即是说，探针和靶之间的序列相似性可在共享至少大约50％，大约70％以及甚至大约85％或者更高的序列相似性的范围内变化。

典型地，特异性是杂交后洗涤的函数，关键因子是最后的洗涤溶液的离子强度和温度。通常，严谨洗涤温度条件被选用为：比给定的离子强度和pH下针对特定序列的熔点(Tm)低大约5℃至大约2℃。DNA的熔点或者变性在很窄的温度范围内发生，这代表着双螺旋被分解为其互补单链。该过程由过渡中点的温度Tm来描述，其还被称为熔融温度。本领域可获得确定熔融温度的公式。

对于本发明的核苷酸序列而言，优选的杂交条件包括：在50％(w/v)甲酰胺、6X SSC、0.5％(w/v)SDS、100(g/ml)鲑鱼精DNA中于42℃进行杂交。示例性的低严谨度洗涤条件包括在2X SSC、0.5％(w/v)SDS的溶液中于42℃杂交30分钟并且重复。示例性的中等严谨度条件包括在2XSSC、0.5％(w/v)SDS中于50℃洗涤30分钟并且重复。示例性的高严谨度条件包括在0.1X SSC、0.1％(w/v)SDS中于65℃洗涤30分钟至1小时并且重复。对应于本发明启动子的序列可使用所有上述条件来获得。就界定本发明的目的而言，使用高严谨度的条件。

下述术语被用于描述两条或多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分比”。

(a)本文中使用的“参考序列”是用作为序列比较的基础的给定序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体，例如，作为全厂cdNA或基因序列的片断，或者是完整的cDNA或基因序列。

(b)本文中使用的“比较窗”意指多核苷酸序列的连续的、特定的片断，其中，为对两条序列进行最优比对，比较窗中的多核苷酸序列较之参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，缺口)。通常，比较窗长度为至少20个连续核苷酸，可选地，长度可以为30、40、50或100个核苷酸或者更长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中存在缺口导致的与参考序列的高相似性，典型地，引入缺口惩罚，将其从匹配数中减去。

对齐序列用于比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成对任何两条序列间百分比序列同一性的测定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith etal.(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部对齐算法；Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的整体对齐算法；Pearson andLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的针对局部对齐进行搜索的方法(search-for-local-alignment-method)；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，按照Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877改良过。

这些数学算法的计算机实现可用于比较序列，以确定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，Mountain View，California获得)；GCG Wisconsin Genetics软件包，版本10(可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA获得)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序进行的比对可以用默认参数来进行。Higgins et al.(1988)Gene 73：237-244(1988)、Higgins et al.(1989)CABIOS 5：151-153、Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90、Huang et al.(1992)CABIOS 8：155-65和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331很好地描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于上文Myers and Miller(1988)的算法。当对氨基酸序列进行比较时，可以使用ALIGN程序以及PAM120权重残基表，缺口长度惩罚为12，缺口惩罚为4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于上文Karlin and Altschul(1990)的算法。可以用BLASTN程序，分数＝100，字长＝12，来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序来进行，其中采用分数＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。就比较目的而言，为获得有缺口的对齐，可以使用带缺口BLAST(在BLAST 2.0中)，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acias Res.25：3389所述。或者，可以使用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)来进行迭代搜索，以探测分子间的遥远关系。见上文的Altschul et al.(1997)。当利用BLAST、带缺口BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各程序(例如，对核苷酸序列用BLASTN，对蛋白质用BLASTX)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以通过观察手工进行比对。

除非另有指明，本文提供的序列同一性/相似性指使用GAP版本10，采用下述参数时获得的值：对核苷酸序列的％同一性和％相似性而言，使用的GAP权重为50，长度权重为3，使用nwsgapdha.cmp计分矩阵；对氨基酸序列的％同一性和％相似性而言，使用的GAP权重为8，长度权重为2，使用BLOSUM62计分矩阵或者任何其等同程序。“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，对于被查询的任何两条序列而言，该程序产生这样的比对，其较之GAP版本10产生的相应的比对而言具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同的百分比序列同一性。

GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以寻求两条完整序列的对齐，这种对齐使得匹配数量最大化，缺口数量最小化。GAP考虑到所有可能的对齐和缺口位置，产生具有最大数量匹配碱基和最少缺口的对齐。其允许规定缺口产生惩罚和以匹配碱基单位计的缺口延伸惩罚。GAP应当计入针对其插入的每个缺口的缺口产生惩罚数。如果选用了缺口延伸惩罚高于零的情况，那么，GAP应当额外针对插入的每个缺口计入缺口长度乘以缺口延伸惩罚的乘积。GCGWisconsin Genetics软件包的版本10中，对蛋白质序列而言，默认的缺口产生惩罚值和缺口延伸惩罚值分别为8和2。对核苷酸序列而言，默认的缺口产生惩罚为50，而默认的缺口延伸惩罚为3。缺口产生和缺口延伸惩罚可表示为选自0至200构成的整数组的整数。因此，例如，缺口产生惩罚和缺口延伸惩罚可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP展示出最佳比对家族的一个成员。该家族可能有很多成员，但是其它成员并没有更好的质量。GAP显示比对评价标准的四个数：品质、比例、同一性和相似性。品质是为了对齐序列的最大限度的度量。比例是用品质除以较短片断中的碱基数得到的。百分比同一性是实际上匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。越过缺口的符号被忽略。当针对一对符号的计分矩阵值高于或等于0.50这个相似性阈值，就对相似性进行计分。用于GCG Wisconsin Genetics软件包的版本10的计分矩阵是BLOSUM62(见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)在关于两条核酸或多肽序列的上下文中，本文中使用的“序列同一性”或“同一性”指：在特定的比较窗上，为了获得最大的对应进行比对时，两条序列中相同的残基。当使用序列同一性的百分比时，应当认识到，不相同的残基位置经常是由于保守氨基酸取代导致有所不同的，在保守氨基酸取代处，氨基酸残基被取代为具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，并且因此不会改变分子的功能性质。当序列因为保守取代而有所不同时，可上调百分比序列同一性，以针对取代的保守本质加以校正。由于此类保守取代而有所不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行此类调节的方式是本领域技术人员公知的。典型地，这包括对保守取代进行部分计分，而非计为完全错配，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸被给为1分，非保守取代被给为0分时，保守取代被给为0至1之间的分数。计算保守取代的计分，例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)所实现的。

(d)本文中使用的“序列同一性的百分比”指通过在比较窗上比较两条被最优对齐的序列来确定的值，其中，为了对两条序列进行最优比对，比较窗中多核苷酸序列的一部分较之参考序列(其不含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，缺口)。该百分比是这样计算的：测定两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，并将匹配位置的数量除以比较窗中位置总数，再将该结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。

术语“多核苷酸”的使用并非意欲将本发明限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员应当认识到，多核苷酸可包含核糖核酸以及核糖核酸和脱氧核糖核酸的组合。此类脱氧核糖核酸和核糖核酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括序列的所有形式，其包括但不限于：单链形式、双链形式、发卡、茎环结构等。

与本发明的序列的同一性将意味着具有至少65％序列同一性的多核苷酸序列，更优选地，至少70％序列同一性，更优选地，至少75％序列同一性，更优选地，至少80％序列同一性，更优选地，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。

本领域技术人员可以容易地鉴定出启动子区域。鉴定出含有ATG基元的推定起始密码子，该起始密码子的上游就是假定的启动子。“启动子”意指这样的DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在对于特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可额外包含其它识别序列，这些序列通常位于TATa盒的上游或5′端，它们被称为上游启动子元件，影响转录起始速率。应当认识到，虽然已经鉴定了针对本文公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本文鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如作用于编码序列的组织表达和时间表达的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，Ms26的上游启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联。启动子可以是从中发现其的细胞天然的或非天然的。

可对本发明的经分离的启动子序列加以修饰，以提供异源核苷酸序列表达水平的范围。可以利用比整条启动子更少的区域，而驱动花粉囊优先的表达的能力仍能保留。但是，应当认识到，mRNA的表达水平可能随着启动子序列一部分的缺失而减少。因此，可将启动子修饰为弱或强启动子。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指大约1/10,000转录本至大约1/100,000转录本至大约1/500,000转录本的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平(或者，大约1/10转录本至大约1/100转录本至大约1/1,000转录本)表达。通常，经分离的启动子序列的至少大约30个核苷酸将被用于驱动核苷酸序列的表达。应当认识到，为增加转录水平，可以将增强子与本发明的启动子区域组合使用。增强子是发挥作用以增加启动子区域表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，其包括SV40增强子区域、35S增强子元件等。

本发明的启动子可从其5’非翻译区域(5’UTR)的天然编码区域的5’区来分离。类似地，终止子可从侧翼于其各终止密码子的3’区来分离。术语“经分离的”指这样的物质(例如核酸或蛋白质)，其实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的、通常伴随该物质或与该物质相互作用的组分，或者，如果该物质处于其天然环境中，那么已通过刻意的人为干涉将该物质改造为组成并非该物质天然的和/或该物质被放置在细胞中并非该物质天然基因座的基因座上。用于分离启动子区域的方法是本领域公知的。

调控序列的“功能变体”也是本发明的组合物所包括的。功能变体包括，例如，具有一处或多处核苷酸取代、缺失或插入的本发明的天然调控序列。本发明的功能变体可通过定点诱变(包括突变)来产生，或者可作为等位基因变体发生(多态性)。

本文中使用的调控序列的“功能性片段”是这样的核苷酸序列，其是从较大的序列通过一处或多处缺失形成的调控序列变体。例如，如Opsahl-Sorteberg，H-G.et al.，“Identification of a 49-bp fragment of theHvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression”Gene341：49-58(2004)所述，启动子的5′部分直到靠近转录起始位点的TATA盒都可能缺失，而不会破坏启动子活性。此类变体应当保留启动子活性，特别是驱动在雄性组织中表达的能力。可通过Northern杂交印迹分析、报道基因活性测量(使用转录融合时)等来测量活性。见，例如Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，其通过引用并入本文。

可通过使用限制性酶切割本文公开的天然存在的调控元件核苷酸序列，或者通过从天然存在的DNA序列合成核苷酸序列来获得功能性片段，或者可通过使用PCR技术来获得功能性片段。具体见Mullis et al.(1987)Methods Enzymol.155：335-350，and Erlich，ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press，New York)。

与本发明的调控序列杂交的序列也在本发明的范围内。对应于本发明启动子序列以及与本文公开的启动子序列杂交的序列将与公开序列至少50％同源，70％同源，或者甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更高。

较小的片段可能仍含有鉴定出的启动子的调控性质，因此缺失分析是鉴定必要区域的一种方法。缺失分析既可从调控区域的5’末端进行始也可从3’末端进行。可通过定点诱变、使用聚合酶链式反应得诱变等获得片段(见Directed Mutagenesis：A Practical Approach IRL Press(1991))。3’缺失可展现必要区域并且鉴定出3’末端，使得该区域进而可被可操作地连接至选用的核心启动子。一旦鉴定出了必要区域，就可通过该必要区域加核心启动子来控制外来基因的转录。核心启动子表示被称为TATA盒的序列，这是所有编码蛋白质的基因启动子通常都具有的。因此，可选地，Ms26的上游启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联。启动子可以是从中发现其的细胞天然的或非天然的。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素启动子(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子(Gruber，et al.“Vectors for Plant Transformation”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)et al.eds，CRCPress pp.89-119(1993))。

Ms26的调控区域已被鉴定为包括推定的TATA盒上游1005bp的区域。见图8。此外，使用上文概括描述的流程，已确定：启动子的必要区域包括TATA盒的-180bp上游，特别地，-176至-44区域是特别必要的。

可根据公知技术来分离来自其它植物的启动子序列，这基于它们与本文示出的启动子序列的序列同源性来进行。在这些技术中，已知启动子序列的全部或一部分被用作为探针，该探针与来自选定生物的、克隆的基因组DNA片段集合(即，基因组文库)中存在的其它序列选择性杂交。本领域中容易获得用于核酸序列杂交的方法。

整条启动子序列或其部分可用作为能与相应的启动子序列特异性杂交的探针。为获得在多种条件下的特异性杂交，此类探针包括独特的、优选至少约10个核苷酸长、最优选至少约20个核苷酸长的序列。此类探针可用于通过公知的聚合酶链式反应(PCR)方法从选定的生物扩增相应的启动子序列。该技术可用于从目标生物分离额外的启动子序列，或者用作为诊断检测，来确定生物中是否存在该启动子序列。例子包括对平板DNA文库进行杂交筛选(噬菌体或菌落文库，见，例如Innis et al.，eds.，(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press)。

此外，本发明的启动子可与并非Ms26基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起提供于表达盒中，用于在目的植株中表达，更特别地，在该植株的雄性组织中表达。此类表达盒被提供有大量限制性位点，用于插入将处于启动子的转录调控下的核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的表型应答。

可作为表达载体的外来基因与Ms26启动子，或者本文教导的或本领域技术人员已知的其它启动子，或者本文教导的或本领域技术人员已知的其它启动子互补核苷酸单位，例如反义分子(葡聚糖酶(callase)反义RNA、芽胞杆菌RNA酶(barnase)反义RNA和查耳酮(chalcone)合酶反义RNA、Ms45反义RNA)一起使用的其它核苷酸序列的例子是核酶和外在指导序列、适体或单链核苷酸。外来核苷酸序列还可编码碳水化合物降解或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，例如图24的α淀粉酶基因、茁长素(auxin)、rol B、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统。举例而言，Mariani，et al.，Nature Vol.347；pp.737；(1990)表明，Aspergillus oryzae RNase-T1或Bacillus amyloliquefaciens的RNase(被命名为“barnase”)在绒毡层中的表达诱导了绒毡层细胞的破裂，导致雄性不能生育。Quaas，et al.，Eur.J.Biochem.Vol.173：pp.617(1988)描述了RNase-T1的化学合成，而barnase基因的核苷酸序列由Hartley，J.Molec.Biol.；Vol.202：pp.913(1988)公开。Agrobacterium rhizogenes的rolB基因编码通过从吲哚酚-β-甙释放游离吲哚从而干扰茁长素代谢的酶。Estruch，et al.，EMBO J.Vol.11：pp.3125(1991)和Spena，et al.，Theor.Appl.Genet.；Vol.84：pp.520(1992)表明，烟草中rolB基因的花粉囊-特异性表达产生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的产生大大减少，rolB基因是可用于控制花粉产生的基因的例子。Slightom，et al.，J.Biol.Chem.Vol.261：pp.108(1985)公开了rolB基因的核苷酸序列。编码白喉毒素基因的DNA分子可从American Type Culture Collection(Rockville，MD)，ATCC No.39359或ATCC No.67011获得，关于例子和使用方法，见Fabijanski，et al.，E.P.Appl.No.90902754.2，“Molecular Methods of Hybrid Seed Production”。DAM甲基化酶基因用于在美国专利No.5,689,049和PCT/US95/15229Cigan，A.M.and Albertsen，M.C.，“Reversible Nuclear Genetic System forMale Sterility in Transgenic Plants.”讨论的方法中导致不育。还见Albertsen et al的美国专利No.5,962,769“Induction of Male Sterility inPlants by Expression of High Levels of Avidin”对亲和素基因导致不育的讨论。

本发明包括具有Ms26基因的载体。制备包含Ms26、将驱动该基因在植株中表达的启动子和终止区域的载体。如所指出的，构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将提供在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子，使得可通过暴露给诱导剂来控制构建体中正义或反义分子的表达。在这个方面，任何植物相容性启动子元件都可用于构建体，这取决于最终想要的结果。它们可以是植物基因启动子，例如，针对核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的启动子，或者，来自Agrobacterium tumefaciens的肿瘤诱导质粒的启动子，例如胭脂氨酸合酶和章鱼碱合酶启动子，或者病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。见Kay et al.，(1987)Science 236：1299和欧洲专利申请No.0 342 926；大麦脂转移蛋白启动子LTP2(Kalla et al.，Plant J.(1994)6(6)：849-60)；泛素启动子(见，例如美国专利5,510,474)；END2启动子(Linnestad et al.美国专利6,903,205)和聚半乳糖醛酸酶PG47启动子(见Allen and Lonsdale，PlantJ.(993)3：261-271；WO 94/01572；美国专利5,412,085)。关于适用于本发明的阐释性植物启动子的综述，参见国际申请WO 91/19806。

可获得的植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调控元件是能应答于诱导剂直接或间接激活一条或多条DNA序列或基因的转录的元件。不存在诱导剂时，DNA序列或基因将不能被转录。典型地，与诱导型调控元件特异结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，其再通过诱导剂直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学试剂，例如蛋白质、代谢产物、生长调控因子、除草剂或酚类化合物或直接通过热、冷、盐或毒性元素施加或通过病原体肌动蛋白或疾病剂(例如病毒)间接施加的生理胁迫。含有诱导型调控元件的植物细胞可暴露给诱导剂，这通过将诱导剂通过外界应用到细胞或植物上来实现，例如通过喷雾、浇水、加热或类似方法。

任何诱导型启动子均可用于本发明。见Ward et al.Plant Mol.Biol.22：361-366(1993)。示例性的诱导型启动子包括蜕皮素受体启动子，美国专利No.6,504,082；来自ACE1系统的应答于铜的启动子(Mett et al.PNAS 90：4567-4571(1993))；来自玉米的In2-1和In2-2基因，其应答于苯磺酰胺除草剂安全剂(美国专利No.5,364,780；Hershey et al.，Mol.Gen.Genetics 227：229-237(1991)和Gatz et al.，Mol.Gen.Genetics 243：32-38(1994))；玉米GST启动子，其由用作为前紧急(pre-emergent)除草剂的疏水亲电化合物激活；和烟草PR-1a启动子，其由水杨酸激活。感兴趣的其它受化学调控的启动子包括甾醇应答型启动子(见，例如Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素遏制型启动子(见，例如Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利Nos.5,814,618及5,789,156)。

组织优先型启动子可用于靶向特定的植物组织中增强的转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。组织优先型启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265、Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803、Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343、Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168、Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341、Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535、Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524、Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196、Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138、Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505中描述的那些。在一种实施方式中，启动子是偏好向植物的雄性或雌性组织表达的那些。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。本文描述的天然的Ms26启动子是可使用的启动子的一个例子。另一种此类启动子是5126启动子，其偏好于指导其连接的基因向植物雄性组织的表达，如美国专利Nos.5,837,851和5,689,051所述。其它例子包括美国专利No.6,037,523描述的Ms45启动子；美国专利No.6,452,069描述的SF3启动子；WO 02/063021描述的BS92-7启动子；美国专利No.5,470,359描述的SGB6调控元件；TA29启动子(Koltunow et al.(1990)″Differenttemporal and spatial gene expression patterns occur during antherdevelopment.″Plant Cell 2：1201-1224；Goldberg，R.B.，Beals，T.P.andSanders，P.M.，(1993)“Anther development：basic principles and practicalapplications”Plant Cell 5：1217-1229和美国专利No.6,399,856)；2型类金属硫蛋白基因启动子(Charbonnel-Campaa et al.，Gene(2000)254：199-208)和Brassica Bca9启动子(Lee et al.，Plant Cell Rep.(2003)22：268-273)。

雄性配子优先型启动子包括上文所述的PG47启动子以及ZM13启动子(Hamilton et al.，Plant Mol.Biol.(1998)38：663-669)；肌动蛋白解聚因子启动子(例如Zmabp1、Zmabp2；见，例如，Lopez et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：7415-7420)；玉米果胶甲基酯酶类似基因的启动子ZmC5(Wakeley et al.Plant Mol.Biol.(1998)37：187-192)；轮廓(profiling)基因启动子Zmprol(Kovar et al.，The Plant Cell(2000)12：583-598)；硫酸化五肽phytosulphokine基因ZmPSK1(Lorbiecke et al.，Journal of Experimental Botany(2005)56(417)：1805-1819)；钙调蛋白结合蛋白Mpcbp的启动子(Reddy et al.J.Biol.Chem.(2000)275(45)：35457-70)。

载体的其它组分可被包括，这还取决于基因的目的用途。例子包括选择标记、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。关于植物表达载体和报道基因的一般性描述和例子可见Gruber，et al.，“Vectorsfor Plant Transformation”in Method in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick et al eds；CRC Press pp.89-119(1993)。对合适的表达载体的选择将取决于宿主以及将表达载体引入宿主的方法。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止区域。终止区域可以是本发明的启动子核苷酸序列天然的，可以是目标DNA序列天然的，或者可以从另外的来源获得。

方便的终止区域可从A.tumefaciens的Ti质粒获得，例如胭脂氨酸合酶和章鱼碱合酶终止区域。还见Guerineau et al.Mol.Gen.Genet.262：141-144(1991)、Proudfoot，Cell 64：671-674(1991)、Sanfacon et al.Genes Dev.5：141-149(1991)、Mogen et al.Plant Cell2：1261-1272(1990)、Munroe et al.Gene 91：151-158(1990)、Ballas et al.Nucleic Acids Res.17：7891-7903(1989)、Joshi et al.Nucleic Acid Res.15：9627-9639(1987)。

表达盒可额外含有5’引导序列。此类引导序列可发挥作用以增强翻译。翻译引导序列是本领域已知的，其包括：举例而言，小核糖核酸病毒引导序列，EMCV序列(脑心肌炎5’非编码区域)，Elroy-Stein et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(1989)；马铃薯Y病毒组(potyvitus)引导序列，例如，TEV引导序列(烟草蚀纹病毒)，Allisonet al.；MDMV引导序列(玉米矮缩花叶病毒)，Virology 154：9-20(1986)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak et al.Nature 353：90-94(1991)；来自紫花苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白mRNA的非翻译引导序列(AMV RNA 4)，Jobling et al.Nature 325：622-625(1987)；烟草花叶病毒引导序列(TMV)，Gallie et al.(1989)Molecular Biology of RNA，pages237-256；以及玉米退绿斑驳病毒引导序列(MCMV)Lommel et al.Virology 81：382-385(1991)。还见ella-Cioppa et al.Plant Physiology84：965-968(1987)。表达盒还可含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，特别是质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于转运肽的编码序列。此类转运肽是本领域公知的，其包括但不限于针对酰基运载蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶、Zea mays Brittle-1叶绿体转运肽(Nelson et al.Plant physiol117(4)：1235-1252(1998)；Sullivan et al.Plant Cell3(12)：1337-48；Sullivanet al.，Planta(1995)196(3)：477-84；Sullivan et al.，J.Biol.Chem.(1992)267(26)：18999-9004)等。本领域技术人员将易于知道可获得的、用于向特定细胞器表达产物的很多选择。例如，大麦α淀粉酶序列通常被用于指导向内质网的表达(Rogers，J.Biol.Chem.260：3731-3738(1985))。转运肽的使用是公知的(例如，见美国专利Nos.5,717,084、5,728,925)。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适定向，以及适用的话，处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子(adapter)或接头(linker)，将DNA片段连起来，或者可包括进其它操作，以提供方便的限制性位点、移走过剩的DNA、移走限制性位点等。就此目的而言，可以包括进体外诱变、引物修复、限制性消化、退火、重新取代(resubstitution)(例如转换(transition)和颠换(transversion))。

如本文提到的，本发明提供了能表达目标基因的载体。一般而言，所述载体应当在植物细胞中具有功能。有时，载体在E.coli中具有功能可能是优选的(例如，生产蛋白质用与产生抗体、DNA序列分析、构建插入、获得核酸的量时)。用于在E.coli中克隆和表达的载体和流程在Sambrook et al.(如前文)中有讨论。

在表达盒中包含与异源核苷酸序列可操作相连的本发明的启动子序列的转化载体还可含有针对将被共转化进生物的基因的至少一种额外的核苷酸序列。或者，额外的序列可被提供于另一转化载体。

转化载体中可包括报道基因。本领域中已知的合适的报道基因的例子可见，例如Jefferson et al.(1991)in Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin et al.(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33、DeWet et al.Mol.Cell.Biol.7：725-737(1987)、Goff et al.EMBO J.9：2517-2522(1990)、Kainet al.BioTechniques 19：650-655(1995)和Chiu et al.Current Biology6：325-330(1996)。

转化载体中可包含选择性报道基因，用于选择经转化的细胞或组织。它们可包括赋予抗生素抗性或对除草剂的抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于：编码对氯霉素的抗性的基因，Herrera Estrella etal.EMBO J.2：987-992(1983)；对甲氨蝶呤的抗性的基因，Herrera Estrellaet al.Nature 303：209-213(1983)；Meijer et al.Plant Mol.Biol.16：807-820(1991)；对潮霉素的抗性的基因，Waldron et al.Plant Mol.Biol.5：103-108(1985)、Zhijian et al.Plant Science 108：219-227(1995)；对链霉素的抗性的基因，Jones et al.Mol.Gen.Genet.210：86-91(1987)；对奇霉素的抗性的基因，Bretagne-Sagnard et al.Transgenic Res.5：131-137(1996)；对博来霉素的抗性的基因，Hille et al.Plant Mol.Biol.7：171-176(1990)；对磺胺类抗性的基因，Guerineau et al.Plant Mol.Biol.15：127-136(1990)；对溴苯腈的抗性的基因，Stalker et al.Science 242：419-423(1988)；对草甘磷的抗性的基因，Shaw et al.Science 233：478-481(1986)和对草丁膦的抗性的基因，DeBlock et al.EMBO J.6：2513-2518(1987)。

还可使用可计分或可筛选的标记，其中，序列的存在会产生可被测量的产物。例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，已知其编码的酶有多种针对其的发色底物(例如，美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson et al.The EMBO Journal vol.6No.13 pp.3901-3907)和碱性磷酸酶。其它可筛选标记包括一般而言的花色素苷/类黄酮基因(见Taylor and Briggs，The Plant Cell(1990)2：115-127中的讨论)，其包括，例如R-基因座基因，其编码对植物组织中花青素苷色素(红色)的产生加以调控的产物(Dellaporta et al.，in Chromosome Structure and Function，Kluwer Academic Publishers，Appels and Gustafson eds.，pp.263-282(1988))；控制类黄酮色素生物合成的基因，例如玉米C1基因(Kao et al.，Plant Cell(1996)8：1171-1179；Scheffler et al.Mol.Gen.Genet.(1994)242：40-48)和玉米C2(Wienandet al.，Mol.Gen.Genet.(1986)203：202-207)；B基因(Chandler et al.，PlantCell(1989)1：1175-1183)，p1基因(Grotewold et al，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1991)88：4587-4591、Grotewold et al.，Cell(1994)76：543-553、Sidorenko et al.，Plant Mol.Biol.(1999)39：11-19)；bronze基因座基因(Ralston et al.，Genetics(1988)119：185-197；Nash et al.，Plant Cell(1990)2(11)：1039-1049)等。合适的标记的其它例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42)，黄色荧光蛋白基因(来自Evrogen的PhiYFPTM；见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54)；lux基因，其编码荧光素酶，可用例如X-射线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、低光摄像头、质子记录相机或多孔发光法来探测其存在(Teeri et al.(1989)EMBO J.8：343)；绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen et al.，PlantJ.(1995)8(5)：777-84)和DsRed2，其中经该标记基因转化的植物细胞是红色的，由此可通过视觉来选择(Dietrich et al.(2002)Biotechniques2(2)：286-293)。其它例子包括p-内酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75：3737)，已知其编码的酶有多种针对其的发色底物(例如PADAC，发色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：1101)，其编码儿茶酚双加氧酶，该酶可转化发色儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta et al.，Biotech.(1990)8：241)和酪氨酸酶基因(Katz et al.，J.Gen.Microbiol.(1983)129：2703)，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌，其进而再缩合形成易于被探测到的化合物黑色素。清楚地，本领域技术人员可获得很多此类基因。

转化/转染的方法对于本发明来说并非关键，目前可获得很多种转化或转染的方法。随着可获得更新的方法来转化作物或其它宿主细胞，它们可直接应用。因此，已经开发了多种方法，将DNA序列插入到宿主细胞的基因组中，以获得转录或转录本以及序列的翻译，以影响到生物中的表型变化。由此，可以使用提供高效转化/转染的任何方法。

本领域技术人员可获得的、用于将表达载体引入植物组织的方法是多变的，其将取决于所选用的植株。用于转化多种植物物种的流程是公知的，文献中对它们进行了描述。见，例如，前文所述的Miki et al，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”in Methods in Plant Molecular Biotechnology；Klein et al，Bio/Technology 10：268(1992)和Weising et al.，Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)。例如，可使用下述技术将DNA构建体引入植物细胞的基因组DNA，所述技术例如，微粒轰击介导的递送，Klein et al.，Nature 327：70-73(1987)；电穿孔，Fromm etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.82：5824(1985)；乙二醇(PEG)沉淀，Paszkowski et al.，EMBO J.3：2717-2722(1984)；直接基因转移WO85/01856和EP No.0 275 069；体外原生质体转化，美国专利No.4,684,611和对植物细胞原生质体或胚胎发生愈伤组织进行的显微注射Crossway，Mol.Gen.Genetics 202：179-185(1985)。将植物组织与Agrobacterium tumefaciens共培养是另一种选择，其中，将DNA构建体放进双向载体系统。见，例如，美国专利No.5,591,616\Ishida et al.，“High Efficiency Transformation of Maize(Zea mays L.)mediated byAgrobacterium tumefaciens”Nature Biotechnology 14：745-750(1996)。Agrobacterium tumefaciens宿主的毒力功能将在细胞被细菌感染时指导构建体插入到植物细胞DNA中。见，例如Horsch et al.，Science 233：496-498(1984)和Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803(1983)。

用于转化芥菜的标准方法如Moloney et al.“High EfficiencyTransformation of Brassica napus using Agrobacterium Vectors”Plant CellReports 8：238-242(1989)所述。玉米转化如Fromm et al，Bio/Technology8：833(1990)和前文提到的Gordon-Kamm et al所述。Agrobacterium主要用于双子叶植物，但是某些单子叶植物，例如玉米也可被Agrobacterium转化。见上文提到的文献以及美国专利No.5,550,318。水稻转化如Hieiet al.，“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativs L.)Mediated byAgrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA”The Plant Journal 6(2)：271-282(1994，Christou et al，Trends inBiotechnology 10：239(1992)和Lee et al，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA88：6389(1991)所述。可通过与用于转化玉米或水稻的技术相似的技术来转化小麦。高粱转化如Casas et al，supra and sorghum by Wan et al，PlantPhysicol.104：37(1994)所述。大豆转化在大量公开本文(包括美国专利No.5,015,580)中都有所描述。

当提到将核苷酸序列“引入”植株时，其表示这可通过直接转化方法发生，所述方法例如对植物组织的Agrobacterium转化，微粒轰击，电穿孔或者本领域技术人员已知的多种方法的任何一种；或者，这可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来进行，使得后代具有并入它们基因组的核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员公知的。

本文使用的植物育种方法是本领域技术人员公知的。关于对植物育种技术的讨论，见Poehlman(1987)Breeding Field Crops.AVI PublicationCo.，Westport Conn。可通过利用了植物授粉方法优点的技术，来对本发明的方法中最为优选的很多植物进行育种。

回交方法可用于将基因引入植株。该技术用于向植株引入性状已有数十年历史。关于该技术和公知的其它植物育种方法学的描述的例子可在参考文献，例如Plant Breeding Methodology，edit.Neal Jensen，JohnWiley & Sons，Inc.(1988)中找到。在一种典型的回交方案中，人们感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带有待转移的目标单基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将从该杂交得到的后代再次与轮回亲本杂交，重复该过程，直到获得下述植株，其中，在经转化的植株中，除了来自非轮回亲本的单个转移基因，所有想要的轮回亲本的形态和生理特征都复原了。

在本发明的某些实施方式中，人们希望使用转基因恢复手段时能保持雄性不育植株的雄性不育纯合隐性状态，同时减少保持具有此类性状的植株所需的植株、培植和步骤的数量。纯合性是这样的遗传状态，此时在同源染色体上对应的基因座上存在相同的等位基因。杂合性是这样的遗传状态，此时，在同源染色体对应的基因座上存在的是不同的等位基因。半合性是这样的遗传状态，此时仅有基因(或基因的组)的一个拷贝，在姐妹染色体上没有等位基因副本。在一种实施方式中，纯合隐性状态导致向植株赋予目标性状，该性状可以是从隐性基因型得来的、人们想要的任何性状，例如增加的干旱或寒冷耐受性、早成熟、改变的油或蛋白质含量或者对于植物育种者而言感兴趣的很多性状中的任何。在一种实施方式中，纯合隐性状态向植物赋予雄性不育。当将纯合状态的功能补足序列引入植株(即，当在具有纯合隐性状态的植株中引入并表达时，能恢复野生型状态的序列)时，生育力得以恢复，这是通过野生型生育力表型的恢复实现的。

对纯合隐性状态的保持通过这样来获得：将恢复性转基因构建体引入植株，该构建体与干扰所述植株雄性配子的形成或功能的序列相连，以产生保持系或供体植株。恢复性转基因引入遗传性状纯合隐性的植株时，能恢复该性状的遗传功能，使得该植株仅产生含有隐性等位基因拷贝而不含恢复性转基因的可育花粉。转基因在保持系植株中被保持为半合的情形。转基因这个术语表示通过遗传工程技术引入细胞基因组的任何核酸序列。转基因可以是天然DNA序列或者异源DNA序列(即“外源DNA”)。术语天然DNA序列指在细胞中天然发现的核苷酸序列，但是其可以经历过对其原始形式的修饰。来自保持系的花粉可用于使对该隐性性状来说纯合的植株受精，后代将因此保留它们的纯合隐性状态。含有恢复性转基因构建体的保持系植株通过自体受精来繁殖，得到的种子用于生产是纯合隐性植株以及含有恢复性转基因构建体的更多植株。

保持系植株用作为花粉供体，供给给具有纯合隐性性状的植株。可选地，保持系从具有纯合隐性性状的植株产生，其还具有引入其中、将恢复纯合隐性等位基因产生的性状的核苷酸序列。此外，恢复性序列与干扰雄性配子的形成或功能的核苷酸序列相连。该基因能通过多种公知形式中的任何形式起作用，防止雄性配子的形成或者防止雄性配子的功能，这并不限于特定的方法。非限制性地举例而言，这可包括使用下述基因，所述基因表达对雄性配子具有细胞毒性的产物(见，例如，5,792,853、5,689,049、PCT/EP89/00495)；抑制对于雄性配子功能或形成来说另一重要基因的产物形成(见，美国专利Nos.5,859,341、6,297,426)；与另一基因产物组合，产生阻碍基因形成或功能的物质(见，美国专利Nos.6,162,964、6,013,859、6,281,348、6,399,856、6,248,935、6,750,868、5,792,853)；反义于对雄性配子的功能或形成来说关键的基因或者导致对上述基因的共遏制(见，美国专利Nos.6,184,439、5,728,926、6,191,343、5,728,558、5,741,684)；通过使用发卡形成来干扰表达(Smith et al.(2000)Nature 407：319-320、WO 99/53050和WO98/53083)等。已知很多核苷酸序列能抑制花粉形成或功能，能执行此功能的任何序列都满足要求。对于能影响正确发育或功能的基因的讨论包括在美国专利No.6,399,856中，其包括显性不良(negative)基因，例如细胞毒素基因、甲基化酶基因和生长抑制基因。显性不良基因包括白喉毒素A-链基因(Czako，M.and An，G.(1991)“Expression of DNAcoding for Diptheria toxin Chain A is toxic to plant cells”Plant Physiol.95687-692.and Greenfield et al PNAS 80：6853(1983)，Palmiter et al Cell50：435(1987))；细胞周期分裂突变体，例如玉米中的CDC(Colasanti，J.，Tyers，M.and Sundaresan，V.，“Isolation and Characterization of cDNAclones encoding a functional P34 cdc2 homologue from Zea mays”PNAS88，3377-3381(1991))；WT基因(Farmer，A.A.，Loftus，T.M.，Mills，A.A.，Sato，K.V.，Neill，J.，Yang，M.，Tron，T.，Trumpower，B.L.andStanbridge，E.G.Hum.Mol.Genet.3，723-728(1994))；和P68(Chen，J.J.，Pal，J.K.，Petryshyn，R.，Kuo，I.，Yang，J.M.，Throop，M.S.，Gehrke，L.and London，I.M.“Eukaryotic translation initiation kinases”PNAS 88，315-319(1991))。

所谓的“细胞毒素”基因的更多例子在上文有所讨论，其可以包括但不限于来自Erwinia chrysanthermi的果胶酸盐裂合酶基因pelE(Kennet al J.Bacteroil 168：595(1986))；来自cms-T玉米线粒体基因组的T-urf13基因(Braun et al Plant Cell 2：153(1990)；Dewey et al.PNAS84：5374(1987))；来自Bacillus thuringiensis Israeliensis的CytA毒素基因，其导致细胞膜破裂(McLean et al J.Bacteriol 169：1017(1987)，美国专利No.4,918,006)；DNAses、RNAses(美国专利No.5,633,441)；蛋白酶，或表达反义RNA的基因。合适的基因还可编码涉及抑制雌蕊发育、花粉柱头相互作用、花粉管生长或受精或其组合的蛋白。此外，干扰淀粉在花粉中的正常积累或者影响花粉中渗透平衡的基因也可能是合适的。

在一种阐述性的实施方式中，使用DAM甲基化酶，其在上文和美国专利Nos.5,792,852和5,689,049中有所讨论，其表达产物催化对植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化。经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活，其仅在表达DAM甲基化酶基因的组织中才能找到。在另一种实施方式中，可以使用α-淀粉酶与雄性组织优先型启动子。在谷物种子最初的发芽期间，糊粉层细胞将合成α-淀粉酶，其参与水解淀粉形成葡萄糖和麦芽糖的过程，由此提供胚芽生长所需的营养物质(J.C.Rogers and C.Milliman，J.Biol.Chem.，259(19)：12234-12240，1984；Rogers，J.C.，J.Biol.Chem.，260：3731-3738，1985)。在一种实施方式中，所用的α-淀粉酶基因可以是Zea mays α-淀粉酶-1基因。Young et al.“Cloning of an α-amylasecDNA from aleurone tissue of germinating maize seed”Plant Physiol.105(2)759-760和GenBank编号No.L25805，GI：426481。典型地，花粉细胞中找不到编码α-淀粉酶的序列，当被指导向雄性组织表达时，结果是花粉粒能量来源崩溃以及花粉发育被遏制。

该领域技术人员易于认识到，本文所述的方法可应用于具有异交(outcross)可能性的任何其它作物。非限制性地举例而言，其可包括玉米、大豆、高粱或具有异交能力的任何植物。

普通地，为制造具有隐性状态的更多植株，可以将隐性植株与另一隐性植株杂交。对于一些隐性性状来说，这可能并非是人们想要的，并且，对于影响繁殖发育的隐性性状来说可能是无法实现的。或者，可以将纯合植株与具有恢复性基因的第二植株杂交，但是这需要进一步杂交至分离开恢复性基因，以再次达到隐性的表型情形。代替性地，在一种方法中，可以保持纯合隐性状态，同时将其与保持系植株杂交。该方法可用于想要继续保持隐性状态的任何状况。这产生了具有成本效益的系统，该系统相对容易操作，以保持纯合隐性植株的群体。

孢子体基因是独立于配子起作用的基因。当纯合隐性状态是通过阻碍雄性孢子体发育来导致雄性不育的时候，保持系植株就必须含有功能性的恢复性转基因构建体，该构建体能补足突变以及使得纯合隐性植株能产生可育花粉。将该孢子体恢复性基因与第二功能性核苷酸序列(干扰植株雄性配子的形成或功能)相连导致产生了下述保持系植株，该植株产生的花粉仅含有孢子体基因在其天然基因座上的隐性等位基因，这是由于第二核苷酸序列干扰了花粉形成或功能的作用导致的。针对恢复性转基因构建体而言，该可育花粉级分(fraction)是非转基因的。

在又一种实施方式中，如前文所讨论的标记基因可随着恢复性转基因一起提供于构建体中。非限制性地举例而言，使用除草剂抗性标记，例如bar使得人们可以除去不具有恢复性转基因的细胞。在另一个实施例中，当使用可计分标记，例如红色荧光标记，例如DsRed2时，还可通过视觉探测到转基因的任何无意(inadvertent)传播，此类逃逸被从后代中除去。清楚地，恢复性构建体中的很多其它变化是本领域技术人员已知的。

在一种阐释性的实施方式中，提供了保持雄性不育植株在遗传基因座上的纯合隐性状态的方法，其中，使用第一核苷酸序列(这是对雄性生育力来说关键的基因)，第二核苷酸序列(其会抑制可育雄性配子的形成或功能)，可选的第三核苷酸序列(其与第一序列可操作地相连，偏好于在雄性植物细胞中表达该序列)，可选的第四核苷酸序列(与第四核苷酸序列可操作地相连，该第四核苷酸序列指导向雄性配子的表达)以及可选的第五核苷酸序列(其是允许对植物细胞加以选择的选择标记或可计分标记)。

例如，人们想要生产用于杂交体生产方法的雄性不育的雌性植株，所述植株的不育是Ms45基因中突变纯合的结果，该基因对于雄性生育力来说是关键的。此类突变体Ms45等位基因被命名为ms45，ms45纯合的植株(用ms45/ms45代表)展现出纯合隐性的雄性不育基因型，其不产生功能性花粉。见美国专利Nos.5,478,369、5,850,014、6,265,640和5,824,524。在近交系和杂交体生产方法中，保持住这种纯合隐性状态是人们高度期待的。当将编码Ms45基因的序列引入具有纯合状态的植株时，就导致了雄性生育力的产生。通过本发明的方法，可向ms45/ms45纯合隐性植株引入功能性孢子体Ms45基因，由此成为雄性可育的。该基因可与造成含有恢复性转基因构建体的花粉无功能或者阻碍其形成的基因，或者在花粉中产生致死产物的基因相连，与指导其表达向雄性配子的启动子相连，以产生这样的植株，所述植株仅产生含有ms45而不含恢复性转基因构建体的花粉。

一个例子是这样的构建体，其包括Ms45基因，该基因与5126启动子相连，该启动子是雄性组织优先型启动子(见美国专利No.5,750,868、5,837,851和5,689,051)，并且该基因还与处于聚半乳糖醛酸酶启动子——PG47启动子(见美国专利No.5,792,853、5,689,049)控制下的细胞毒性DAM甲基化酶基因相连，该构建体为半合状态。因此，得到的植株产生花粉，但是可育的花粉仅来自不含恢复性Ms45/DAM甲基化酶构建体的等位基因，并且因此仅含ms45基因。因此其可被用作为授粉者使纯合隐性植株(ms45/ms45)受精，产生的后代将继续是雄性不育的，这是保持了关于ms45的纯合性的结果。后代也将不含引入的恢复性转基因构建体。

在又一恢复性构建体的例子中，Ms26基因与5126启动子相连，还与处于雄性组织优先型PG47启动子控制下的Zea mays α-淀粉酶相连。用于一种实施方式中的可计分标记是DS-RED EXPRESS。

本发明的方法的一种期待结果是具有恢复者核苷酸序列的植株可被自体受精，即将来自该植株的花粉转移到同一植株的花上，以获得恢复者植株的繁殖。(注意，提到“自体受精”时其包括这样的情况：产生花粉的植株被用同一植株的花粉受精，以及包括这样的情况：将两株或多株一样的(identical)近交植株种植到一起，用来自一样的近交植株的花粉对不同的一样的近交植株(a different identical inbred plant)授粉)。花粉将不含恢复性转基因构建体，但胚珠(雌性配子)中的50％将含有该构建体。从自体受精得到的种子可被种植，针对具有恢复性转基因构建体的种子加以选择。选择过程可通过多种已知方法中的任何方法来进行，最常用的是将恢复性核苷酸序列与标记基因相连。标记可以是可计分的或选择性的，其允许产生从具有待鉴定的恢复性基因的种子产生的那些植株。

在本发明的一种实施方式中，有可能使雄性配子-组织优先型启动子是诱导型的。由此允许：在需要的时候，通过使具有恢复性核苷酸序列的植株是组成型雄性不育的，来在该过程中进行额外的控制。这种类型的雄性不育参见美国专利No.5,859,341。为使该植株变得可育，必须提供诱导物质，植株将成为可育的。同样，当与上文所述的本发明的方法组合时，仅产生的花粉将不含恢复性核苷酸序列。

下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，这并非意欲对本发明的范围加以限制。

实施例1    对ms26-m2::Mu8的鉴定和共分离

鉴定出来自增变子(Mu)种群的植株家族，针对基本上雄性不育的植株进行分离(segregated)，这些植株没有或仅有很少突出的异常花粉囊，并且没有花粉存在。雄性不育被认为是下述情况的后果，其中，Mu元件随机整合进负责小孢子发生中某些步骤的基因，破坏了该基因的表达。培育来自分离的F₂家族(a segregating F₂ family)(其中雄性不育突变被命名为ms26^*-SBMu200)的植株，基于上述标准针对雄性可育/不育加以分类。取叶片样品，随后以每个表型类别(雄性可育对雄性不育)大约20株植株的比例分离DNA。

进行Southern杂交印迹分析，来验证Mu与不育之间的联系。Southern杂交印迹分析是本领域技术人员公知的技术。该常用流程包括：分离植株的DNA，用限制性内切酶进行切割，在琼脂糖凝胶上通过分子量对经切割的DNA加以分级分离，将其转移到尼龙膜上，以固定分离开的DNA。随后用经P³²P-dCTP放射性标记的探针片段对这些膜杂交，在SDS溶液中洗涤。Southern，E，“Detection of Specific Sequences AmongDNA Fragments by Gel Electrophoresis，”J.Mol.Biol.98：503-317(1975)。培育来自分离的F₂ms26^*-SBMu200家族的植株，针对雄性可育/不育加以分类。叶片样品和随后的DNA分离以每个表型类别大约20株植株的比例来进行。用EcoRI消化来自5株可育和12株不育植株的DNA(～7ug)，通过0.75％琼脂糖凝胶进行电泳。通过Southern转移将经消化的DNA转移到尼龙膜上。用来自Mu8转座子的内部片段对该膜进行杂交。对膜进行的自动放射照相揭示了大约5.6Kb的EcoRI片段与不育表型的共分离，如图1所示。该EcoRI条带在可育植株中分离暗示了该等位基因的杂合野生状态。

实施例2    文库构建、筛选和图谱定位

筛选基因组文库的方法是本领域技术人员熟知的，其被描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLab Press，Plainview，NY(1989)。按照下文所述来构建文库。

用EcoRI消化来自不育植株的DNA，在制备性凝胶上跑胶。从凝胶上切下分子量在5.0至6.0Kb之间的DNA，电洗脱并进行乙醇沉淀。使用厂商方案，将该DNA连接进Lambda Zap载体(Stratagene^TM)。使用Gigapack Gold(Stratagene^TM)，将连接的DNA包装进噬菌体颗粒。用大约500,000PFU涂板，将其印到硝酸纤维素膜上。用Mu8探针对膜进行杂交。3轮筛选后获得纯的克隆。从噬菌体上切下作为质粒的插入物，将其命名为SBMu200-3.1。分离出来自该克隆的PstI边界片段，用于对原来的EcoRI共分离(cosegregation)杂交印迹进行再次探针检测，如图2B所示。大约5.6kb的EcoRI片段在所有不育植株中都是纯合的，这证实，正确的Mu片段被分离。可育植株中的三株的5.5kb的EcoRI条带和4.3Kb的EcoRI条带是杂合的。可育植株中的两株的4.3kb EcoRI条带(推测是野生型等位基因)是纯合的。

用PstI探针在RFLP图谱定位群中(RFLP mapping population)对ms^*-SBMu200突变进行定位。该突变体被定位至第1染色体，靠近雄性不育基因座Ms26(Loukides et al.，(1995)Amer.J.Bot 82，1017-1023)。为测试ms^*-SBMu200是否是ms26-ref的等位基因，使用已知杂合子作为花粉供体使ms^*-SBMu200和ms26-ref互相杂交。测试杂交后代按照1：1的比例分离为雄性不育和野生型植株，这表明了ms^*-SBMu200和ms26-ref之间是等位基因关系。ms^*-SBMu200等位基因被命名为ms26-m2::Mu8。图谱位置如图13所示。

实施例3对    其它ms26等位基因的鉴定和克隆

通过使用针对Mu的聚合酶链式反应(PCR)引物和针对Ms26的基因特异性引物，以及通过对Mu F₁家族的种群进行筛选，来鉴定Ms26中的其它Mu插入突变。对PCR产物的序列分析显示，在第二外显子中存在全部三处Mu插入(图1)。培育来自这些家族之一的F₂种子，针对雄性可育/不育对其进行检查。对该家族进行的Southern杂交印迹分析证实了Ms26中Mu插入与雄性不育表型的共分离，等位基因被命名为ms26-m3::Mu。

还对Loukides et al.，(1995)Amer.J.Bot 82，1017-1023中描述的、被命名为ms26-ref的ms26等位基因进行了研究。为分析ms26-ref中的突变，从ms26-ref不育和可育植株克隆Ms26基因组序列。Ms26作为～4.2kb的EcoRI片段被克隆，ms26-ref作为～6kb的HindII片段以及重叠的～2.3kb的EcoRI片段从不育植株被克隆。序列分析揭示了图1示出的ms26-ref等位基因的最后一个外显子中新片断(1,430bp)的存在。发现在插入的元件侧翼有8bp的宿主位点副本(GCCGGAGC)，该元件还含有15bp的末端反向重复(TIR)(TAGGGGTGAAAACGG；SEQ ID NO：23)。转座子序列如图15所示(SEQ ID NO：10)。ms26-ref基因组序列整体如图16、SEQ ID NO：11所示。还发现了ms26-ref等位基因的变体。对命名为ms26’-0406的该等位基因的序列分析发现丢失了在ms26-ref等位基因最后一个外显子中发现的1430bp的片断，但保留有插入位点处8bp的足迹(footprint)。针对ms26’-0406等位基因纯合的植株是雄性不育的。对切割等位基因ms26’-0406(SEQ ID NO：8)和野生型基因中的区域(SEQ ID NO：9)的比较如图14所示。

实施例4    表达分析和cDNA分离

Northern分析可用于探测小孢子发生(microsporogenesis)的多个状态下花粉囊发育的特征基因的表达。Northern分析也是本领域技术人员熟知的技术，其与Southern分析类似，除了是对mRNA而非DNA进行分离以及放置到凝胶上。然后用RNA与经过标记的探针杂交。Potter，E.，et al.，″Thyrotrotropin Releasing Hormone Exerts Rapid Nuclear Effects toIncrease Production of the Primary Prolactin in RNA Transcript，″Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78：6662-6666(1981)，Lechelt，et al.，″Isolation & MolecularAnalysis of the Plows，″Mol.Gen.Genet.219：225-234(1989)。用来自SBMu200-3.1克隆的PstI片段来对含有核(kernel)、未成熟的耳穗(ear)、幼苗和雄穗RNA(tassel RNA)的Northern印迹进行探针探测。仅在小孢子发生的大致为四分体(quartet)的阶段的雄穗RNA中观察到了信号，如图3所示。转录本大约为2.3kb长。还用同样的探针对从mRNA构建的cDNA文库进行了筛选，mRNA是从减数分裂至晚期单核阶段的花粉囊分离的。从文库中分离出了被命名为Ms26-8.1的一个克隆。

实施例5    序列和表达分析

通过Loftstrand Labs Limited.Sanger，F.，Nicklen，S.，Coulson A.R.(1977)“DNA sequencing with chain terminating inhibitors”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467对SBMu200-3.1基因组克隆和Ms26-8.1cDNA克隆进行测序。序列如图4和5所示，比较如图6所示。cDNA/基因组比较揭示了存在于基因组克隆中的5个内含子。Mu8插入发生于外显子1。针对密码子偏好和每个密码子第三个位置上的非随机性进行的测试与cDNA中主要的ORF(可能是蛋白质编码ORF)相符。在基因组克隆的第1089位有推定的Met起始密码子。相对基因组克隆的cDNA同源从第1094位核苷酸开始。因此，Ms26-8.1不代表全长克隆，其缺少推定的Met起始密码子前的5个碱基。数据库搜索揭示了酵母、植物和哺乳动物中发现的P450酶之间的显著同源性。P450酶已被很好地研究，已阐明了三个特征性蛋白结构域。Ms26蛋白含有真核P450所特有的若干结构基元，包括血红素结合结构域FxxGxRxCxG(结构域D；SEQID NO：24)、结构域AA/GGXD/ETT/S(双氧结合)、结构域B(甾醇结合)和结构域C。在MS26中发现了作为FQAGPRICLG(SEQ ID NO：25)的高度保守的血红素结合基元，其与C末端相隔51个氨基酸。双氧结合结构域AGRDTT(SEQ ID NO：26)位于第320-325位氨基酸之间。甾醇结合结构域被发现为LVYLHACVTETLR(SEQ ID NO：27)，第397-409位氨基酸。Genebank数据库中探测到的最显著同源的序列是来自水稻的推测蛋白质序列(GeneBank编号19071651)。第二高度同源的序列是推定的Arabidopsis P450基因(CYP704B1)，其功能还未知。图17A显示了对CYP704B1(SEQ ID NO：12)和Ms26(SEQ ID NO：13)的序列比对。对一些P450基因的系统发生树分析揭示：Ms26与Arabidopsis thaliana和Vicia sativa中发现的涉及脂肪酸Ω-羟基化的P450s最密切相关(图17B)。ms26’-0406切割突变中导致的翻译框偏移被认为破坏了血红素结合结构域的活性，由此导致了不育。见图18的比较(SEQ ID NO：14上的Ms26cDNA；SEQ ID NO：15上的生育力外显子5和SEQ ID NO：16上的不育外显子5)。

使用Ms26 cDNA探针，针对含有小孢子发生各阶段的mRNA的northern，进行进一步的表达研究。图7A显示了用来自不同组织的RNA样品进行Northern杂交印迹，所述组织包括根(1)、叶(2)、荚(3)、穗轴(4)、耳穗小穗(5)、穗丝(6)、未成熟胚(7)、成熟胚(8)以及来自可育植株(9)、ms26-m2::Mu8不育植株(10)、ms26-ref不育植株(11)和可育植株(12)的雄穗。使用Ms26cDNA仅在雄穗组织中探测到了杂交信号。图7B显示了对含有小孢子发生各阶段的mRNA的Northern的杂交印迹。从减数分裂II/四分体阶段(4)至晚期单核阶段(10)，使用Ms26cDNA探测到了杂交信号，从早期单核到晚期单核阶段(10)观察到了最大的信号。

实施例6    对启动子及其必要区域的鉴定

可按照Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.et al.eds；John Wiley and Sons，New York pp.4.8.1-4.8.5(1987)所述，通过引物延伸分析来鉴定推定的TATA盒。

可使用功能性分析在基因组亚克隆中鉴定花粉囊基因的调控区域，例如启动子，这通常通过观察到花粉囊组织中报道基因的表达以及非花粉囊组织中报道基因不表达或以较低水平表达来验证。可以通过将含有上游区域的DNA片段亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，来检测位于翻译起始位点“上游”或5’的调控区域的可能性。预期较小的亚基因组片段可能含有对于雄性组织优先型表达来说必要的区域。例如，如美国专利No.5,352,605所述，在从较大的基因组碎片获得的相对较小的片段中鉴定出了CaMV 19S和35S启动子的必要区域。

对用来测试功能性表达的合适表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体引入宿主的方法，此类方法是本领域技术人员公知的。对于真核生物而言，载体中的区域包括控制转录起始和转录加工的区域。这些区域与报道基因，例如UidA(编码葡糖醛酸糖苷酶)或荧光素酶可操作地相连。对于植物表达载体和报道基因的一般性描述和例子可见Gruber，et al.，“Vectors for Plant Transformation”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology；Glick，et al.eds；CRC Press；pp.89-119；(1993)。GUS表达载体和GUS基因盒可从Clonetech，Palo Alto，CA商业获得，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因可从PromegaCorporation，Madison，WI获得。Ti质粒和其它Agrobacterium载体如Ishida，Y.，et al.，Nature Biotechnology；Vol.14；pp.745-750；(1996)and inU.S.Pat.No.5,591,616“Method for Transforming Monocotyledons”(1994)所述。

含有位于基因组片段中的推定调控序列的表达载体可被引入完整组织，例如，分阶段的花粉囊、胚，或者引入愈伤组织。DNA递送的方法包括微粒轰击、DNA注射、电穿孔和Agrobacterium介导的基因转移(见Gruber，et al.，″Vectors for Plant Transformation，”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick，et al.eds.；CRC Press；(1993)、美国专利No.5,591,616和Ishida，Y.，et al.，Nature Biotechnology；Vol.14；pp.745-750；(1996))。培养植物组织的一般性方法可见上文的Gruber，et al.和上文的Glick。

对于瞬时检验系统而言，将分阶段的、分离的花粉囊立即放置到用0.5％植物凝胶固化的雄穗培养基(Pareddy，D.R.and J.F.Petelino，CropSci.J.；Vol.29；pp.1564-1566；(1989))或者其它固体培养基上。优选通过微粒介导的递送，于1000-1100Psi，用1.2μm微粒在5小时内将表达载体DNA引入。DNA递送之后，在同样的雄穗培养基上于26℃对花粉囊进行17小时的温育，通过制备全组织匀浆以及检验GUS或荧光素酶活性来进行分析(见上文的Gruber，et al.)。

基因组克隆ms26-m2::Mu8中，Ms26的可能的翻译起始密码子上游存在1088bp的DNA。用编码荧光素酶和葡糖醛酸糖苷酶的报道基因，制造了通过工程化NcoI位点进行的翻译融合，以测试该DNA片段在经轰击植物组织的瞬时表达检验中是否具有启动子活性。活性显示于花粉囊中，在胚芽鞘、根和愈伤组织中没有，这表明了花粉囊优先型或花粉囊特异性的启动子活性。

通过观察发现了合理的TATA盒，其在翻译起始密码子上游的大约83-77bp处。基因组克隆ms26-m2::Mu8由此包括可能的TATA盒上游的大约1005bp。对于典型的植物基因而言，转录的起始发生于TATA盒的下游26-36bp，这将把大约48-58nt的5′非翻译引导序列给Ms26mRNA。总共1088bp的ms26-m2::Mu8亚基因组片段(包括非翻译引导序列、转录起始、TATA盒和TATA盒上游的序列)由此显示为对启动子活性来说是足够的。见图8，其是SEQ ID NO：5。对推定的TATA盒(TATATCA)用下划线标注。因此，本发明包括具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列(或具有序列同一性的那些)并且具有雄性组织优先型调控区域的功能的DNA分子。

缺失分析既可从调控区域的5’末端开始，也可从其3’末端开始：可通过定点诱变、使用聚合酶链式反应的诱变等来获得片段(Directed Mutagenesis：A Practical Approach；IRL Press；(1991))。通过与推定的TATA盒的接近性，或者如果必要的话，通过3’缺失来描述雄性组织优先型调控区域的3’末端。然后可将必要区域与选用的核心启动子可操作地相连。一旦鉴定出了必要区域，既可通过Ms26的雄性组织优先型区域加上核心启动子来控制外来基因的转录。核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子(Gruber，et al.，″Vectors forPlant Transformation″in Mehtods in Plant Molecular  Biol and Biotechnology；Glick，et al.eds.；CRC Press；pp.89-119；(1993))。优选地，启动子是雄性组织优先型基因的核心启动子或CaMV 35S核心启动子。更优选地，启动子是雄性组织优先型基因的启动子，具体地，Ms26核心启动子。

其它突变分析，例如通过接头扫描(本领域公知的方法)可以鉴定出含有花粉囊优先型表达所需的序列的小片断。这些突变可引入功能性修饰，例如在表达水平，在表达时机或者在表达的组织方面引入。突变还可以是沉默的，并且没有可观察到的效果。

前述流程被用于鉴定Ms26启动子的必要区域。在将启动子与荧光素酶标记基因连接后，在推定的TATA盒上游的启动子区域上进行缺失分析，如图9所示。条形图的x轴线是从启动子5’末端开始的一系列缺失衍生物中保留的推定TATA盒上游紧邻的碱基对数量。y轴显示了作为全长启动子活性百分比的标准化荧光素酶活性。

如图所示，显而易见地，TATA盒上游紧邻的约176bp与核心启动子(推定的TATA盒到转录起始)偶联，加上5’非翻译引导序列，足以在花粉囊中瞬时表达。相反，从5’末端到推定TATA盒上游91bp处有进一步缺失时，荧光素酶活性是最小限度的。推定TATA盒上游的这176bp到非翻译引导序列可被认为是最小限度的启动子，这在图10中有进一步展示。TATA盒被下划线示出。在相对TATA盒而言-176到-92的全长启动子中的缺失导致活性减少至野生型的大约1％。从-39到-8的缺失不会显著减少活性。因此，-176到-44的区域含有必要区域，因此将组成上游增强子元件，向启动子赋予花粉囊的表达，其被我们成为“花粉囊盒”。

以9-10bp的增量，在花粉囊盒中进行接头扫描分析。该区域中接头扫描取代的位置示于图10，突变体相对于野生型序列的表达水平示于图11。在突变体LS12和LS13中，推定TATA盒上游52-71bp的区域，观察到了对花粉囊中的瞬时表达最激烈的影响。还在突变体LS06、LS07、LS08和LS10中，推定TATA盒上游82-131bp的区域内，观察到了对花粉囊中瞬时表达的较大影响。花粉囊盒中，在花粉囊中瞬时表达的野生型水平所需的序列由此显示为相对推定TATA盒而言-52至-131的区域，特别是-52至-71的区域。这些必要区域示于SEQ ID NO：6(图10)，与基因组序列SEQ ID NO：7(图5)相比，是碱基1-1088、830-962、830-914、917-962、875-954、935-954和875-924。

实施例7    Ms26高粱、水稻和玉米比较

如前文所述，Ms26是玉米中的雄性生育力基因。当其被突变，及成为纯合隐性时，将导致雄性不育。在高粱中鉴定出了Ms26的直向同源体。用高粱雄穗cDNA作为模板，使用玉米Ms26基因引物，通过聚合酶链式反应分离出Ms26cDNA的高粱直向同源体。通过前文所述的方法对得到的cDNA片段进行测序，然后将其与来自玉米的Ms26cDNA加以比较。核苷酸比较如图12所示，其显示了90％的同一性。还鉴定出了来自水稻的直向同源体，其预测的编码序列(SEQ ID NO：17)和蛋白(SEQ ID NO：18)如图19所示。其比玉米和高粱Ms26少一个内含子，编码序列是高度保守的。

对高粱和水稻启动子的鉴定已完成。图20显示了对玉米(SEQ IDNO：5)、高粱(SEQ ID NO：19)和水稻(SEQ ID NO：20)的Ms26启动子的比对。图中所示的玉米启动子的最后三个碱基是翻译的ATG起始。

图21反映了对玉米Ms26蛋白质(SEQ ID NO：2)、水稻Ms26蛋白质(SEQ ID NO：18)和高粱Ms26蛋白质(SEQ ID NO：4)以及共有序列(SEQ ID NO：21)的比对。对蛋白质序列的比较显示，蛋白质在直向同源体中是高度保守的，水稻蛋白质与玉米直向同源体相比享有92％的相似性和86％的同一性。水稻和高粱中预测的组织特异性进一步反映于对从圆锥花序(花)文库获得的高粱和水稻EST数据库中Ms26蛋白的比较。产生显著对齐的高粱序列(GenBank编号BI075441.1、BI075273.1、BI246000.1、BI246162.1、BG948686.1、BI099541.1和BG948366.1等)全部都是来自高粱未成熟圆锥花序的序列，水稻中显示出显著对齐的序列(GenBank编号C73892.1、CR290740.1等)也是来自水稻未成熟圆锥花序的。

如上所述，显而易见地，被定位于Zea mays基因组1号染色体短臂上的核苷酸序列(与Ms26基因，ms26-m2::Mu8及其等位基因在同一位点)是对于植株雄性生育力来说关键的基因，即，是植株的雄性生育力必不可少的，或者，当其从可育植株中发现的序列突变时，将导致植株不育。

实施例8    构建包含选择标记、雄性生育力基因Ms45和花粉细 胞毒素基因的植物转化载体

通过装配下述DNA组件，制造图22所示的被称为PHP18091的构建体：

1.质粒pSB11骨架DNA(pSB31，缺少携带35SGUS和35SBAR基因的EcoRI片段，Ishida et al.，Nature Biotechnol.(1996)14：745-750)。该DNA骨架含有来自pBR322的复制起点以及T-DNA边界序列。

2.35S：PAT基因，其编码来自Streptomyces viridochomagenes的草丁膦乙酰转移酶(PAT)基因(编号A02774的6-557位核苷酸，Strauchet al.1988，EP 0275957-A；SEQ ID NO：22)，该基因处于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和终止子(分别是第6906-7439位及第7439-7632位核苷酸，来自Franck et al.1980，Cell 21：285-294；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)的转录控制下。

3.5126：Ms45基因，其含有处于玉米花粉囊特异性启动子5126(985-1490位核苷酸，编号I75204；SEQ ID NO：26)控制下的玉米雄性生育力基因编码区域(1392-3343位核苷酸，编号AF360356，Albertsenet a Am.J.Bot..(1993)80：16；SEQ ID NO：25)。

4.PG47：DAM基因，其含有由玉米花粉特异性启动子PG47(1-2870位核苷酸，编号X66692，Allen and Lonsdale，Plant J.(1993)3：261-271；SEQ ID NO：27)驱动的E.coli DNA(Adenosine-N⁶)甲基转移酶(DAM)编码区域(195-1132位核苷酸，Brooks et al.，Nucleic.Acids Res(1983)11：837-851；SEQ ID NO：26)。该基因的转录由马铃薯蛋白酶抑制剂II(PinII)终止子(2-310位核苷酸，An et al.，Plant Cell(1989)1：115-122；SEQID NO：28)终止。

5.在pUC8中克隆了35S：PAT基因上游3.34kb的NcoI DNA片段(含有Ms45：Ms45)，产生了PHP6641。将来自PHP6641的、含有Ms45：Ms45-35S：PAT的4.7kb的HindIII/EcoRI DNA片段克隆进pSB11，产生了PHP 10890(Cigan et al，Sex.Plant Reprod.(2001)14：135-142)。PHP10890中天然的Ms45启动子被528bp的HindIII/NcoI片段(含有玉米5126启动子)替换，产生了PHP11943。

6.将含有PG47启动子的2.87kb的HindIII/NcoI片段与含有DAM编码区域、PinII终止子和来自PHP10404的35S增强子(Unger，et al.，Transgenic Res.(2001)10：409-422)的0.8kb的NcoI/HindIII片段连接，产生了3.67kb的HindIII片段，其含有PG47：DAM基因融合(具有35S增强子)。然后将该3.67kbp的HindIII片段克隆进PHP11943的HindIII位点，产生了PHP20005。除去PHP20005中的35S增强子，产生了PHP18071。通过三亲交配(Ishida et al.，Nature Biotechnol.(1996)14：745-750)，将PHP18071引入携带有质粒pSB1的Agrobacterium菌株LBA4404。PHP18071和pSB1的共同整合体被称为PHP18091。

实施例9    用实施例8的恢复性转基因构建体转化玉米

将ms45突变体Ac切割等位基因——ms45’-9301(ms45)纯合的雄性不育雌株与来自玉米Hi型II植株(Armstrong 1994，In：Freeling andWalbot(eds).The Maize Handbook.Springer，New York，pp 663-671)的大量花粉重复杂交，导致数代之后，该ms45等位基因渐渐渗入易于转化的(transformation amenable)玉米种质。得到的转化材料来源由针对ms45分离(1∶1或3∶1)的胚构成，其允许直接转化进纯合ms45背景，并且允许对T₀植株中ms45突变的遗传补足性(genetic complementation)加以测试。按照Zhao et al.1999(美国专利号5,981,840)，进行Agrobacterum介导的转化。按照Cigan et al.，(Sex.Plant.Reprod.(2001)14：135-142)，进行对转化子的基因型和分子分析(整合和PTU)。选择具有单整合和完全PTU的转化子，用于进一步研究。

实施例10    分析玉米转化子

针对植株整体形态对来自实施例9的转基因植株(T₀)加以评估，针对花粉和卵细胞中转基因的传播进行分析。除了雄性生育力的程度之外，在转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到其它形态不同。具有单整合和完整PTU的转化子是部分雄性可育的，而非转基因对照植株则是完全雄性不育的，这表明Ms45基因的表达补足了(complement)纯合隐性ms45雄性不育表型。这还展示出：DAM基因的表达通过去除携带有转基因的花粉粒而导致了部分雄性不育。没有DAM基因时，Ms45转基因可以完全恢复ms45雄性不育(Cigan et al.，Sex.Plant.Reprod.(2001)14：135-142)。通过在T₀转基因植株和非转基因植株间受控授粉，进一步确定了DAM基因的正确功能。用来自T₀转基因植株的花粉粒对非转基因植株——对照植株进行授粉。授粉并在MS培养基或者含有3.0mg/L双丙氨膦的MS培养基中培养18天后，从这些非转基因植株的耳穗收获未成熟的胚(Murashige，T.and Skoog，F.A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant(1962)15：437-439)。100％的胚都能在对照培养基上发芽，而这些胚均不能在含有3mg/L双丙氨膦的培养基上发芽，这表明恢复性转基因构建体没有通过花粉传给后代。

此外，用来自非转基因植株的花粉对T₀转基因保持系植株(T₀transgenic maintainer plants)授粉。从授粉并按上文所述在对照培养基或含有3mg/L双丙氨膦的培养基中培养18天后的这些T₀转基因保持系植株的耳穗收获未成熟的胚。所有胚均能在对照培养基上发芽，但是仅有50％的胚能在含有双丙氨膦的培养基上发芽，这表明恢复性转基因构建体通过胚珠以预计频率传给了后代。表1和表2概括了胚恢复(rescue)的结果。

表1：通过花粉的转基因传播

转基因植株	到非转基因植株的花粉
							对照培养基			培养基+3mg/l双丙氨膦
	#培养的胚	#发芽的胚	％	#培养的胚	#发芽的胚	％
							14089263	40	40	100	60	0	0
14089277	100	100	100	100	0	0
							14089839	40	40	100	60	0	0

表2：通过卵细胞的转基因传播

转基因植株	来自非转基因植株的花粉
				培养基+3mg/双丙氨膦
	#培养的胚	#发芽的胚	％
				14089262	20	8	40
14089277	40	22	55
				14089839	40	21	53

实施例11    将T₀植株转化为不同的近交系，并对Tn植株加以分析

通过从近交系，例如PH09B授粉，依靠重复回交，将来自实施例9的T₀转基因保持系植株转化为不同的近交背景。为完成这个目的，用PH09B(ms45杂合背景)产生的花粉对ms45突变体等位基因纯合的T₀保持系植株的耳穗授粉。从这些T₀植株收获的T₁种子的转基因和ms45等位基因都有分离。通过除草剂选择除去不含恢复性转基因构建体(restoring transgene construct)的T₁植株。按Cigan et al.，(Sex.Plant.Reprod.，(2001)14：135-142)所述，针对ms45背景和雄性生育力对含有转基因的T₁植株加以分析。一般而言，含有恢复性转基因构建体、纯合ms45状态的T₁植株展示出部分雄性生育力，就像针对T₀亲本植株观察到的一样，而处于纯合ms45状态但不含转基因的T₁植株是完全雄性不育的。这表明，Ms45转基因在不同的遗传背景中继续正确发挥功能。使用显微和组织化学染色，针对存活性，对来自T₁植株的花粉加以检查。收集不同发育阶段的花粉粒，用二乙酸荧光素(FDA)、4’，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)和溴化乙啶(EB)来染色。来自转基因T₁植株的花粉粒的大约50％丢失了它们的存活性，这是通过第一次花粉减数分裂之后用FDA染色之后荧光不存在来判断的，而来自非转基因对照植株的花粉粒则显示出了均匀的FDA染色。这得到了体外花粉发芽研究的进一步支持。来自转基因T₁植株的花粉粒的发芽率是来自非转基因对照植株的大约一半。还用来自转基因T₁植株的花粉粒对非转基因植株授粉，以验证通过花粉的转基因传播。例如，来自经T₁植株(20118954)授粉的非转基因植株的248个胚中没有哪个能在含有3mg/l双丙氨膦的培养基上发芽。这些实验验证了不同遗传背景中Ms45和DAM转基因均正确发挥功能。使用来自对于突变体ms45等位基因来说杂合的父系近交亲本的花粉，用具有想要的性能的T₁植株进行下一轮回交。该过程将重复，直至第6代。

实施例12    使用实施例8的构建体对ms45雄性不育进行大规模 传播和保持

将按照实施例9所述从T₀14089277获得的T₁植株用作雄性，对野生型近交植株或ms45/ms45雄性不育近交植株授粉。通过对除草剂抗性的筛选，针对转基因传播对来自野生型杂交的10,117个T₂后代和来自ms45/ms45杂交的6688个T₂后代进行评估。对于两种类型的杂交而言，总共16786株T₂植株均被发现是对除草剂敏感的，这产生了99.89％的未传播频率。来自ms45/ms45杂交的所有T₂植株(不含转基因)都是完全雄性不育的，这表明该转基因系可保持ms45不育。

实施例13    构建包含可筛选标记、雄性生育力基因Ms26和花粉 细胞毒素基因的植物转化载体

通过装配下述DNA组件，制造图23所示的被称为PHP24101的构建体：

1.质粒pSB11骨架DNA(pSB31，缺少携带35SGUS和35SBAR基因的EcoRI片段，Ishida et al.，Nature Biotechnol.(1996)14：745-750)。该DNA骨架含有来自pBR322的复制起点以及T-DNA边界序列。

2.PG47PRO：ZM-AA1基因，其含有如图24所示的来自Zea mays的α淀粉酶1编码区域(SEQ ID NO：26)。该基因的转录由IN2-1终止子(美国专利No.5,364,780)终止。

3.Ms26(SB200)GENOMIC基因(SEQ ID NO：7)，其含有玉米雄性生育力基因的编码区域。

4.LTP2：DS-RED2(ALT1)，其含有红色荧光编码区域(Discosoma sp.红色荧光蛋白(DsRed)的变体，来自Clontech，经突变以去除BstEII位点，密码子序列未改变)，其由LTP2启动子驱动，见上文。

5.将2.143kb的EcoRV/DraI DNA片段(含有来自PHP21737的LTP2PRO：DS-RED2(ALT1))克隆进SK载体中Ms26 GENOMIC基因的下游，产生了SK-Ms26 GENOMIC-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1)。

6.将2.143kb的EcoRV/DraI DNA片段(含有来自PHP21737的LTP2PRO：DS-RED2(ALT1))克隆进SK载体中Ms45PRO：Ms45GENOMIC基因的下游，产生了SK-Ms45-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1)。

7.5.429kb的NotI DNA片段(含有PHP20532的5126PRO：Ms45GENOMIC-UBI：MOPAT：PINII)被替换为4.318kb的NotI片段(含有来自SK-Ms45-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1)的Ms45-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1))，产生了PHP22623。

8.4.318kb的NotI片段(含有PHP22623的Ms45-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1))被替换为5.960kb的NotI DNA片段(含有来自SK-Ms26 GENOMIC-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1)的Ms26GENOMIC-LTP2PRO：DS-RED2(ALT1))，产生了PHP24014。通过电泳将PHP24014引入携带有质粒pSB1的Agrobacterium菌株LBA4404。PHP24014和pSB1的共同整合体被称为PHP24101。

实施例14    用实施例13的恢复性转基因构建体转化玉米

将ms26突变体切割等位基因(ms26)纯合的雄性不育雌株与来自玉米Hi型II植株(Armstrong 1994，In：Freeling and Walbot(eds).The Maize Handbook.Springer，New York，pp 663-671)的大量花粉重复杂交，导致数代之后，该ms26等位基因渐渐渗入易于转化的(transformationamenable)玉米种质。得到的转化材料来源由针对ms26分离(1∶1或3∶1)的胚构成，其允许直接转化进纯合ms26背景，并且允许对T₀植株中ms26突变的遗传补足性加以测试。按照Zhao et al.1999(美国专利号5,981,840)，进行Agrobacterum介导的转化。按照Cigan et al.，(Sex.Plant.Reprod.(2001)14：135-142)，进行对转化子的基因型和分子分析(整合和PTU)。选择具有单整合和完全PTU的转化子，用于进一步研究。

实施例15    分析玉米转化子

针对植株整体形态对来自实施例14的转基因植株(T₀)加以评估，针对通过花粉的转基因传播进行分析。除了雄性生育力的程度之外，在转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到其它形态不同。具有单整合和完整PTU的转化子是部分雄性可育的，而非转基因对照植株则是完全雄性不育的，这表明Ms26基因的表达补足了纯合隐性ms45雄性不育表型。这还表明：α淀粉酶(AA)基因的花粉表达导致了部分雄性不育，这是通过破坏携带有转基因的花粉粒的正常功能造成的。用碘化钾(KI)(其对淀粉粒染色)对来自转化子的花粉加以染色，显示：大约一半花粉粒含有淀粉(黑色粒，非转基因)，剩下一半不含淀粉(金色粒，转基因)。通过在T₀转基因植株和非转基因植株间受控授粉，进一步确定了AA基因的正确功能。针对红色荧光表型对得到的T₁核进行评估。如果转基因通过花粉传播，那么T₁种子将含有红色荧光的核，这是由于在糊粉层表达了RFP。对于表3显示的四个独立事件而言，在T₁种子中没有发现RFP表达，而来自T₀的耳穗本身的种子(T₁种子)含有大约50％的红色荧光核。

表3：通过花粉的转基因传播

转基因植株	到非转基因植株的花粉
				核红色荧光
	#黄色核	#红色核	％
				42772379	338	0	100
42772385	277	0	100
				42772400	268	0	100
42772411	598	0	100

由此可以看出，本发明至少实现了其所有目标。

Claims (63)

1.一种方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：

(a)提供第一植株，其包含Ms26基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；

(b)向第二植株中引入下述构建体，所述第二植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因，所述构建体为半合状态，所述构建体包含：

(i)第一核苷酸序列，其包含Ms26核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复雄性生育力；

(ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能，从而使得在含有Ms26的隐性等位基因的所述第二植株中产生可育的雄性配子，并且所述雄性配子不含所述构建体；以及

(c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。

4.如权利要求2所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列选自5126、Ms26和Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列选自DAM甲基化酶基因、Zea mays α淀粉酶基因和细胞毒素编码基因的核苷酸序列构成的组。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导向雄性配子的表达。

8.如权利要求5所述的方法，其中，所述第四核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

9.如权利要求1所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因构成的组。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列与选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因构成的组的调控区域可操作地相连。

12.如权利要求1所述的方法，其还包括通过鉴定具有所述构建体的植株来选择所述第二植株。

13.一种方法，用于在将第一植株与第二植株杂交时保持所述第一植株的纯合隐性状态，所述方法包括：

(a)提供第一植株，其包含Ms26基因的纯合隐性等位基因，所述等位基因的表达导致雄性不育；

(b)向第二植株中引入下述构建体，所述第二植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因，所述构建体为半合状态，所述构建体包含：

(i)第一核苷酸序列，其包含Ms26核苷酸序列，当在所述第一植株中表达时其将恢复雄性生育力；

(ii)第二核苷酸序列，其选自DAM甲基化酶基因、Zea mays α淀粉酶基因和细胞毒素编码基因的序列构成的组；

(iii)第三核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列可操作地相连，其选自5126、Ms26或Ms45的雄性组织调控区域构成的组，指导偏好于雄性植物组织的表达；

(iv)第四核苷酸序列，其与所述第二核苷酸序列可操作地相连，其指导向植物雄性配子的表达，使得在含有所述隐性等位基因的所述第二植株中产生可育雄性配子，并且使得所述可育雄性配子不含所述构建体；以及

(c)用所述第二植株的所述雄性配子使所述第一植株受精，以产生雄性不育、并且保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

14.如权利要求13所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因构成的组。

16.如权利要求14所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列与选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因构成的组的调控区域可操作地相连。

17.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列选自

a)编码SEQ ID NO：2、4或18的氨基酸序列中任何序列的序列；

b)SEQ ID NO：1、3、7或17中的任何序列；

c)与前述任何序列具有至少90％同一性的序列；

d)在于65℃用0.1SSC、0.1％(w/v)SDS洗的高度严谨条件下，与前述任何序列杂交的序列；以及

e)前述任何序列的下述片段，所述片段是对植株的雄性生育力来说关键的功能序列

构成的组。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。

20.如权利要求18所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列选自5126、Ms26和Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

21.如权利要求17所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

22.如权利要求17所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列选自DAM甲基化酶基因、Zea mays α淀粉酶基因和细胞毒素编码基因的核苷酸序列构成的组。

23.如权利要求22所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于植物雄性配子的表达。

24.如权利要求21所述的方法，其中，所述第四核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

25.如权利要求17所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因构成的组。

27.如权利要求25所述的方法，其中，所述第五核苷酸序列与选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因构成的组的调控区域可操作地相连。

28.如权利要求17所述的方法，其还包括通过鉴定具有所述构建体的植株来选择所述第二植株。

29.一种方法，用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子，所述方法包括：

(a)向包含Ms26的纯合隐性等位基因的雄性不育植株引入半合状态的下述构建体，所述构建体包含：

(i)第一核苷酸序列，其包含Ms26核苷酸序列；

(ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在所述植株中产生不含所述构建体的可育雄性配子；

(b)使所述植株自体受精；以及

(c)产生含有所述构建体的种子。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

31.如权利要求29所述的方法，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

32.如权利要求29所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

33.如权利要求29所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的植株。

34.如权利要求29所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列选自

a)编码SEQ ID NO：2、4或18的氨基酸序列中任何序列的序列；

b)SEQ ID NO：1、3、7或17中的任何序列；

c)与前述任何序列具有至少90％同一性的序列；

d)在于65℃用0.1SSC、0.1％(w/v)SDS洗的高度严谨条件下，与前述任何序列杂交的序列；以及

e)前述任何序列的下述片段，所述片段是对植株的雄性生育力来说关键的序列

构成的组。

35.一种方法，用于保持植株的纯合隐性状态，所述方法包括：

(a)提供第一植株，其包含植物性状的表型表达所需的基因的纯合隐性等位基因；

(b)向第二植株中引入下述构建体，所述第二植株包含植物性状的表型表达所需的基因的纯合隐性等位基因，所述构建体为半合状态，所述构建体包含：

(i)第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时，能功能性补足所述纯合隐性植物性状；

(ii)第二核苷酸序列，其表达抑制所述第二植株中雄性配子的形成或功能；从而使得在含有所述隐性等位基因的所述第二植株中产生雄性配子，并且，所述雄性配子不含所述构建体；以及

(c)用所述第二植株的所述雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

36.如权利要求335所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

37.如权利要求35所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

40.如权利要求35所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

41.如权利要求35所述的方法，其还包括通过鉴定具有所述构建体的植株来选择所述第二植株。

42.如权利要求35所述的方法，其中，所述性状是雄性生育力。

43.一种方法，用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子，所述方法包括：

(a)向第一植株引入半合状态的下述构建体，所述第一植株包含植物性状的表型表达所需的基因的纯合隐性等位基因，所述构建体包含：

(i)第一核苷酸序列，该序列在具有雄性生育力需要的基因的纯合隐性等位基因并且是雄性不育的第二植株中表达时将恢复雄性生育力；

(ii)第二核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列可操作地相连，并抑制所述植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在所述植株中产生不具有所述第一核苷酸序列的可育雄性配子；

(b)使所述植株自体受精；以及

(c)产生含有所述构建体的种子。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述第一核苷酸序列与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

45.如权利要求43所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

46.如权利要求43所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

47.如权利要求43所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的植株。

48.如权利要求43所述的方法，其中，所述性状是雄性生育力。

49.如权利要求2所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列选自

(a)SEQ ID NO：5；

(b)SEQ ID NO：6；

(c)SEQ ID NO：7的1至1088位碱基；

(d)SEQ ID NO：7的830至962位碱基；

(e)SEQ ID NO：7的830至914位碱基；

(f)SEQ ID NO：7的917至962位碱基；

(g)SEQ ID NO：7的875至954位碱基；

(h)SEQ ID NO：7的935至954位碱基；

(i)SEQ ID NO：7的875至924位碱基；

(j)SEQ ID NO：19；

(k)SEQ ID NO：20；和

(l)前述任何序列的下述片段，这些功能性片段对于连接的序列的雄性组织表达来说是必要的

构成的组。

50.如权利要求49所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

51.如权利要求49所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列选自DAM甲基化酶基因、Zea mays α淀粉酶基因和细胞毒素编码基因的核苷酸序列构成的组。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于植物雄性配子的表达。

53.如权利要求50所述的方法，其中，所述第四核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

54.如权利要求49所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

55.如权利要求49所述的方法，其还包括通过鉴定具有所述构建体的植株来选择所述第二植株。

56.如权利要求30所述的方法，其中，所述第三核苷酸序列选自

(a)SEQ ID NO：5；

(b)SEQ ID NO：6；

(c)SEQ ID NO：7的1至1088位碱基；

(d)SEQ ID NO：7的830至962位碱基；

(e)SEQ ID NO：7的830至914位碱基；

(f)SEQ ID NO：7的917至962位碱基；

(g)SEQ ID NO：7的875至954位碱基；

(h)SEQ ID NO：7的935至954位碱基；

(i)SEQ ID NO：7的875至924位碱基；

(j)SEQ ID NO：19；

(k)SEQ ID NO：20；和

(l)上述任何序列的下述片段，这些功能性片段对于连接的序列的雄性组织表达来说是必要的，

从而使得在所述第一植株中产生不含所述构建体的可育配子

构成的组。

57.如权利要求56所述的方法，其中，所述第二核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。

58.如权利要求56所述的方法，其还包含第五核苷酸序列，该序列编码下述产物，所述产物能用于选择具有所述构建体的植物细胞。

59.如权利要求56所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的植株。

60.一种方法，用于在雄性不育植株中恢复雄性生育力，所述雄性不育植株包含Ms26的纯合隐性等位基因，所述方法包括向所述植株中引入是该纯合隐性状态的功能补足体的Ms26核苷酸序列。

61.一种方法，用于在雄性不育植株中恢复雄性生育力，所述雄性不育植株包含对于雄性生育力来说关键的基因的纯合隐性等位基因，所述方法包括向所述植株中引入是该纯合隐性状态的功能补足体的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列选自

a)编码SEQ ID NO：2、4或18的氨基酸序列中任何序列的序列；

b)SEQ ID NO：1、3、7或17中的任何序列；

c)与前述任何序列具有至少90％同一性的序列；

d)在于65℃用0.1SSC、0.1％(w/v)SDS洗的高度严谨条件下，与前述任何序列杂交的序列；以及

e)前述任何序列的下述片段，这些功能性片段是对植株的雄性生育力来说关键的序列

构成的组。

62.经分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：26。

63.表达盒，其包含SEQ ID NO：26。

64.植物细胞，其包含异源核苷酸序列，所述序列包含SEQ ID NO：26。

65.植株，其包含异源核苷酸序列，所述序列包含SEQ ID NO：26。

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