CN108329383B

CN108329383B - 一种与玉米杂交不亲和相关的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108329383B
Application number: CN201810126843.4A
Authority: CN
Inventors: 陈化榜; 张照贵; 赵丽
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Beijing Huahualiang Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CN108329383A

Abstract

本发明公开了一种与玉米杂交不亲和相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物杂交不亲和相性关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的ZmGalP基因在玉米中能够控制杂交不亲和性，即在玉米中表达ZmGalP基因可以突破Gal‑S/Gal‑S基因型玉米材料的杂交不亲和障碍，从而使其结实。本发明为植物特别是玉米的不亲和性研究提供了新的基因资源，其可在玉米育种和制种过程中得以利用。

Description

一种与玉米杂交不亲和相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种与玉米单向杂交不亲和现象相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

玉米单向杂交不亲和性(unidirectional cross-incompatibility，CI)是指存在某些玉米，它们可以接受相同种类玉米的花粉，也可以给其它常规玉米授粉，却不能接受其它常规玉米的花粉而结实的现象(Nelson Jr，1952)。由于它影响了单倍体配子有性传递的过程，所以将控制这种现象的因子称之为Gametophyte Factor，即Ga。玉米第一个Ga材料(Ga1)是由Correns于1902年发现的。早在1929年Demerec就发现，用马齿型、硬粒型或甜玉米给一些爆裂型玉米授粉时不能结实，而反交，即用爆裂型玉米给马齿型、硬粒型或甜玉米授粉则可正常结实(Demerec，1929)，研究表明，这些爆裂型玉米是Ga1-S/Ga1-S基因型。自然界中的Ga1-S/Ga1-S基因型只存在于爆裂玉米、极少数中美洲玉米及玉米的祖先大刍草中，而绝大多数马齿型和硬粒型栽培玉米都是ga1/ga1基因型(Lino et al.，2008)。虽然Ga1类的材料自发现距今已有百年历史，然而对控制其单向杂交不亲和性的基因的研究才刚刚起步，对其调控的杂交不亲和的机理更是知之甚少。

目前，已有位于不同染色体上的多个Ga位点被发现(Chr.1，Ga4&Ga 6；Chr.2&3，Ga7；Chr.4，Ga1；Chr.5，Ga2&Ga10；Chr 6&7，Ga3；Chr，9，Ga8)(Kermicle and Allen，1990；Nelson，1994；Kermicle and Evans，2010；Lausser et al.，2010)，然而由于遗传背景或是修饰基因的影响，大多数Ga位点材料的单向杂交不亲和性都不彻底。只有三个Ga位点由于其接近100％的单向杂交不亲和性而被人们广泛关注，它们分别是由Correns于1902年发现的Ga1，由Burnham于1936年报道的Ga2和由Kermicle于1990年报道的Tcb1。其中Ga1是迄今为止发现的不亲和性最为彻底的位点，因此在玉米生产实践中的应用也最有价值和意义。

玉米Ga1杂交不亲和是由单一主效位点控制的，包括Ga1-S，Ga1-M和ga1三种类型。用ga1类型的玉米花粉给Ga1-S/Ga1-S型的母本授粉，其结实率为0；和Ga1-S相比，Ga1-M失去了花丝对ga1花粉不亲和的功能，能够接受来自ga1材料的花粉而结实，但仍具有雄配子的功能，即Ga1-M花粉给Ga1-S/Ga1-S型的母本授粉能结实。三者的关系如表1。

表1.Ga1-S、Ga1-M和ga1三者亲和性的关系

注：√代表亲和；×代表不亲和

Ga1具有下述特点：1. 100％的单向杂交不亲和性；2.Ga1-S基因型只存在于爆裂玉米和极少数中美洲玉米类型；3.几乎所有的栽培玉米都是ga1基因型；4.利用常规育种回交转育的方法可将Ga1-S基因型从爆裂型玉米回交转育到马齿和硬粒等普通玉米中去。基于Ga1的特性，可以利用其作为不同类型玉米生物学隔离的工具，特别是转基因玉米和非转基因玉米、常规玉米和专用玉米之间的生物学隔离；同时，还可用于研究玉米传粉授精过程中的基因互作和信号传导以及不亲和机理。如上所述，对Ga1的研究，既具科学理论价值又有生产应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种与玉米单向杂交不亲和现象相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为ZmGa1P，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物杂交不亲和性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表序列1为ZmGa1P的氨基酸序列，包括379个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占180个，亲水氨基酸占191个，碱性氨基酸占37个，酸性氨基酸占42个，该蛋白质的分子量为41.38KD，等电点为5.37。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为ZmGa1P)，所述基因具体可为如下1)-4)中任一的DNA分子：

所述基因为如下1)-4)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)-2)中任一限定的DNA分子杂交且编码与玉米单向杂交不亲和现象相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码与玉米单向杂交不亲和现象相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

其中，序列2为ZmGa1P基因的cDNA序列，序列3为ZmGa1P基因在玉米基因组中的序列。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体为将ZmGa1P基因插入到pCAMBIA2300载体的多克隆位点(如Kpn I和BamH I)处后得到的重组质粒。更加具体的，为将pCAMBIA2300载体的酶切位点Kpn I和BamH I之间的小片段替换为序列表中序列4的所示DNA片段后得到的重组质粒(命名为pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P)。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)植物育种和/或制种；

(b)调控植物单向杂交不亲和性。

本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下：

在此，给Ga1-S/Ga1-S类型的玉米材料授粉能够结实，称为对Ga1亲和；给Ga1-S/Ga1-S类型的玉米材料授粉不能够结实，称为对Ga1不亲和。

培育一种转基因植物，使其对Ga1亲和，包括如下步骤：

(1)向受体植物中导入ZmGa1P蛋白的编码基因(该受体植物对Ga1不亲和)，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的对Ga1亲和的性状是由于所述受体植物表达有功能的所述ZmGa1P蛋白引起的；

(2)从步骤(1)所得转基因植物中得到对Ga1亲和的转基因植物；

在所述方法的步骤(1)中，所述编码基因可通过以上重组表达载体pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P导入所述受体植物；

在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单子叶植物如禾本科植物，具体如玉米。

在培育对Ga1亲和的转基因植物时，可将任意一种对Ga1不亲和的玉米材料作为所述受体植物，获得相应的对Ga1亲和的转基因玉米。

在本发明的一个实施例中，培育对Ga1亲和的转基因植物时采用的所述受体植物具体为玉米品种综31。

本发明采用图位克隆的策略，用玉米自交系SDGa25与玉米自交系J66和/或自交系B73组配BC₁F₁群体，将控制这一性状的基因定位到玉米四号染色体8.49Mb到10.27Mb之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为1.76Mb，共包括八个基因。其中基因号为Zm00001d048936的基因特异在Ga1-S类型材料SDGa25、US86、178、US89的花药中表达，将此基因命名为ZmGa1P。用转基因技术将ZmGa1P基因导入对Ga1不亲和的玉米材料中，可以使其具有对Ga1亲和的能力。

本发明的ZmGa1P基因在玉米中能够突破单向杂交不亲和障碍，即在对Ga1不亲和的玉米材料中表达，可以使其具有对Ga1亲和的能力。

本发明为玉米单向杂交不亲和性的研究提供了新的基因资源，其在玉米育种制种领域的应用中可发挥重要作用。

附图说明

图1为ZmGa1P基因的图位克隆图。

图2为Zm00001d048936基因在玉米自交系HP301中的组织特异性表达图。

图3为Zm00001d048936基因在不同类型玉米自交系花药中的表达图。其中A为荧光定量PCR结果，B为半定量PCR结果。

图4为ZmGa1P cDNA扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中左侧泳道代表DM2000marker，右侧泳道代表目的条带，大小为1185bp。

图5为T₀代转基因玉米PCR鉴定图。其中M为DM2000marker，1为阴性对照，2为转化质粒阳性对照，3-15为T₀代转基因植株，4、7、9、11和13为阳性植株，其他为阴性植株。

图6为转基因功能验证图。其中A为5个T₀代转基因阳性植株给SDGa25授粉结实情况图；B为T₀代转基因阴性植株给SDGa25授粉结实情况图；C为USP186自交结实图；D和E为T₁代转基因阳性植株分别给USP186和US86授粉结实情况图；F和G为T₂代转基因阳性植株分别给USP186和US86授粉结实情况图；H为A中结实籽粒PCR鉴定图，其中，上为转基因鉴定图，下为定位区间的背景来源鉴定图，1-21为授粉后结实的籽粒，22为阴性对照，23为转基因受体材料SDGa25，24为综31。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米自交系SDGa25、US86、USP186(基因型为Ga1-S/Ga1-S)和178、US89(基因型为Ga1-M/Ga1-M)为本实验室收集和保存。玉米基因组测序信息参考MaizeGDB数据库，该数据库链接如下：http：//www.maizegdb.org/。玉米自交系HP301(基因型为Ga1-S/Ga1-S)根、茎、雄穗、雌穗四个组织RNA-seq数据来源于NCBI库，链接分别如下：Zea mays ssp.maysL.Hp301 seedling root RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129743；；Zeamays ssp.mays L.Hp301 seedling shoot RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ sra/SRX129744；Zea mays ssp.mays L.Hp301 immature tassel RNA-Seq：https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129745；Zea mays ssp.mays L.Hp301 immature，unpollinated ear tip RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129742；

实施例1、玉米单向杂交不亲和基因ZmGa1P的图位克隆

一、遗传定位群体的构建

将Ga1-S/Ga1-S型自交系SDGa25与ga1/gal型自交系J66杂交，得到F₁再与J66回交，得到BC₁F₁分离群体。将分离群体与SDGa25相间种植，待盛花期时，将分离群体中每个植株的花粉授于一个SDGa25雌穗的花丝上，统计群体中结实和不结实的比例，经卡方检验为1∶1(表1)，根据孟德尔遗传定律，该性状由显性单基因控制，并将BC₁F₁群体做为遗传定位群体。

表1 BC₁F₁分离群体分离比的卡方检验

注：X_0.05 ²(1)＝3.84

二、ZmGa1P基因的定位

首先，以玉米自交系SDGa25、J66和B73的基因组DNA为模板，用玉米全基因组引物筛选在自交系SDGa25和J66或B73之间有多态性的引物。然后，从BC₁F₁群体中选取结实和不结实对应的授粉单株各10株，验证多态性引物是否与单向杂交不亲和性状连锁。筛选出连锁引物，用于对群体中12000个单株基因型的测定，结合雌穗结实表型筛选出基因型与表型不符的为交换单株，并根据不同引物筛选出的交换单株个数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将ZmGa1P基因定位于玉米四号染色体的引物标记SSRM5(7.82Mb)和IDPM26(10.47Mb)之间。在SSRM5和IDPM26之间继续开发多态性分子标记，并用于检测BC₁F₁群体的所有单株，最终将ZmGa1P基因定位在SSRM47(8.49Mb)和SNPM3(10.27Mb)之间，参考已公布的玉米自交系B73基因组测序结果，物理距离约为1.76Mb(图1)。其中，用于基因定位的分子标记引物序列如表2所示。

表2 用于基因定位的分子标记引物序列

三、ZmGa1P基因的克隆

参考玉米基因组测序信息，定位区间的1.76Mb范围内包含8个基因，分别是Zm00001d048931、Zm00001d048932、Zm00001d048936、Zm00001d048937、Zm00001d048939、Zm00001d048941、Zm00001d0489412、Zm00001d048943。利用NCBI数据库中玉米自交系HP301(Ga1-S/Ga1-S型)不同组织的RNA seq数据分析表明，只有Zm00001d048936基因在雄穗中特异表达(图2)。提取Ga1-S/Ga1-S型自交系SDGa25和US86、Ga1-M/Ga1-M型自交系178和US89以及ga1/ga1型自交系J66和B73的花药RNA，反转录成cDNA，以引物对F1/R1对Zm00001d048936基因进行荧光定量PCR和半定量PCR检测，以引物对F2/R2扩增GAPDH基因作为内参，结果表明Zm00001d048936基因在自交系SDGa25、US86、178、US89的花药中表达，在自交系J66和B73花药中不表达(图3)。因此推测候选基因Zm00001d048936即为目的基因ZmGa1P。以玉米自交系SDGa25的cDNA为模板，采用引物对F3/R3进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列2，序列2即为ZmGa1P基因的cDNA序列。以玉米自交系SDGa25的基因组DNA为模板，通过引物对F4/R4扩增得到序列3，序列3即为ZmGa1P基因在玉米基因组中的序列。序列2和序列3均编码序列表中序列1所示的ZmGa1P蛋白。

F1：5′-TGCGAGTGATGGGAACAAAG-3′；

R1：5′-TGGCAGATCCGAAGATGAAG-3′。

F2：5′-CTGGTTTCTACCGACTTCCTTG-3′；

R2：5′-CGGCATACACAAGCAGCAAC-3′。

F3：5′-ATGATGATGAGTAAACAAATGCTCG-3′；

R3：5′-TTATTCTTCAGCGGGTGGTAGG-3′。

F4：5′-GAGCTCGCTTCTATGGTCGCACC-3′；

R4：5′-CCAACAAGCTAAACTATCACAC-3′。

实施例2、玉米单向杂交不亲和基因ZmGa1P的功能验证

一、ubiquitin启动子驱动的过表达载体的构建

设计针对ZmGa1P基因的cDNA序列的特异引物。具体序列为：

P1-F：5′-gatcaattcgagctcggtaccATGATGATGAGTAAACAAATGCTCG-3′；

P1-R：5′-ctgcaggtcgactctagaggatccTTATTCTTCAGCGGGTGGTAGG-3′。

其中，小写字母所示为与载体连接所需要的同源重组臂，P1-F的大写字母为序列2所示的前25个碱基，P1-R的大写字母为序列2所示的后22个碱基的反向互补序列。以玉米自交系SDGa25的cDNA为模板，采用引物对P1-F/P1-R进行PCR扩增，扩增获得的PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带(图4)。进一步将目的条带胶回收测序，显示其序列如序列表中序列4所示。将序列4与经过Kpn I和BamH I酶切回收后的pCAMBIA2300载体连接，经酶切和测序鉴定，构建成为ubiquitin启动子驱动的pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P过表达载体。

重组pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P过表达载体的结构描述：将pCAMBIA2300载体的酶切位点Kpn I和BamH I之间的小片段替换为序列表中序列4所示DNA片段后得到的重组质粒。

二、玉米遗传转化实验

由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P过表达载体向玉米自交系综31的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。

三、转基因后代的功能验证

为鉴定ZmGa1P基因的功能，取阳性转基因植株的花粉给基因型为Ga1-S/Ga1-S的玉米材料授粉，若结实，则该基因为目的基因。其中，确定是否为阳性转基因植株的方法具体如下：将转基因后代群体中的单株提取基因组DNA，以此为模板，以P2-F/P2-R为引物，扩增获得大小1321bp的目的条带为转基因阳性，无此条带为转基因阴性。同时，以未转化的玉米自交系综31基因组DNA为模板进行扩增，做为阴性对照；以pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P质粒为模板进行扩增，做为阳性对照。

P2-F：5′-ACCTGAAGATGGCGGTTACAC-3′(位于pCAMBIA2300-ubi-ZmGa1P质粒Kpn I和BamH I之间的插入片段上，即序列2的第225-245bp位置)；

P2-R：5′-CTCAAGCTGCTCTAGCATTCG-3′(位于pCAMBIA2300载体上)。

通过遗传转化，共获得13株T₀代转基因植株。通过P2-F/P2-R引物对检测，其中5株为转基因阳性，8株为转基因阴性(图5)。取这5株转基因阳性植株的花粉分别给玉米自交系SDGa25的不同雌穗授粉，全部结实(图6A)，而转基因阴性T₀代植株给玉米自交系SDGa25授粉，完全不结实(图6B)。随机选取结实籽粒，提取基因组DNA，以引物对P2-F/P2-R和表2中引物对IDPM1进行PCR鉴定，结果表明，所选取的21个籽粒均能扩增出代表阳性转基因事件的大小为1321bp的目的条带(图6H上)，且在定位区间的基因型为来自杂交双亲的杂合条带(图6H下)，证明该结实籽粒为杂交结实，而非自交结实。

将上述5株T₀代转基因阳性植株自交获得5个T₁代转基因株系，经P2-F/P2-R引物对检测鉴定为转基因阳性的植株，给Ga1-S/Ga1-S型玉米自交系USP186(图6D)和US86(图6E)授粉结实饱满。T₁代转基因阳性植株自交获得的T₂代植株，经转基因鉴定为阳性后给玉米自交系USP186(图6F)和US86(图6G)授粉，均结实饱满。

以上证明，玉米ZmGa1P基因为与玉米单向杂交不亲和现象相关的基因。

综合以上各实施例的研究结果，可见：通过图位克隆和转基因功能验证，本发明克隆的ZmGa1P基因是与玉米单向杂交不亲和现象相关的基因，该基因编码的蛋白可以突破Ga1-S/Ga1-S基因型材料的杂交不亲和障碍，从而使其结实，可在玉米育种制种过程中得以利用。