CN106544358A - 一种水稻普通核不育系的繁殖方法 - Google Patents

一种水稻普通核不育系的繁殖方法 Download PDF

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袁光杰
袁贵龙
李新奇
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Abstract

本发明提供了一种水稻普通核不育系的繁殖方法，包括以下步骤：构建含有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K的表达载体；将表达载体转化至水稻普通核不育突变株中，获得T0代转基因植株；筛选T0代转基因植株中带有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K三个基因的可育株系；将可育株系进行自交繁殖，并从自交繁殖后代中的种子中分离出工程保持系种子和普通核不育系种子；将普通核不育系作为母本，将工程保持系作为父本进行杂交，收获母本植株上的种子即为不含转基因成分的普通核不育系种子。本发明方法具有不育系种子占比高、生产成本低等优势。

Description

一种水稻普通核不育系的繁殖方法
技术领域
本发明涉及水稻不育系的繁殖技术领域，尤其涉及一种水稻普通核不育系的繁殖方法。
背景技术
普通核不育受一对隐性核基因控制，一般不受外部环境因子的影响，不管环境条件怎样变化，总是表现为不育，这种不育类型在自然界中比较常见。在生产应用中，普通核不育具有以下优点：1)容易从普通核不育材料中选育出不育率和不育株都为100％的普通核不育系；2)育性正常的品种都是它的恢复系，恢复谱及其广泛，配组自由使得选育优良组合的几率大增；3)能紧跟常规稻的选育步伐，开辟籼粳亚种间杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标。因此，普通核不育系是一种理想的不育材料，袁隆平院士将普通核不育系应用于杂交水稻制种的技术称为第三代的杂交水稻，但由于这种类型的不育系没有相应的保持系，且自身不能进行育性转换，繁殖非常困难，这成为制约其大规模生产利用的关键因素。
由于越来越多的研究机构和科研工作者意识到普通核不育系巨大的利用价值和潜力，近年不少研究机构加大了对普通核不育系大规模繁殖问题上的研究投入和研究力度，并且取得了可喜的进展，例如：在隐性核不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死基因以及筛选标记基因三套元件，可以获得该雄性不育植株的中间父本，中间父本通过自交可以获得分离比为1∶1的中间父本和不育系。湖南杂交水稻研究中心申请的ZL201210426678.7号和ZL201210426939.5号中国专利文献中记载了将普通核不育基因对应的等位可育基因与颜色标记基因连锁在一起，构建能恢复普通核不育材料育性的载体，利用转基因技术转化普通核不育水稻构建杂合的工程保持系，该工程保持系与普通核不育系杂交后能获得分离比为1∶1的可育种子和不育的种子，其中可育的种子含有转基因成分带有颜色标记，可以继续用作工程保持系，而不育的种子不含转基因成分不带颜色标记，即为制种所需要的普通核不育系种子，普通核不育系种子可以根据颜色从可育的工程保持系中分选出来，袁隆平院士将这种利用工程保持系与普通核不育系杂交繁殖获得水稻普通核不育系的方式称为工程核不育系。
上述两种方法都能获得占比为50％的不育系，突破了普通核不育的繁殖难题，为推进普通核不育系大规模应用奠定了基础，但利用上述方法生产的普通核不育系种子只有当季产量的一半，使得普通核不育系种子的生产成本增加，从而导致最终的杂交种子生产成本升高。因此，探索一种不育系种子占比更高、生产成本更低的普通核不育系的繁殖方法，大幅度降低普通核不育系的繁殖成本，将为推进普通核不育系大规模应用具有重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种水稻普通核不育系的繁殖方法，通过失活含有转基因元件控制后代可育性状，所繁殖得到的不育系种子在母本植株上的占比可达到100％，具有不育系种子占比高、生产成本低等优势。
为解决上述技术问题，提供了一种水稻普通核不育系的繁殖方法，包括以下步骤：
S1、构建含有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K的表达载体；
S2、将所述表达载体转化至水稻普通核不育突变株中，获得T0代转基因植株，所述水稻普通核不育突变株的基因型为ss；
S3、筛选所述T0代转基因植株中带有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K三个基因的基因型为sSCK的可育株系；
S4、将所述可育株系进行自交繁殖，并从自交繁殖后代中的种子中分离出基因型为sSCK的工程保持系种子和基因型为ss的普通核不育系种子；
S5、将基因型为ss的普通核不育系作为母本，将基因型为sSCK的工程保持系作为父本进行杂交，收获母本植株上的种子即为不含转基因成分的普通核不育系种子。
一种水稻普通核不育系的繁殖方法，包括以下步骤：
S1、构建含有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K的表达载体；
S2、将所述表达载体转化至水稻普通核不育突变株中，获得T0代转基因植株，所述水稻普通核不育突变株的基因型为ss；
S3、筛选所述T0代转基因植株中带有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K三个基因的基因型为sSCK的可育株系；
S4、将所述可育株系进行自交繁殖，并从自交繁殖后代中的种子中分离出基因型为sSCK的工程保持系种子和基因型为ss的普通核不育系种子；
S5、将所述基因型为ss的普通核不育系种子和所述基因型为sSCK的工程保持系种子按照母本数量与父本数量为1∶1至4∶1的比例混播混收方式繁殖，通过色选分离出不含转基因成分的普通核不育系种子。
上述的繁殖方法，优选的，所述颜色标记基因C为红色荧光蛋白基因DsRed、红色荧光蛋白标记基因RFP、绿色荧光蛋白基因GFP、绿色荧光蛋白基因EGFP或蓝色荧光蛋白基因EBF。
上述的繁殖方法，优选的，所述花粉失活基因K为ZmAA1基因。
上述的繁殖方法，优选的，所述水稻普通核不育突变株中的不育基因s为msp1、pair1、pair2、zep1、mel1、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、rip1、csa或aid1。
上述的繁殖方法，优选的，所述表达载体为植物表达载体。
上述的繁殖方法，优选的，所述植物表达载体为pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301和pBI121中的一种。
上述的繁殖方法，优选的，所述S2步骤中，所述水稻普通核不育突变株通过遗传选育、物理化学诱变或基因编辑获得。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种水稻普通核不育系的繁殖方法，培育后的水稻工程保持系在花粉发育的过程中，含有转基因成分并控制后代可育性状的小孢子在花粉失活基因的控制下不能发育成具有正常功能的花粉，而不含转基因成分并控制后代不育性状的小孢子则能发育成正常的花粉。因此，当作为父本的工程保持系与作为母本的普通核不育系杂交繁殖不育系时，只有一种花粉即不含转基因成分并控制后代不育性状的花粉能与不育系的雌配子体形成合子，进而发育成普通核不育系种子，所繁殖得到的不育系种子在母本植株上的占比为100％，显著提高了不育系繁殖产量，降低了后续的制种成本。
(2)本发明提供了一种水稻普通核不育系的繁殖方法，采用工程保持系和普通核不育系以1∶1至4∶1的比例混播混收的方式繁殖不育系时，后代种子通过色选分离出的不育系种子占比为75％～90％，这种混播混收的方法不仅提高了不育系繁殖产量，降低了后续的制种成本，也大大减少了播种和收割成分。但实际操作过程中，工程保持系和普通核不育系的比例并不限于此，如果调高两者的比例，不育系的繁殖产量将上升；如果调低两者的比例，则不育系的繁殖产量将下降。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中普通核不育系繁殖的工艺流程图。
图2为本发明实施例1中构建表达载体pEAT1DsRed+ZmAA1图。
图3为本发明实施例1中工程保持系自交繁殖图。
图4为本发明实施例1中采用父母本分插的方式繁殖普通核不育系种子的流程图。
图5为本发明实施例1中PCR检测普通核不育系凝胶电泳图，其中M为1kb DNAmaker，1～24为普通核不育系系PCR扩增带型，因为不含转基因成分，故无相应大小的条带。
图6为本发明实施例1中PCR检测工程保持系凝胶电泳图，其中M为1kb DNA maker，1～24为父本工程保持系PCR扩增带型，条带大小为556bp。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的水稻普通核不育系的繁殖方法，参见图1，包括以下步骤：
(1)构建含有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K的表达载体，具体包括以下步骤：
1.1、选择EAT1(ETERNAL TAPETUM 1)基因突变的水稻普通核不育系，基因型为eat1/teat1；EAT1编码一个的bHLH转录因子，绒毡层特异表达，正向调控水稻花药绒毡层细胞的程序性死亡。如果EAT1基因发生突变，绒毡层细胞死亡延迟，花药干瘪、花粉粒败育，不能形成正常的花粉粒，而雌性器官发育都正常，产生一种水稻普通雄性核不育系(参见CN201310383378.X号中国专利文献)。EAT1基因为SEQ ID NO.1所示的序列。
1.2、根据上述EAT1基因的序列设计以下引物：
EAT1-F:CCGAACTGCCGTCTTAATGTTTTTTCCATT；
EAT1-R:CGCAGTGACCAGATTGAGATAACATGATCAA。
1.3、根据设计的引物克隆出上述水稻普通核不育系来源亲本的等位基因，即野生型基因EAT1，由于不育基因eat1是从野生型基因EAT1突变得到，因此，该野生型基因EAT1即能够恢复本实施例水稻普通核不育系育性的可育基因；野生型基因EAT1以其自身启动子驱动。
1.4、将红色荧光蛋白基因DsRed(DsRed基因为SEQ ID NO.2所示的序列)、花粉失活基因ZmAA1(ZmAA1基因为SEQ ID NO.3所示的序列)与EAT1基因连接到同一个植物表达载体：pCAMBIA1300上，使红色荧光蛋白基因DsRed、花粉失活基因ZmAA1与可育基因EAT1在导入植物后能连锁遗传、共分离，得到表达载体pEATDsRed+ZmAA(参见图2)。
其中红色荧光蛋白基因DsRed由胚乳特异性启动子PGt1(SEQ ID NO.4所示的序列)驱动和TPINII(SEQ ID NO.5所示的序列)终止子终止。
花粉失活基因ZmAA1由玉米花粉特异性启动子PPg(SEQ ID NO.6所示的序列)驱动和TIN2-1(SEQ ID NO.7所示的序列)终止子终止。
EAT1基因由自身启动子PEAT1(SEQ ID NO.8所示的序列)驱动和TEAT1(SEQ ID NO.9所示的序列)终止子终止。
(2)采用农杆菌介导法将步骤4的表达载体pEATDsRed+ZmAA转入上述的基因型为eat1/teat1的水稻普通核不育系中，获得T0代转基因植株。
(3)筛选所述T0代转基因植株中带有颜色标记基因DsRed、育性恢复基因EAT1和花粉失活基因ZmAA1三个基因的可育株系，具体步骤为：
3.1、根据红色荧光蛋白基因DsRed的序列设计引物：
DsRed-F:CAACACCGTGAAGCTGAAGG；
DsRed-R:CTACAGGAACAGGTGGTGGC。
3.2、根据花粉失活基因ZmAA1的序列设计引物：
ZmAA1-F：TTCCACGGTGGTTAGTGGTTACTTCT；
ZmAA1-R：CTGTAGCTCAGCGAGTTCCATATCTC。
3.3、用上述两对引物：DsRed-F、DsRed-R、ZmAA1-F、ZmAA1-R对T0代转基因株系进行PCR检测，并辅以育性观察筛选得到13株带有红色荧光蛋白基因DsRed和花粉失活基因ZmAA1的育性恢复的可育株系(T0代转基因株系)。
(4)上述13株可育株系中由于导入有花粉失活基因ZmAA1，而花粉失活基因ZmAA1的作用为使含有转基因成分的花粉失活，因此该13株T0代转基因可育株系只能为杂合基因型，但转基因成分的拷贝数可能不是单一拷贝数；为了获得单一拷贝数的工程保持系，从13株T0代可育转基因株系收获种子后，通过自交繁殖(本实施例采用了3代的自交繁殖)、可育单株收种、发红色荧光种子留种的方法(具体流程参见图3)，获得2株育性稳定、结实率高且带有单拷贝的红色荧光蛋白基因DsRed和花粉失活基因ZmAA1的工程保持系(基因型为eat1/EAT1DsRed+ZmAA)。
(5)以上述2株基因型为eat1/EAT1DsRed+ZmAA的工程保持系为父本与基因型为eat1/eat1的母本不育系杂交(具体流程参见图4)，共收获2083粒不带红色荧光标记的种子，这些种子的基因型为eat1/eat1，为本实施例应用所需制得的水稻普通核不育系的种子。
(6)从2083粒不带红色荧光标记的种子挑选500粒颗粒饱满的种子发芽育秧后，移栽320株至大田，每8株一行，种植40行，作为母本。母本四周移栽2行工程保持系(基因型为eat1/EAT1DsRed+ZmAA)作为父本。
苗期分单株取父母本叶片，提DNA后，用DsRed基因序列设计的引物DsRed-F和DsRed-R进行PCR检测，检测结果显示320株母本都没有检测到556bp的目的条带(图5)，而工程保持系能检测到556bp的目的条带(图6)，这说明发标记荧光与基因型为eat1/EAT1DsRed +ZmAA工程保持系种子对应，而不发标记荧光则与基因型为eat1/eat1的普通核不育系的种子对应。
抽穗扬花前，用塑料薄膜隔离制种田块，防止窜粉，抽穗扬花时人工赶粉。籽粒成熟后，晒干称重，320株母本共获得6.41kg种子。6.41kg种子通过色选分离后发现9粒发荧光的种子；经PCR鉴定，9粒种子的基因型与工程保持系的基因型相同，可能为收种时从父本行混入的工程保持系种子。可见，依照本发明方法，用320株水稻普通核不育系种子就能繁殖得到6.41kg上述普通核不育系种子，母本植株上繁殖获得了不育系种子的占比为100％。
实施例2：
一种本发明的水稻普通核不育系的繁殖方法，与实施例1的区别在于：步骤(6)采用普通核不育系和工程保持系以3∶1的比例混播混收的方式繁殖不育系。具体步骤为：
从实施例1步骤(5)中余下的1583粒普通核不育系种子中挑选出1500粒与500粒工程保持系种子混播混插。抽穗扬花前，用塑料薄膜隔离制种田块，防止窜粉；抽穗扬花时，人工赶粉。籽粒成熟后，混收种子晒干称重，共获得干种子42.66kg，通过色选分离后获得不发荧光的不育系种子36.57kg，发荧光的工程保持系种子6.09kg。不育系种子占全部干种子的百分比为85.72％与理论值87.5％无显著差异。
上述的实施例仅是本申请优选的实施例，在本申请中，水稻普通核不育突变体还可以从突变体库RiceGE购买，购买网址：http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE；常见的可适用于本发明方法的普通核不育基因如下表1所示：
表1：水稻普通核不育突变体列表
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 水稻普通核不育系的繁殖方法
<130> 无
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5219
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 1
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tactgaattt acagttctta cttttagtga tcagcttata ataaatgaag tatatttggc 2160
attggcaatg atttcaagct actcagcatt ttactgatta attagtaaac ttggggtggt 2220
tgaagcacat tttatcaaac atcaatatga atatgattag aggcaaagaa agatggtaag 2280
gagtttgtta ggtctgcaac aagcaaagtt gcttcatgtc tcattaatca tgctatatgc 2340
aacttctcta cacggaataa acagacagac agattgcgta gcttaaactc cacggctcca 2400
tcttcccttg aaacaaccaa aacagctaag ccaactgaaa attttcatgt ccgattgaat 2460
tatatccact gcttcattca tgttgagtag ccctgtttcc cttaatatgt gcattgcaag 2520
taatttctat tttagcacta gattagcacc catctaagat gctatttgtc cttcattttc 2580
atcctgtcct tgattcttct gctcatatgt ttttttactt gtgttggttt tagatttgga 2640
gcgaaggtgc ctagcactgt tttgccaaaa tgattgttgg ggctggttac tttgaggatt 2700
cccacgatca aagtctcatg gcaggatctt tgatccatga ctcaaatcaa gctcctgcaa 2760
gcagtgaaaa cacaagcatt gatttgcaga aattcaaagt gcacccgtac tcaacagaag 2820
ctctctcgaa tacggccaat ctagctgaag ctgcaagagc aattaaccac cttcaacatc 2880
aactagaaat tgatttggag caagaggttc ccccagtaga aactgcaaac tgggatccag 2940
ctatctgcac tataccagat catatcatca accatcagtt tagcgaagat ccacaaaaca 3000
tattggtgga gcaacagatc cagcagtatg attctgcact ttatccaaat ggtgtttaca 3060
cacctgcacc agatctcctt aatcttatgc agtgcacaat ggctccagca ttcccggcaa 3120
cgacatccgt attcggtgac acaacactga atggtactaa ctatttggat cttaacggtg 3180
aacttacagg agtagcagcg gttccagaca gtgggagtgg gttgatgttt gctagtgatt 3240
cagctctcca gttagggtac catggtactc aatctcatct aataaaggat atctgccact 3300
cgttgcccca aaattatggg ttgtttccca gtgaggacga acgagatgtg attattggtg 3360
ttggaagtgg agatcttttt caggagatag atgacaggca gtttgatagt gtacttgaat 3420
gcaggagagg gaagggtgag ttcggaaagg gcaagggaaa agctaatttt gcaactgaga 3480
gagagaggcg ggagcagcta aatgtgaagt tcaggaccct aagaatgctc ttcccaaatc 3540
ctaccaaggt tagtcttatt catcatcttg caagttatta gttgtttagg ctgtaaataa 3600
cttggtgatt ctcacattaa cagacaacca ctcagatttt caataatatt tccatttgtt 3660
actcatgctc tgaagataat caaaatttta aatatcctca tccatttatt ctcagagaac 3720
taatgattca aaaactgcca acaccaatat agctccggtt tagcaaatct ctgttttttt 3780
acagatcaca aatacctaac agtaaattta taagtctgtg tattcatcta actggtataa 3840
attttgaaat tatctgtcca aaatttcttc aagttgcgtt accacatttt gatgcatatg 3900
tatatggaat atgctgtctg atatatcact caacatgatt gttttttgaa aaatagttca 3960
tcagtatgat gttctttact gataacagtg ccatgttatt aagggttgtt ttggttttaa 4020
gccaaattat gccctaccaa attgttggca ttttgaaaag ttatttggca aagtttggct 4080
tgccaccaaa gttggtcaag ttttggcact accaatatat tgacatggta acaaatcaaa 4140
acacccctaa ttgtgttcat cctaaccaag tgagttagcc cttctagtta gctaggagaa 4200
agcaatagaa gcattcagtt cgatatttcc tatgttcctt gccttttttg tgtgttagca 4260
cattccacaa tgttatcatc ctcatgatgt tacccttcaa caagattgta gcacttaaat 4320
atcttggttg tggcactaat gtgttacaaa ctgtgctcta gaatgacagg gcctcaatag 4380
taggtgatgc cattgagtat atagatgagc tcaatcgaac agtgaaggag ctgaagatcc 4440
tggtggaaca gaagaggcat ggaaataaca ggagaaaggt gttaaagttg gatcaagagg 4500
cagccgctga tggcgagagc tcatcgatga ggccagtgag ggatgatcaa gacaatcagc 4560
tccatggagc cataaggagc tcatgggttc agaggaggtc aaaggaatgc cacgttgatg 4620
tccgcatagt ggacgatgaa gtaaacatca agctcactga aaagaagaag gccaactctc 4680
tgcttcatgc agcaaaggtt ctagatgagt tccagctcga gcttatccat gtagtgggtg 4740
ggattatagg tgatcaccat atattcatgt tcaacactaa ggtaagtaac aattcagttt 4800
tcttaaagta gaatcaaaga ttctttttgt cccattacac atgttagcat cgatagtaac 4860
gattcatcat ccatggcaac tcaggtatca gaaggttcgg cggtttatgc atgtgcagtg 4920
gcaaagaagc tccttcaagc agtggacgtg caacaccagg ccctcgacat attcaactaa 4980
tctttagcaa cagtactgat tatctgaaca atgtcctaga ttttcagtta ccttgctgag 5040
caaacttatt tgaccaggat tggagagaat tttatcttta gcactagcta cctagcaaaa 5100
cttcttaaca atttggccat gtaacggctt gctgctgtcc ggttgtacac cttaactagc 5160
ctgactagga aagctttgat gcttgtcttg tgtatttgat catgttatct caatctggt 5219
<210> 2
<211> 702
<212> DNA
<213> 焦珊瑚DNA序列
<400> 2
atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60
accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120
cacaacaccg tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180
ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240
gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300
gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360
aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420
atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480
acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540
tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600
atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660
caccacctgt tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gt 702
<210> 3
<211> 1561
<212> DNA
<213> 玉米基因组序列
<400> 3
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240
caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300
tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360
ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420
ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480
ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540
gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cttggactgg 600
ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660
acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720
gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780
ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840
ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900
ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960
gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020
gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080
gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140
ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200
tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260
gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320
gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380
ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440
gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctagca gctcagattg 1500
ctcagtcttg tgctgcattg caaacacagc agcacgacac tgcataacgt cttttccttg 1560
a 1561
<210> 4
<211> 1861
<212> DNA
<213> 水稻基因组序列
<400> 4
aagcttcacc ctcaatattt ggaaacattt atctaggttg tttgtgtcca ggcctataaa 60
tcatacatga tgttgtcgta ttggatgtga atgtggtggc gtgttcagtg ccttggattt 120
gagtttgatg agagttgctt ctgggtcacc actcaccatt atcgatgctc ctcttcagca 180
taaggtaaaa gtcttccctg tttacgttat tttacccact atggttgctt gggttggttt 240
tttcctgatt gcttatgcca tggaaagtca tttgatatgt tgaacttgaa ttaactgtag 300
aattgtatac atgttccatt tgtgttgtac ttccttcttt tctattagta gcctcagatg 360
agtgtgaaaa aaacagatta tataacttgc cctataaatc atttgaaaaa aatattgtac 420
agtgagaaat tgatatatag tgaattttta agagcatgtt ttcctaaaga agtatatatt 480
ttctatgtac aaagccattg aagtaattgt agatacaggt aattagactt tttggactta 540
cactgctacc tttaagtaac aatcatgagc aatagtgttg caatgatatt taggctgcat 600
tcgtttactc tcttgatttc catgagcacg cttcccaaac tgttaaactc tgtgtttttt 660
gccaaaaaaa aatgtatagg aaagttgctt ttaaaaaatc atatcaatcc attttttaag 720
ttatagctaa tacttaatta atcatgcgct aataagtcac tctgtttttc gtactagaga 780
gattgttttg aaccagcact caagaacaca gccttaaccc agccaaataa tgctacaacc 840
taccagtcca cacctcttgt aaagcatttg ttgcatggaa aagctaagat gacagcaacc 900
tgttcaggaa aacactgaca aggtcatagg gagagggagc ttttggaaag gtgccgtgca 960
gttcaaacaa ttagttagca gtagggtgtt ggtttttgct cacagcaata agaagttaat 1020
catggtgtag gcaacccaaa taaaacacca aaatatgcac aaggcagttt gttgtattct 1080
gtagtacaga caaaactaaa agtaatgaaa gaagatgtgg tgttagaaaa ggaaacaata 1140
tcatgagtaa tgtgtgagca ttatgggacc acgaaataaa aagaacattt tgatgagtcg 1200
tgtatcctcg atgagcctca aaagttctct caccccggat aagaaaccct taagcaatgt 1260
gcaaagtttg cattctccac tgacataatg caaaataaga tatcatcgat gacatagcaa 1320
ctcatgcatc atatcatgcc tctctcaacc tattcattcc tactcatcta cataagtatc 1380
ttcagctaaa tgttagaaca taaacccata agtcacgttt gatgagtatt aggcgtgaca 1440
catgacaaat cacagactca agcaagataa agcaaaatga tgtgtacata aaactccaga 1500
gctatatgtc atattgcaaa aagaggagag cttataagac aaggcatgac tcacaaaaat 1560
tcacttgcct ttcgtgtcaa aaagaggagg gctttacatt atccatgtca tattgcaaaa 1620
gaaagagaga aagaacaaca caatgctgcg tcaattatac atatctgtat gtccatcatt 1680
attcatccac ctttcgtgta ccacacttca tatatcataa gagtcacttc acgtctggac 1740
attaacaaac tctatcttaa catttagatg caagagcctt tatctcacta taaatgcacg 1800
atgatttctc attgtttctc acaaaaagca ttcagttcat tagtcctaca acaacggatc 1860
c 1861
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> 土豆基因组序列
<400> 5
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca 60
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac 120
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac 180
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat 240
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg 300
tgttttgcga atgcggcc 318
<210> 6
<211> 2743
<212> DNA
<213> 玉米基因组序列
<400> 6
aggatctgca ccggacactg tctggtggca taccagacag tccggtgtgc cagatcaggg 60
cacccttcgg ttcctttgct cctttgcttt tgaaccctaa ctttgatcgt ttattggttt 120
gtgttgaacc tttatgcacc tgtggaatat ataatctaga acaaactagt tagtccaatc 180
atttgtgttg ggcattcaac caccaaaatt atttatagga aaaggttaaa ccttatttcc 240
ctttcaatct cccccttttt ggtgattgat gccaacacaa accaaagaaa atatataagt 300
gcagaattga actagtttgc ataaggtaag tgcataggtt acttagaatt aaatcaattt 360
atacttttac ttgatatgca tggttgcttt cttttatttt aacattttgg accacatttg 420
caccacttgt tttgtttttt gcaaatcttt ttggaaattc tttttcaaag tcttttgcaa 480
atagtcaaag gtatatgaat aagattgtaa gaagcatttt caagatttga aatttctccc 540
cctgtttcaa atgcttttcc tttgactaaa caaaactccc cctgaataaa attctcctct 600
tagctttcaa gagggtttta aatagatatc aattggaaat atatttagat gctaattttg 660
aaaatatacc aattgaaaat caacatacca atttgaaatt aaacatacca atttaaaaaa 720
tttcaaaaag tggtggtgcg gtccttttgc tttgggctta atatttctcc ccctttggca 780
ttaatcgcca aaaacggaga ctttgtgagc catttatact ttctccccat tggtaaatga 840
aatatgagtg aaagattata ccaaatttgg acagtgatgc ggagtgacgg cgaaggataa 900
acgataccgt tagagtggag tggaagcctt gtcttcgccg aagactccat ttccctttca 960
atctacgact tagcatagaa atacacttga aaacacatta gtcgtagcca cgaaagagat 1020
atgatcaaag gtatacaaat gagctatgtg tgtaatgttt caatcaaagt ttcgagaatc 1080
aagaatattt agctcattcc taagtttgct aaaggtttta tcatataatg gtttggtaaa 1140
gatatcgact aattgttctt tggtgctaac ataagcaatc tcgatatcac ccctttgttg 1200
gtgatccctc aaaaagtgat accgaatgtc tatgtgctta gtgcggctgt gttcaacggg 1260
attatccgcc atgcagatag cactctcatt gtcacatagg agagggactt tgctcaattt 1320
gtagccatag tccctaaggt tttgcctcat ccaaagtaat tgcacacaac aatgtcctgc 1380
ggcaatatac ttggcttcgg cggtagaaag agctattgag ttttgtttct ttgaagtcca 1440
agacaccagg gatctcccta gaaactgaca agtccctgat gtgctcttcc tatcaatttt 1500
acaccctgcc caatcggcat ctgaatatcc tattaaatca aaggtggatc ccttggggta 1560
ccaaagacca aatttaggag tgtaaactaa atatctcatg attcttttca cggccctaag 1620
gtgaacttcc ttaggatcgg cttggaatct tgcacacatg catatagaaa gcatactatc 1680
tggtcgagat gcacataaat agagtaaaga tcctatcatc gaccggtata ccttttggtc 1740
tacggattta cctcccgtgt cgaggtcgag atgcccatta gttcccatgg gtgtcctgat 1800
gggcttggca tccttcattc caaacttgtt gagtatgtct tgaatgtact ttgtttggct 1860
gatgaaggtg ccatcttgga gttgcttgac ttgaaatcct agaaaatatt tcaacttccc 1920
catcatagac atctcgaatt tcggaatcat gatcctacta aactcttcac aagtagattt 1980
gttagtagac ccaaatataa tatcatcaac ataaatttgg catacaaaca aaacttttga 2040
aatggtttta gtaaagagag taggatcggc tttactgact ctgaagccat tagtgataag 2100
aaaatctctt aggcattcat accatgctgt tggggcttgc ttgagcccat aaagcgcctt 2160
tgagagttta taaacatggt tagggtactc actatcttca aagccgagag gttgctcaac 2220
atagacctat tcaccccatt tgatcacttt tttggtcctt caggatctaa tagttatgta 2280
taatttagag tctcttgttt aatggccaga tatttctaat taatctaaga atttatgata 2340
ttttttaatt ttttatcatg tctgatgaga attaacataa aggctcaatt gggtcctgaa 2400
ttaataatag agtgaaaatt aatccagagg ctctattaga accttcaatt agtaatacca 2460
agatatatat aagatagtag agtatagttt aaatgttggc attgttcatt ctttcttttg 2520
ttatttaatt tatgctttcc acggtggtta gtggttactt ctgaagggtc caaataatgc 2580
atgaagagtt tgaggacaag aagtctgccc taaaaatagc gatgcaaagg catggtgtcc 2640
aagccataca tatagcgcac taattttatc agcagaacaa tggtatttat aggtcctagt 2700
gcccaggcaa caagagacac gaataaagca tcgatcacga cac 2743
<210> 7
<211> 348
<212> DNA
<213> 玉米基因组序列
<400> 7
gatctgacaa agcagcatta gtccgttgat cggtggaaga ccactcgtca gtgttgagtt 60
gaatgtttga tcaataaaat acggcaatgc tgtaagggtt gttttttatg ccattgataa 120
tacactgtac tgttcagttg ttgaactcta tttcttagcc atgccaagtg cttttcttat 180
tttgaataac attacagcaa aaagttgaaa gacaaaaaaa aaaacccccg aacagagtgc 240
tttgggtccc aagctacttt agactgtgtt cggcgttccc cctaaatttc tccccctata 300
tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg 348
<210> 8
<211> 2669
<212> DNA
<213> 水稻基因组序列
<400> 8
ccgaactgcc gtcttaatgt tttttccatt ttgcaaaatc ggcctttacg gaatgtacca 60
tactaatgtc agattgtcag ttgcatcgta ccagaccatc aacacgtcca aataaaatag 120
agaattgcac ctatacatat cattggatca gaacaaaagt agagtctttt cacacaaaaa 180
tgcattggag tattaaaaaa aaaagtctct caaagagaga aaagaggtca aaaatggaag 240
aaggataaaa ggtatcgaga ggagtatgtt gcaatgggaa gtcggtgatt tggaggattc 300
gtactctgtt gaacaggaga atgcggctat ttgaccgtgc aaatgcgttc tgcgtgcctc 360
aacccaccgc gaatccagct gaagcaagga gagcgtgaga cgtctccctt tcccctccaa 420
aacacctcac gcctcctctt catcttgggt ccaagcagga ggttgcacgt ctgtgcacaa 480
tgtcacaagg cgagagagcc gtggaggtta acagtatacg caccttgtca ggagtggaat 540
tcttggcaat accattgtgc ttgtgcatgc gagctcccag aagttatgga gagaaaccta 600
atggattcca gacccctcat gataactgtc agaagtgcat aatccgtaaa ctctacctga 660
tcaacagaat ataacaggta ttggttaact atgttaagaa ggtaatataa ctgtactggc 720
aatccatagt tcatgcagga ttgaattcac attgcatcca atgatgaccg caggcacacc 780
acgaggaatc catcaaacga aacagaaaag gaggttacac cattaataga agcacttaga 840
acggcgctgt tcacatagct gcatcattct aagaaatgat tccataacca gataggactc 900
cagtaccaaa agattaattt aacatagatg gataaaaata atgtagatta tctcagcagg 960
tgtcatattg caagcaatgc aacctaaagc ataaaacaat tgcctgttgt gaaagaatgt 1020
tatataatat cagttactct atatggttca aatcccttga tccagagcta gatatgagtc 1080
catcacctat tagtaataat tatttaggca atctcagttt aaacttcaga aaattctttg 1140
cagacgaaat atacgcatat tattaattca caatggaaaa aaaagcaaag tagtagttac 1200
ctataacatc attaacagct acagcaaaat ctgaaggtgt gatcgatgct acattattga 1260
catgcagcct gcatgcgtat cgtggtcatc tgtctatttt acatgcactt gtagctggat 1320
aaacttacag tgtctgatgc ttcacaattt aagtctgagg gaaggtgctg aaactcaagg 1380
atcagtacct tgatgggtaa aaccggaaag atctagaaca tctggaatta agcagaccaa 1440
gaagagtgca cactgcacag ctatatacaa atacaatcaa gttcaaatta cagatactga 1500
tatctacact acataatgca agattatgtg ctctttgaat acttgaagcc ttgtaggtag 1560
ttgtatgttt agtttctcaa agcataactg cagcagtaca aatcatagaa tatggtaaga 1620
ggcagaaagc atgacttgca tttctcaact tcctatgggt gaataacatc aaagatgcca 1680
aattcaaagg gtgtgagctt tccgtctttc tcggctatgt ctcttataat aacaataaca 1740
atcatatgat agaacttcac tttgaccttt attatatggt cataaagacc cttcagcaaa 1800
atgattgtta ctgctatcgg cattttctgt tgtttttctt ttggaatcaa tcttgtgtga 1860
caccattgta ttgtttcatg tcttgccact ataatagtct tggcatagca ctggatctca 1920
tgagtctttg agccgcaaat tcatgaacat aagttctttc cattcaaccg ttggctgagg 1980
caaagataca ggtatgtttt ttccagtgct tgctactact gtttgcagga tgcaaatcct 2040
aattagcatt ggtttatgtt tctgtaaatt agttgttaag ttctatagaa ctttcaatca 2100
tactgaattt acagttctta cttttagtga tcagcttata ataaatgaag tatatttggc 2160
attggcaatg atttcaagct actcagcatt ttactgatta attagtaaac ttggggtggt 2220
tgaagcacat tttatcaaac atcaatatga atatgattag aggcaaagaa agatggtaag 2280
gagtttgtta ggtctgcaac aagcaaagtt gcttcatgtc tcattaatca tgctatatgc 2340
aacttctcta cacggaataa acagacagac agattgcgta gcttaaactc cacggctcca 2400
tcttcccttg aaacaaccaa aacagctaag ccaactgaaa attttcatgt ccgattgaat 2460
tatatccact gcttcattca tgttgagtag ccctgtttcc cttaatatgt gcattgcaag 2520
taatttctat tttagcacta gattagcacc catctaagat gctatttgtc cttcattttc 2580
atcctgtcct tgattcttct gctcatatgt ttttttactt gtgttggttt tagatttgga 2640
gcgaaggtgc ctagcactgt tttgccaaa 2669
<210> 9
<211> 245
<212> DNA
<213> 水稻基因组序列
<400> 9
tctttagcaa cagtactgat tatctgaaca atgtcctaga ttttcagtta ccttgctgag 60
caaacttatt tgaccaggat tggagagaat tttatcttta gcactagcta cctagcaaaa 120
cttcttaaca atttggccat gtaacggctt gctgctgtcc ggttgtacac cttaactagc 180
ctgactagga aagctttgat gcttgtcttg tgtatttgat catgttatct caatctggtc 240
actgc 245

Claims (8)

1.一种水稻普通核不育系的繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建含有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K的表达载体；
S2、将所述表达载体转化至水稻普通核不育突变株中，获得T0代转基因植株，所述水稻普通核不育突变株的基因型为ss；
S3、筛选所述T0代转基因植株中带有颜色标记基因C、普通核不育的育性恢复基因S和花粉失活基因K三个基因的可育株系；所述可育株系的基因型为sSCK；
S4、将所述可育株系进行自交繁殖，并从自交繁殖后代中的种子中分离出基因型为sSCK的工程保持系种子和基因型为ss的普通核不育系种子；
S5、将基因型为ss的普通核不育系作为母本，将基因型为sSCK的工程保持系作为父本进行杂交，收获母本植株上的种子即为不含转基因成分的普通核不育系种子。
2.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于，所述S5步骤替换为：将所述基因型为ss的普通核不育系种子和所述基因型为sSCK的工程保持系种子按照母本数量与父本数量为1∶1至4∶1的比例混播混收方式繁殖，通过色选分离出不含转基因成分的普通核不育系种子。
3.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于，所述颜色标记基因C为红色荧光蛋白基因DsRed、红色荧光蛋白标记基因RFP、绿色荧光蛋白基因GFP、绿色荧光蛋白基因EGFP或蓝色荧光蛋白基因EBF。
4.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于，所述花粉失活基因K为ZmAA1基因。
5.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于，所述水稻普通核不育突变株中的不育基因s为msp1、pair1、pair2、zep1、mel1、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、rip1、csa或aid1。
6.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体。
7.根据权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301和pBI121中的一种。
8.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述水稻普通核不育突变株通过遗传选育、物理化学诱变或基因编辑获得。
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