CN104379751A

CN104379751A - 一种小麦新型育性调控构建体及其应用

Info

Publication number: CN104379751A
Application number: CN201480001231.2A
Authority: CN
Inventors: 马力耕; 李健; 周宽基; 王峥; 邓兴旺
Original assignee: Xingwang Investment Co ltd; Weimingwang System Crop Design Frontier Laboratory Beijing Co ltd
Current assignee: WEIMING XINGWANG SYSTEM CROP DESIGN FRONTIER LABORATORY (BEIJING) CO., LTD
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2015-02-25
Also published as: WO2014131342A1

Abstract

提供了一种调控小麦育性的方法及其应用。该方法包括：以纯合隐性核雄性不育小麦突变体作为母本，与小麦的异附加系杂交，构建纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系，其中附加的染色体能够恢复小麦突变体雄性不育的表型，再以纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系为转化受体材料，通过将紧密连锁的2个目标基因转化至异附加系受体植株中，筛选目标基因整合到附加的染色体上的转基因植株。

Description

一种小麦新型育性调控构建体及其应用技术领域本发明属于植物基因工程和植物育种技术领域，具体涉及一项有效利用隐性细胞核雄性不育突变体及其附加系进行杂交制种的新方法。

背景技术

杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著提高作物产量、品质和抗性。与玉米、水稻等作物相比，小麦杂种优势利用的研究相对滞后，亟待解决的核心问题是高效生产小麦杂交种的技术体系的建立。综合近 50年来的研究进展，小麦杂种优势利用研究主要集中于：核质互作雄性不育的利用（"三系法")、化学杀雄技术的利用（"化杀法"）和光温敏核雄性不育的利用（"两系法"）。三系法由于不育系难以繁殖、恢复源较窄、细胞质副效应等原因，未能在生产上大面积应用。化杀法避开了恢复与保持间的相互关系，曾被认为是一种很有希望的小麦杂交制种新技术，但由于其在制种过程中稳定性差、制种成本高及环境污染等多方面原因，在实际生产上也难以推广利用。基于光温敏的两系法虽然具有制种成本低、恢复源广泛，较易获得优势组合等优点，但也面临着两大关键问题一环境因素的不稳定性对不育系育性的影响和利用光温敏特性所选育的小麦不育系十分有限。

细胞核不育用于作物杂种优势利用，其不育性具有易被恢复而不易被保持的特性，按照常规方法无法实现纯合核不育系种子的大量有效生产。因此，针对小麦杂种优势利用的现状，建立高效小麦雄性不育繁育新体系，是杂交小麦获得成功应用的最关键因素之一。

1972年澳大利亚学者 Driscoll提出了著名的 XYZ杂交小麦生产体系，即在雄性不育系 (Z系， Cornerstone mslc 小麦突变体）中，增加一条或一对携带同源等位显性可育基因 Ms的外源染色体（来自黑麦的 2R，其携带的显性标记性状是 "穗下节有绒毛" ），分别获得 Y系和 X系，外源染色体不能与小麦染色体配对及不能发生同源等位基因交换，在 Y系中外源染色体通过花粉的传递率低，用 Y系（保持系）作父本和 Z系杂交生产 Z系，其后代绝大部分将表现雄性不育；用 Z系和 X系杂交生产 Y系。 XYZ体系没有取得生产应用的成功，其主要原因有： 1 ) 标记性状是植株阶段性状，生产应用中不可能在开花期有限的时间内，人工拔除所有有绒毛株或无绒毛株。 2) 2R单价染色体能够通过雄配子途径传递，造成不育系和杂交种生产纯度不高的问题。此后，许多学者致力于 XYZ体系的改良，核心目的是实现细胞核不育性的高效保持，采取的核心技术措施是构建一条功能较为齐全、完美的特殊人工重组外源染色体（臂）或转基因外源染色体（臂）。但是，针对高效保持亲本系的要求，上述杂交小麦生产体系都存在一定的缺陷，主要是由于不能产生高纯度的雄性不育系、或由于基于标记基因的不育系保持程序太复杂、或由于保持系在遗传上尚不稳定、或由于保持系的繁殖和用其生产不育系太费力、导致杂交种的生产成本太高。因此，这些体系并没有在生产上得到大规模应用。

我国的 "太谷核不育小麦"突变体（Ms2)是一个单基因控制的显性突变体，表现完全雄性不育，且不受遗传背景和环境条件影响，可接受其它品种、品系或雄性可育姐妹株的花粉。刘秉华等将太谷核不育基因 Ms2与矮变 1号小麦 RhtlO显性矮杆基因结合于一体，培育出矮败小麦，其不育基因与矮秆基因呈连锁遗传，可将育性识别提早到小麦起身拔节期。但由于实现其有效标记系统的研制工作困难较大， "太谷核不育小麦"及其它显性核不育突变体至今未取得杂交小麦育种应用的研究突破。

此外，黄寿松等（1991 )报导的 "蓝标型小麦核不育、保持系" 、周宽基报导的 "4E-ms 杂交小麦生产体系" （周宽基等 1996， 1998， 2006), 都是将携带同源显性可育基因 MsE 和显性蓝色糊粉层标记基因 Ba的外源染色体 4E，附加到各自的核不育小麦上（msms), 分别实现了不育系种子（正常小麦粒色）和保持系种子（蓝粒）的细胞遗传学途径的粒色标记，与 XYZ体系相比，取得了标记性状方面的重要技术改进，实现了小麦隐性核不育的有效保持——生产大量整倍体核不育系种子，开辟了小麦核不育杂种优势利用的新途径、方法。

周宽基等（1996,1998,2006) 4E-ms体系的核心是其浅蓝粒保持系，它是 mslg/mslg纯合不育基因型小麦的 4E单体异附加系，它同时具备白粒核不育系的 "自交"繁育和浅蓝粒保持系自身繁殖的双重功能—— "一系两用" 。然而，浅蓝粒系所携带的外源单价体 4E，在其自交过程中以约 20%的传递率，能够同时通过雌、雄配子两个途径传递，由此产生约 4%的 4E二体异附加系（深蓝粒系）后代，深蓝粒系自交后代只产生其深蓝粒自身，而不直接分离出白粒不育系后代，从而造成浅蓝粒系自交繁育白粒核不育系功能的效率降低；同时，虽然光电色选机可实现蓝、白粒间的完全色选，但是对深、浅蓝粒间的色选是不完全的（谷物光电色选机对深蓝和浅蓝粒间的色选精度只有 50%左右），加之当生产上随着逐年逐代的白粒不育系种子的分出用于 F1制种，在浅蓝粒系自交繁殖群体中将发生深蓝粒的累加，从而影响浅蓝粒自交繁殖白粒不育系种子的生产效率。

利用常规的育种方法来选育不育系存在周期长，见效慢，不育基因单一，对环境因素影响敏感等问题，远不能满足生产发展的需要。近年来，通过基因工程创造植物雄性不育系及其恢复系已在一些作物上获得了成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。发明内容

本发明的目的在于提出一种能够有效构建新型稳定的小麦雄性不育系和充分利用小麦种质资源用于杂交育种、提高杂交种纯度的手段，至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人以纯合隐性核雄性不育小麦突变体作为母本，与小麦的异附加系杂交，构建纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系，其中，附加的染色体能够恢复小麦突变体雄性不育的表型。再以纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系为转化受体材料，通过将紧密连锁的 2个目标基因转化至异附加系受体植株中，筛选目标基因整合到附加的染色体上的转基因植株。在转基因植株中，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

根据本发明的实施例，可以以小麦隐性核雄性不育突变体 mslg为母本，与小麦 4E二体异附加系 81529杂交，构建小麦 mslg突变体 4E异附加系。再以小麦 mslg突变体 4E异附加系作为转基因受体材料，将紧密连锁的 2个目标基因转化至小麦 mslg突变体 4E异附加系中，并筛选目标基因整合到附加的 4E染色体上的转基因植株： 4E染色体上带有的育性恢复基因可以恢复小麦 mslg突变体的不育表型，包含导肽序列的花粉失活基因 ZmBTl TP-AA1 可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因 mCherryW用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了小麦杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。

本发明提出了一种小麦异染色体附加系。根据本发明的实施例，该附加系包含一条或两条小麦近缘种的染色体，如长穗偃麦草的 4E染色体，该染色体上含有小麦隐性核雄性不育突变体 mslg的育性恢复基因，能够恢复小麦 mslg突变体的不育表型，植株表现为可育。

本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码花粉失活基因，所述花粉失活基因包括但不限于可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如玉米 a淀粉酶基因、生长素 (auxin) , rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、 DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码荧光色选基因，所述荧光色选基因包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙 pi等基因。利用该构建体，能够有效地将小麦花粉失活基因和荧光色选基因引入到纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系植株中，从而得到携带外源染色体和转基因的可育株作为保持系，同时得到不携带外源染色体和转基因的不育株作为母本进行杂交制种，从而可以方便地通过保持系的自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，携带外源染色体和转基因的保持系与不携带外源染色体和转基因的不育系可以通过种子的荧光色选加以区分，保持系种子带有荧光标记，不育系种子不带有荧光标记。

本发明所述的构建体中，第一表达盒中还包含第一启动子，所述第一启动子与编码花粉失活基因的第一核酸分子可操作性的相连，所述第一启动子为花粉特异性启动子，包括但不限于 ZmAPBl启动子、 ZmABP启动子、 ZmC5启动子、 MPCBP启动子、以及 ZmPG47启动子等，其偏好于指导其连接的基因在植物花粉发育后期特异性表达。根据本发明的一个实施例，所述第一启动子的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 2所示。在第一表达盒中还可以进一步包括一个导肽序列，所述导肽与花粉失活基因构成的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示，可以编码具有导肽的玉米 α淀粉酶，由此，可以有效地将所表达的蛋白靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。

更具体的，根据本发明的具体实施例，玉米 α淀粉酶基因 AA1在玉米花粉特异性启动子 ZmPG47驱动下，与来自于玉米的 brittle-Ι基因的编码导肽（TP)的序列及终止子 IN2-1 组成表达框，其中编码导肽（TP) 的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 14所示，编码玉米 α淀粉酶基因 AA1的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 15所示。上述花粉失活基因表达框可在发育后期的成熟花粉中特异性表达淀粉酶，并靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。

本发明所述的构建体中，第二表达盒还包括第二启动子，所述第二启动子为种子特异性的启动子，包括但不限于 END2启动子、 LTP2启动子。

在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid)、包含上述表达盒的 DNA片段、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体（有时也称为表达载体、遗传载体或载体）呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。

在制备表达盒的过程中，可对多种 DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的 DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将 DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

本发明还包括一种小麦细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该小麦细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。该构建体是通过常规技术，例如农杆菌介导法，导入到水稻的细胞、组织或器官中的，以获得可以后续用于研究、杂交的样本。

本发明还提出了一种构建小麦雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图 6，该方法包括：将前面所述的小麦近缘种染色体引入到小麦纯合隐性核雄性不育植株中，以便获得携带有外源染色体的、小麦隐性核雄性不育突变位点纯合的植株，成为小麦纯合隐性核雄性不育突变体的异附加系，附加的染色体能够恢复小麦突变体雄性不育的表型，所述异附加系产生可育雄性配子；再将前面所述的构建体引入小麦纯合隐性核雄性不育突变体的异附加系中，以获得携带外源基因且外源基因位于外源染色体上的转基因植株；培育所述转基因植株，所述转基因植株能够进行自体受精，从而得到携带外源基因和外源染色体的种子（保持系）和不携带外源基因和外源染色体的种子（不育系）。携带外源基因和外源染色体的种子可以通过自交源源不断的生产不育系和保持系，而不携带外源基因和外源染色体的种子可以作为小麦雄性不育系用于杂交制种的亲本。由此，可以有效用于小麦的杂交制种。

本发明提出了一种恢复小麦隐性核雄性不育突变体雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将小麦近缘种的染色体引入到小麦纯合隐性核雄性不育突变体植株中, 以便获得携带有外源染色体的、小麦隐性核雄性不育突变位点纯合的植株，成为小麦纯合隐性核雄性不育突变体的异附加系，附加的染色体能够恢复小麦突变体雄性不育的表型，所述异附加系产生可育雄性配子；再将前面所述的构建体引入小麦纯合隐性核雄性不育突变体的异附加系中，以获得携带外源基因且外源基因位于外源染色体上的转基因植株；培育所述转基因植株，所述转基因植株能够进行自体受精，从而得到携带外源基因和外源染色体的种子（保持系）和不携带外源基因和外源染色体的种子（不育系）。携带外源基因和外源染色体的种子可以通过自交源源不断的生产不育系和保持系，而不携带外源基因和外源染色体的种子可以作为小麦雄性不育系用于杂交制种的亲本。由此，可以有效用于小麦的杂交制种。

本发明还提出了一种制备小麦种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将前面所述的构建体引入到小麦隐性核雄性不育突变体的异附加染色体中，使所述在附加染色体上含有本发明所述构建体的小麦隐性核雄性不育突变体植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。

本发明提出了小麦雄性不育系在制备杂交小麦中的用途。根据本发明的实施例，所述小麦雄性不育系是通过前面构建小麦雄性不育系的方法获得的。附图说明

图 1是小麦 mslg突变体与野生型的表型比较。图 1A-C分别是小麦野生型、小麦 mslg 突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系扬花期的穗子；图 1D-F分别是小麦野生型、小麦 mslg突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系扬花期的雄蕊和雌蕊；图 1G-I分别是小麦野生型、小麦 mslg突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系灌浆期的籽粒；图 1J-L 分别是小麦野生型、小麦 mslg突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系花粉的 I₂-KI染色；图 1M-0分别是小麦野生型、小麦 mslg突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系成熟的种子。

图 2是小麦 mslg突变体 4E异附加系的构建示意图。 ®表示自交， ms表示 mslg; 4E' 和 4E"分别表示一条和两条 4E染色体。

图 3是小麦 mslg突变体 4E异附加系的细胞遗传学鉴定。图 3A是 mslg雄性不育突变体的根尖细胞，图 3B是 mslg突变体 4E单体异附加系的根尖细胞，图 3C是 mslg突变体 4E二体异附加系的根尖细胞。蓝色的是经 DAPI染色的小麦染色体，红色的是罗丹明标记的长穗偃麦草染色体。

图 4是植物表达载体 pl300-130的结构示意图。

图 5是植物表达载体 pl300-130的构建示意图。

图 6是小麦 mslg突变体 4E异附加系作为转化受体材料，通过转基因所得到的转化体自交得到不育系的示意图。图 7是可育花粉粒和不育花粉粒 I₂-KI的染色结果。具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成， PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司， pEASY-Blunt-simple cloning kit购自北京全式金生物技术公司， T4 DNA连接酶购自 NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体 pCAMBIA 1300来自于 CAMBIA公司。实施例 1. 小麦 mslg突变体

小麦 ms突变体是在春小麦品种间杂交组合的杂种 F4代群体间发现的，是一个自发突变的雄性不育突变体，雄性不育度为 100%。图 1A和 1B是扬花期的小麦穗子，其中小麦 ms突变体的穗子（图 3B) 较野生型的穗子（图 3A) 颖壳蓬松；图 1D和 1E是扬花期的小麦雄蕊和雌蕊，其中野生型的花药已经开裂，雌蕊的柱头上已经布满黄色的花粉粒（图 1D)， ^突变体的花药不开裂，雌蕊的柱头上没有花粉（图 1E);图 1J和 1K是花粉的 I₂-KI染色，其中野生型的花粉外形浑圆，全部被染成蓝黑色，表明具有较强的活力（图 1J)，而 ms突变体的花粉外形皱縮，全部呈黄褐色，表明花粉没有活力（图 1K); 图 3G和 3H是灌浆期的种子，其中野生型受精成功，种子饱满（图 1G)，而 ms突变体未完成受精，种子没有发育（图 m)。

将 ms突变体与包括中国春在内的 9个小麦常规品系杂交，得到的 F1代自交，观察 F2 代不育株与可育株的分离比，均符合 1:3的比例，表明该突变体是典型的单基因隐性核雄性不育突变体（表 1 )。

表 1 突变体与 9个小麦株系杂交 F₂不育株与可育株的分离比

组合 F2代不育株 F2代可育株预期分离比 X ² P 中国春 299 809 1： 3 2 2250 0. 20-0. 10

ms/阿勃 319 963 1： 3 0 0042 >0. 90 甘麦 8号 210 678 1： 3 0 7943 0. 50-0. 30

陇春 7号 241 747 1： 3 0 1633 0. 70-0. 50

陇春 11号 199 604 1： 3 0 0104 >0. 90 ms/宁春 4号 283 893 1： 3 0 5000 0. 5-0. 3

¾s/宁春 16号 227 694 1： 3 0 0438 0. 90-0. 80 KUZA 203 649 1： 3 0 5649 0. 50-0. 30

ms/宁农 1376 213 689 1： 3 0 8514 0. 50-0. 30 将 ^突变体与小麦雄性不育突变体 mslc和 ms5进行等位分析，具体的做法是将中国春的 F1代植物分别与 mslc和 ms5雄性不育突变体进行杂交，分析杂交后代中不育株与可育株的比例，与 mslc雄性不育突变体的杂交后代中不育株与可育株的比例为 1:1，而与 ms5雄性不育突变体的杂交后代中没有不育株 (表 2)，说明 ^突变体是 msl的等位突变体，命名为 mslg。表 2 突变体与 fflWc突变体和突变体的等位分析

组合不育株可育株预期分离比 _χ ² Ρ

中国春 14 22 1 : 1 1. 778 0. 20-0. 10

ms5 //ffis/中国春 0 34 1 : 1 1 1 实施例 2. 小麦 mslg突变体 4Ε异附加系的构建

以 mslg突变体为母本，以蓝粒 81529为父本杂交，并对杂交后代进行了有目标的鉴定选择，成功地将 4E染色体单体异附加到具有纯合核不育基因型 mslg/mslg背景的普通小麦上，获得了籽粒为蓝色的自交可育的 mslg/mslg基因型小麦 4E单体异附加系。图 1C是小麦 mslg突变体 4E单体异附加系扬花期的穗子，蓬松度恢复成野生型的状态；图 1F是小麦 mslg突变体 4E单体异附加系扬花期的小麦雄蕊和雌蕊，与野生型相同，花药已经开裂，雌蕊的柱头上已经布满黄色的花粉粒；图 1L是小麦 mslg突变体 4E单体异附加系花粉的 I₂-KI染色，与野生型相同，花粉外形浑圆，全部被染成蓝黑色，表明具有较强的活力；图 31是小麦 mslg突变体 4Ε单体异附加系灌浆期的种子，与野生型相同，受精成功，种子饱满。图 3M-0分别是小麦野生型、小麦 mslg突变体和小麦 mslg突变体 4E单体异附加系成熟的种子，其中小麦野生型和小麦 mslg突变体的种子为正常的种子颜色，后面称为白色; 小麦 mslg突变体 4E单体异附加系的种子为蓝色。由此说明 4E不但携带部分同源雄性可育基因，而且携带蓝粒标记基因。具体的育种选育方法和过程如图 2所示 (图中用 ms表示 mslg; 和 4E"分别表示一条和两条 4E染色体；浅蓝粒是在二倍体组织细胞中附加一条 4E染色体，深蓝粒是在二倍体组织细胞中附加两条 4E染色体)。

小麦 mslg突变体的基因型为 2n = 42 (ms/ms) = 42, 42条染色体全部是小麦的染色体，且有一个育性基因突变（ms/ms ) ; 4E 二体异附加系蓝粒小麦 81529 的基因型为 2n = 42 (MS/MS) + 4E" = 44, 除小麦的 42条染色体外，还有两条来自长穗偃麦草的 4E染色体，小麦染色体上的育性基因为野生型（MS/MS)。以 mslg突变体为母本，以蓝粒 81529为父本，进行杂交， F1的种子为浅蓝粒，其基因型为2n = 42 (MS/ms) + 4E = 43，除小麦的 42条染色体外，还有一条长穗偃麦草的 4E染色体，小麦染色体上的育性基因 MS为杂合（MS/ms)， F1植株表现为雄性可育。

F1植株自交获得的 F2代种子，共有 9种基因型，其中白粒的基因型 3种，全部是没有附加长穗偃麦草 4E染色体的；深蓝粒和浅蓝粒的基因型各 3种，全部为雄性可育，其中只有 2η = 42 (ms/ms) + 4E' = 43是下一步选育的目标基因型。由于深蓝粒和浅蓝粒很难区分，因此将 F2的蓝粒种子全部种下，自交后单株收种为 F3代， F3代种子存在蓝白分离的说明 F2代基因组中只附加一条长穗偃麦草的 4E染色体， F2代种子为浅蓝粒； F3代种子不存在蓝白分离的说明 F2代基因组中附加了两条长穗偃麦草的 4E染色体， F2代种子为深蓝粒。

将 F2代种子为浅蓝粒，单株收获的 F3代种子存在蓝白分离的 F3代蓝粒和白粒称为一个 F3家系。将 F3家系蓝白粒分别种植，检查白粒行中的雄性不育株分离情况：若 F3代家系白粒行中无雄性不育株分离出来，则说明该家系不携带雄性不育基因（MS/MS), 淘汰该家系；若 F3代家系白粒行中出现雄性不育株系和可育株系的分离，则说明该家系中的雄性不育基因是杂合的 (MS/ms)，也不是目标基因型；若 F3代家系白粒行中出现 100%雄性不育株率，则说明该家系的雄性不育基因已经纯合（ms/ms)，其基因型为2n = 42 (ms/ms) + 4E = 43，是目标基因型，该家系相应的蓝粒行收获后下代继续分株系分蓝白成对种植，以便对其农艺性状进行选择。以此类推，对杂种后代中进行上述鉴定选择，在 F12代最终选育出农艺性状优良的小麦 mslg突变体 4E单体异附加系，其基因型为 2n = 42(ms/ms) + 4E' = 43，浅蓝粒，雄性可育。

由于 4E单价体的雌雄配子体向后代传递的效率分别为 19.0-25.8%和 11.1-18.4%,因此，其自交后代可分离出 64.3%的 mslg雄性不育突变体（白粒， 2n = 42 (ms/ms) = 42)、 32.1% 的 mslg突变体 4E单体异附加系（浅蓝粒， 2n = 42 (ms/ms) + 4E' = 43) 禾 B 3.6%的 mslg突变体 4E二体异附加系（深蓝粒， 2n = 42 (ms/ms) + 4E"= 44)， mslg突变体 4E单体异附加系和 mslg突变体 4E二体异附加系统称为 mslg突变体 4E异附加系。

以长穗偃麦草的基因组 DNA (罗丹明标记）做探针，利用 GISH 的方法对小麦 mslg 突变体、小麦 mslg突变体 4E单体异附加系和小麦 mslg突变体 4E二体异附加系的根尖细胞进行细胞遗传学分析，结果如图 3所示，蓝色的是经 DAPI染色的小麦染色体，红色的是罗丹明标记的长穗偃麦草染色体，图 3A是小麦 mslg突变体的根尖细胞，只有小麦的染色体；图 3B是小麦 mslg突变体 4E单体异附加系的根尖细胞，除小麦染色体外还有一条长穗偃麦草的染色体；图 3C是小麦 mslg突变体 4E二体异附加系的根尖细胞，除小麦染色体外还有两条长穗偃麦草的染色体。对上述三种材料根尖细胞的细胞遗传学分析结果与植株育性、种子颜色等性状完全对应。

所述蓝粒 81529是李振声院士培育的蓝粒小麦与甘肃春小麦材料杂交后经系统选育获得的 4E附加系蓝粒春小麦材料，为 4E二体异附加系。实施例 3.利用小麦 mslg突变体 4E异附加系创建新一代小麦杂交育种体系

如图 6所示，在没有克隆到育性恢复基因的情况下，可以以纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系为转化受体材料，通过将紧密连锁的 2个目标基因转化至异附加系受体植株中，筛选目标基因整合到附加的染色体上的转基因植株。在转基因植株中，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如根据本发明的后续实施例，以小麦 mslg突变体 4E异附加系作为转基因受体材料，将紧密连锁的 2个目标基因转化至小麦 mslg突变体 4E 异附加系中，并筛选目标基因整合到附加的 4E染色体上的转基因植株： 4E染色体上带有的育性恢复基因可以恢复小麦 mslg突变体的不育表型，花粉失活基因 ZmBTl TP-AA1 可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因 mCherryW用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了小麦杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。实施例 4.植物表达载体的构建

通过在 pCAMBIA1300载体上装配下述 DNA元件，构建图 4所示的被称为 pl300-130 的植物表达载体。

( 1 )基因表达盒 ZmPG47_: ZmBTl TP-ZmAAl : IN2-1 , 目标基因 ZmBTl TP-ZmAAl (SEQ ID NO: 1 ) 的开放读码框连接于启动子 ZmPG47 (SEQ ID NO: 2) 的下游，终止子 IN2-1

(SEQ ID NO: 3) 的上游。

(2)基因表达盒 CaMV35S-Ltp2: mCherryW: PINII, mCherryW基因（SEQ ID NO: 4) 的开放读码框连接于 CaMV35S增强子（SEQ ID NO: 5) -Ltp2启动子（SEQ ID NO: 6) 禾口 PINII终止子（SEQ ID NO: 7) 之间。具体地，参见图 5 的载体 pl300-130 的构建流程示意图，具体描述如下：首先，终止子 IN2-1 由人工合成获得，合成过程中在 IN2-1 的 5' 端和 3' 分别加入 Hindlll-Notl-EcoRI三个酶切位点（aagctt gcggccgc gaattc)禾 B Bglll酶切位点（agatct), 合成的 IN2-1终止子连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确。

ZmBTl TP-ZmAAl基因序列由人工合成获得，合成过程中在 ZmBTl TP-ZmAAl的 5'端和 3' 分别加入 Notl酶切位点（gcggccgc) 和 EcoRI酶切位点（gaattc), 合成的 ZmBTl TP-ZmAAl 基因连在 pEASY-T3 载体上并经测序验证正确。用基因两端所带有的酶切位点 Notl和 EcoRI对连有 ZmBTl TP-ZmAAl基因的 pEASY-Blunt-simple质粒进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的 ZmBTl TP-ZmAAl基因片段。将连有 IN2-1终止子的 pEASY-Blunt-simple载体用限制性内切酶 Notl和 EcoRI切开，连入 ZmBTl TP-ZmAAl基因， ZmBTl TP-ZmAAl基因位于 IN2-1终止子的上游。

从玉米的基因组中扩增 ZmPG47启动子，扩增 ZmPG47的引物为：

Fl : aagctt TGCACCGGACACTGTCTG (SEQ ID NO: 8)， aaggcc为 Hindlll酶切位点， Rl : gcggccgc TGTCGTGATCGATGCTTTATTC (SEQ ID NO: 9)， gcggccgc为 Notl酶切位点；

将 PCR产物连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确后，用 ZmPG47启动子两侧所带的酶切位点 Hindlll和 Notl对连有 ZmPG47启动子的 pEASY-Blunt- simple质粒进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的 ZmPG47 启动子片段。将连有 IN2-1 终止子和 ZmBTl TP-ZmAAl基因的 pEASY-Blunt- simple载体用限制性内切酶 Hindlll和 Notl 切开，连入 ZmPG47启动子，连入的 ZmPG47启动子位于 ZmBTl TP-ZmAAl基因的上游。这样就构建成了中间载体 A，上面连有基因表达盒 ZmPG47: ZmBTl TP-ZmAAl : IN2-1。

接下来，

终止子 ΡΙΝΠ由人工合成获得，合成过程中在 ΡΙΝΠ的 5'端和 3'分别加入 BamHI- EcoRI - Xhol-Sall-四个酶切位点（ggatcc gaattc ctcgag gtcgac) 和 Kpnl酶切位点（ggtacc), 合成的 PINII终止子连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确。

mCherryW基因序列由人工合成获得，合成过程中在 mCherryW基因的 5' 端和 3' 分别加入 Xhol酶切位点（ctcgag) 和 Sail酶切位点（gtcgac), 合成的 mCherryW基因连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确。用基因两端所带有的酶切位点 Xhol和 Sail 对连有 mCherryW基因的 pEASY-Blunt-simple质粒进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的 mCherryW基因片段。将连有 ΡΙΝΠ终止子的 pEASY-Blunt-simple载体用限制性内切酶 Xhol和 Sail切开，连入 mCherryW基因， mCherryW基因位于 ΡΙΝΠ终止子的上游。

从大麦的基因组中扩增 Ltp2启动子，扩增 Ltp2的引物为：

F2: gaattc AACCGTCTCTTCGTGAGAATAACC (SEQ ID NO: 10)， gaattc为 EcoRI 酶切位点，

R2: ctcgag TACTCGGCTACACTCACACGC (SEQ ID NO: 11 )， ctcgag为 Xhol酶切位点；

将 PCR产物连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确后，用 Ltp2启动子两侧所带的酶切位点 EcoRI和 Xhol对连有 Ltp2启动子的 pEASY-Blunt-simple质粒进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的 Ltp2启动子片段。将连有 ΡΙΝΠ终止子和 mCherryW 基因的 pEASY-Blunt-simple载体用限制性内切酶 EcoRI和 Xhol切开，连入 Ltp2启动子，连入的 Ltp2启动子位于 mCherryW基因的上游。

CaMV35S增强子序列由人工合成获得，合成过程中在 CaMV35S增强子的 5' 端和 3' 分别加入 BamHI酶切位点（ggatcc)和 EcoRI酶切位点（gaattc), 合成的 CaMV35S增强子连在 pEASY-Blunt-simple载体上并经测序验证正确。用基因两端所带有的酶切位点 BamHI 和 EcoRI对连有 CaMV35S增强子的 pEASY-Blunt- simple质粒进行双酶切，得到序列正确、两端带有相应酶切位点的 CaMV35S增强子片段。将连有 ΡΙΝΠ终止子、 mCherryW基因和 Ltp2 启动子的 pEASY-Blunt-simple 载体用限制性内切酶 BamHI 禾卩 EcoRI 切开，连入 CaMV35S增强子， CaMV35S增强子位于 Ltp2启动子的上游。这样就构建成了中间载体 B，上面连有基因表达盒 CaMV35S-Ltp2: mCherryW: ΡΙΝΠ。

接下来，用限制性内切酶 Bglll和 Hindlll将基因表达盒 ZmPG47: ZmBTl TP-ZmAAl： IN2- 1从中间载体 A上切下来，用限制性内切酶 Kpnl和 BamHI将基因表达盒 CaMV35S-Ltp2： mCherryW: PINII从中间载体 B 上切下来，同时连入用限制性内切酶 Kpnl和 Hindlll切开的 pCAMBIA 1300载体，即得到 pl300-130。上述构建过程如图 5所示。

实施例 5. 小麦的遗传转化

利用农杆菌法和基因枪法两种方法对小麦进行共转化，具体的转化受体材料为小麦 mslg突变体 4E异附加系（构建过程见实施例 2)，可以是小麦 mslg突变体 4E单体异附加系，也可以是小麦 mslg突变体 4E二体异附加系，本实施例采用的是小麦 mslg突变体 4E 单体异附加系。需要说明的是，所有能够完全恢复小麦 msl 突变体雄性不育表型的异染色体附加系都可以作为本发明的转化受体材料，除本案的来自长穗偃麦草的 4E染色体外，例如黑麦的 2R和 4R也可以恢复小麦 msl突变体的雄性不育表型，还有但不限于来自黑麦 2R 和 4R。进一步，所有能够利用近缘种的附加染色体恢复小麦隐性核雄性不育突变体（不限于 msl突变体）的异附加系，都可以作为本发明的受体。

实施例 6.转化事件的分子鉴定

设计引物对转基因小麦植株进行 PCR 鉴定。

F3: 5'- ATTCATGTACGGCTCCAAGG-3 ' ( SEQ ID NO: 12)

R3: 5'- TGGCCTTGTAGGTGGTCTTC -3 ' ( SEQ ID NO: 13 )

反应条件为： 94 °C预变性 5分钟； 94 °C变性 30秒； 55 °C退火 30秒； 72°C延伸 40秒； 35个循环； 72°C延伸 10分钟。扩增的是 mCherryW的部分片段，长度为 359 bp。根据 PCR 鉴定结果，选出阳性的转基因植株。采用 Southem-blot对转基因阳性植株中外源转基因的完整性和拷贝数进行鉴定，结果表明转基因阳性植株中外源基因完整且为单拷贝整合。实施例 7.转基因植株材料的花粉活性检测

对实施例 5 所述的转基因植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到明显的形态上的不同，但是其雄性生育能力不同。

以小麦 mslg突变体（不育，下面简称为 CK1 )和非转基因小麦 mslg突变体 4E异附加系（可育，下面简称为 CK2) 为对照，进行花粉活性检测。

在小麦盛花期，从外源基因整合在受体小麦 mslg突变体 4E异附加系中附加的长穗偃麦草 4E染色体上的转基因植株、 CK1 及 CK2 中各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取 1 个花药，置于载玻片中央，滴加一滴 1%的 I₂-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数不育花粉数和花粉总数（图 7 显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒），不育花粉占花粉总数的约 20%，与小麦 mslg突变体 4Ε单体异附加系中 4E染色体通过雄配子体向后代传递的比例为约 20%相符，说明了 T-DNA整合在 4E染色体上，且 T-DNA上带有的花粉致死基因能够导致转基因花粉失活。

实施例 8.荧光种子与非荧光种子分离比例

对实施例 6所述的转化体所结实的荧光与非荧光种子的分离比例进行了调查，结果表明荧光种子占总种子数的约 20%，非荧光种子占种子总数的约 80%，与小麦 ffl^ 突变体 4E 单体异附加系中 4E染色体通过雌配子体向后代传递的比例为约 20%相符，进一步也证明了 T-DNA整合在 4E染色体上。实施例 6和 7的结果表明本发明中所提供的表达载体各元件作为整体表达良好。

Claims

权利要求

1. 一种调控小麦育性的方法，所述方法包括：在纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系材料中，引入下述构建体，所述构建体包含花粉失活基因和筛选基因，其特征在于：所述纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系材料中含有一个能恢复其纯合隐性核雄性不育的异附加染色体，所述构建体在转入所述小麦材料后，其整合在该异附加染色体上。

2. 权利要求 1所述的方法，其中所述的异附加染色体来自长穗偃麦草的 4E染色体、或黑麦的 2R或 4R。

3. 权利要求 1或 2所述的方法，其中所述的花粉失活基因包括但不限于可编码促使碳水化合物降解的酶，如玉米 a淀粉酶基因、生长素 (auxin) , rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、 DAM甲基化酶、或显性的雄性不育基因。

4. 权利要求 3所述的方法，其中所述的玉米 a淀粉酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 15所示。

5. 权利要求 4所述的方法，其中所述的玉米 a淀粉酶基因的 5 ' 端连有一个导肽，所述导肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 14所示。

6. 权利要求 5所述的方法，其中所述的玉米 a淀粉酶基因由一个花粉发育晚期特异表达的启动子驱动表达，所述花粉发育晚期特异表达的启动子包括但不限于 ZmAPBl启动子、 ZmABP启动子、 ZmC5启动子、 MPCBP启动子、或 ZmPG47 启动子。

7. 权利要求 1或 2所述的方法，其中所述的筛选基因为一个荧光筛选基因，包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙 pl、 mCherryW等基因。

8. 权利要求 7所述的方法，其中所述的荧光筛选基因由一个种子特异表达的启动子驱动表达，所述种子特异表达的启动子包括但不限于 END2启动子、 Lt_P2 启动子等。

9. 一种表达盒，包含一个花粉失活基因和一个筛选基因，其特征在于所述花粉失活基因包括但不限于可编码促使碳水化合物降解的酶，如玉米 a淀粉酶基因、生长素 (auxin) , rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、 DAM甲基化酶、或显性的雄性不育基因；所述筛选基因为一个荧光筛选基因，包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙 pl、 mCherryW等基因。

权利要求 9所述的表达盒，其中所述的其中所述的花粉失活基因的 5 ' 端连有一个导肽，所述导肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 14所示。

权利要求 9或 10所述的表达盒，其中所述的花粉失活基因由一个花粉发育晚期特异表达的启动子驱动表达，所述花粉发育晚期特异表达的启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 2所示。

权利要求 11所述的表达盒，其中所述的花粉失活基因还连有一个终止子，所述终止子的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 3所示。

权利要求 11所述的表达盒，其中所述的筛选基因由一个种子特异表达的启动子驱动表达，所述种子特异表达的启动子包括但不限于 EN D2启动子、 Lt_P2 启动子等。

权利要求 13所述的表达盒，其中所述的启动子的 5 ' 端还连有一个增强子序列，所述增强子的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 5所示。

权利要求 14所述的表达盒，其中所述的荧光筛选基因的 3 ' 端连有一个终止子，所述终止子的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 7所示。

一种小麦细胞、组织、器官或种子，其特征在于所述小麦细胞、组织、器官或种子来自一种纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系材料，所述纯合隐性核雄性不育小麦突变体的异染色体附加系材料中含有一个能恢复其纯合隐性核雄性不育的异附加染色体，在该异附加染色体上外源转入了一个构建体，所述构建体包含权利要求 9-15之任一所述的表达盒。