JP5685228B2 - トウモロコシイベントdas−59122−7およびその検出のための方法 - Google Patents
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本発明の実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、本発明の実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するDNA構築物に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ植物DAS−59122−7に関し、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物DAS−59122−7のDNAの存在を検出するアッセイに関する。
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ(Zea mays)植物DAS−59122−7(トウモロコシ系統DAS−59122−7またはトウモロコシイベントDAS−59122−7とも呼ばれる)に関し、さらにトウモロコシ植物DAS−59122−7のDNA植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物DAS−59122−7およびその後代における導入遺伝子/隣接挿入領域の検出に関する。
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性の単子葉植物作物を作製および選択する方法に関する。より具体的には、植物細胞および植物中で発現されると昆虫に対する抵抗性を付与する、DNA構築物を提供する。本発明の1つの局面によれば、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能なDNA構築物が提供され、このDNA構築物は、植物細胞および植物中で発現されると、これらの植物細胞および植物に対して昆虫抵抗性を付与する。このDNA構築物は、PHI17662Aと称されるDNA分子から構成され、3つの導入遺伝子発現カセットを含む。第一の発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry34Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,127,180号、同第6,624,145号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン(Ubi−1)遺伝子のプロモーター、5’側非翻訳エキソン、および第1イントロンを含むDNA分子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689、ならびにChristensenおよびQuail(1996)Transgenic Res.5:213−218)を含む。DNA構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry35Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,083,499号、同第6,548,291号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするDNA分子(Hertigら(1991)Plant Mol.Biol.16:171−174)を含む。DNA構築物の第3の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーターを含むDNA分子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59を参照)に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子をコードするDNA分子(Wohlleben W.ら(1988)Gene
70:25−37)に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターのDNA分子(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を含む。このDNA構築物を含む植物も提供される。
5’−GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC−3’(配列番号1);
5’−CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG−3’(配列番号2);
5’−AATTGAGCGCTTGCACGTTT−3’(配列番号3);
5’−AACAACAAGACCGGCCACACCCTC−3’(配列番号4);
5’−GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA−3’(配列番号5);
5’−TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA−3’(配列番号6);
5’−GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA−3’(配列番号7);
5’−AACCCTTAGTATGTATTTGTATT−3’(配列番号8);
5’−CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG−3’(配列番号9);5’−TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG−3’(配列番号10);5’−GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT−3’(配列番号11);
5’−GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC−3’(配列番号12);5’−CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA−3’(配列番号13);5’−CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC−3’(配列番号14);
5’−GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA−3’(配列番号15);5’−GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG−3’(配列番号16);5’−CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG−3’(配列番号17);5’−AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC−3’(配列番号18)
5’−CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG−3’(配列番号36);
5’−GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG−3’(配列番号37)
およびこれらの相補体からなる群より選択され得る。これらの分子を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の実施形態である。さらに、これらのプライマー配列を利用する、DAS−59122−7イベントの同定のためのキットが提供される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
単離されたDNA分子であって、以下:
a)配列番号19に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号20に示されるヌクレオチド配列;
c)配列番号23に示されるヌクレオチド配列;
d)配列番号21に示されるヌクレオチド配列;および
e)配列番号22に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
(項目2)
DAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットであって、該キットが、配列番号19内または配列番号20内の配列を認識する、少なくとも1つの第一のプライマーを含む、キット。
(項目3)
項目2に記載のキットであって、以下:
a)配列番号24の配列;および
b)配列番号20の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、少なくとも1つの第二のプライマーをさらに含む、キット。
(項目4)
上記第一のプライマーが、以下:
a)配列番号19の配列;および
b)配列番号20の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、項目2に記載のキット。
(項目5)
上記少なくとも第一および第二のプライマーがそれぞれ、以下:
a)配列番号18および配列番号1の配列;
b)配列番号10および配列番号9の配列;
c)配列番号2および配列番号17の配列;
d)配列番号8および配列番号17の配列;ならびに
e)配列番号36および配列番号37の配列
からなる群より選択される1対の配列を含む、項目3に記載のキット。
(項目6)
トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその後代の結合部DNAに特異的なDNA検出キットであって、以下:
a)配列番号21に示されるヌクレオチド配列;および
b)配列番号22に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択される配列に相同または相補的な、DNA検出方法において機能するために十分な長さの連続するDNAポリヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を含む、DNA検出キット。
(項目7)
生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットであって、該キットが、以下:
a)配列番号19および配列番号24の配列;ならびに
b)配列番号20および配列番号24の配列
からなる群より選択される配列にハイブリダイズし、該配列と連続する配列を含む、特異的プローブを含む、キット。
(項目8)
トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその後代に特異的なDNAプライマーまたはプローブとして機能する、配列番号21または配列番号22に相同または相補的な十分な長さの連続するヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を含む、DNA検出キット。
(項目9)
第一、第二、および第三の発現カセットを含むDNA構築物であって、
該第一の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(a)トウモロコシユビキチンプロモーター;
(b)トウモロコシユビキチン遺伝子の5’側非翻訳エキソン;
(c)トウモロコシユビキチン第1イントロン;
(d)Cry34Ab1をコードするDNA分子;および
(e)PinII転写ターミネーター
を含み;
該第二の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(i)コムギペルオキシダーゼプロモーター;
(ii)Cry35Ab1をコードするDNA分子;および
(iii)PinII転写ターミネーター
を含み;そして
該第三の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(1)CaMV 35Sプロモーター;
(2)patをコードするDNA分子;および
(3)(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーター
を含む、DNA構築物。
(項目10)
項目9に記載のDNA構築物を含む植物。
(項目11)
上記植物が、トウモロコシ植物である、項目10に記載の植物。
(項目12)
生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するための方法であって、配列番号19または配列番号20内の配列を特異的に認識するプローブまたは第一のプライマーを用いて、DAS−59122−7特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
(項目13)
少なくとも2つのプライマーであって、上記第一のプライマーが、配列番号19または配列番号20内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号20または配列番号24内の配列を認識する、プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、上記生物学的サンプル中に存在する核酸からDNAフラグメントを増幅する工程をさらに包含する、項目12に記載の方法。
(項目14)
上記第一のプライマーが、配列番号19内の配列を認識し、そして上記第二のプライマーが、配列番号24内の配列を認識する、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記第一のプライマーが、配列番号20内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号20内の配列を認識する、項目13に記載の方法。
(項目16)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号18および配列番号1の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号10および配列番号9の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目18)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号2および配列番号17の配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目19)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号8および配列番号17の配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号36および配列番号37の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目21)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約555bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目16に記載の方法。
(項目22)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約313bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目17に記載の方法。
(項目23)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約547bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目18に記載の方法。
(項目24)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約754bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目19に記載の方法。
(項目25)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約104bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目20に記載の方法。
(項目26)
生物学的サンプル中のトウモロコシイベントDAS−59122−7またはその後代の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)以下:
i)配列番号18および配列番号1の配列;
ii)配列番号10および配列番号9の配列;
iii)配列番号2および配列番号17の配列;ならびに
iv)配列番号8および配列番号17の配列
からなる群より選択される、1対のDNAプライマー分子を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を行って、DNAアンプリコン分子を生成する工程;ならびに
(e)該DNA増幅反応における該DNAアンプリコン分子の検出が、トウモロコシイベントDAS−59122−7の存在を示す、該DNAアンプリコン分子を検出する工程を包含する、方法。
(項目27)
項目26に記載の方法によって生成されるアンプリコンのいずれか1つを含む、単離されたDNA分子。
(項目28)
サンプル中のDAS−59122−7イベントに対応するDNAの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)トウモロコシDNAを含む該サンプルと、ポリヌクレオチドプローブであって、該ポリヌクレオチドプローブは、トウモロコシイベントDAS−59122−7由来のDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、非DAS−59122−7トウモロコシ植物DNAとは該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに
(c)該DNAへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ハイブリダイゼーションの検出が、DAS−59122−7イベントの存在を示す、工程
を包含する、方法。
(項目29)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、単離されたDNAヌクレオチドプライマー配列。
(項目30)
配列番号1、2、8、9、10、17および18からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、項目29に記載の単離されたDNAヌクレオチドプライマー配列。
(項目31)
第一のDNA分子および第二のDNA分子を含む、1対のDNA分子であって、該DNA分子が、DAS−59122−7トウモロコシ植物またはその後代から抽出されるDNAに特徴的なDNAプライマーまたはプローブとして機能するために、以下:
a)配列番号21に示される配列またはその相補体;および
b)配列番号22に示される配列またはその相補体
からなる群より選択される配列の、十分な長さの連続するヌクレオチドのDNA分子。
(項目32)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される配列ならびにその相補体を含む結合配列を含む、単離されたDNA分子。
(項目33)
種子サンプル中の配列番号19もしくは配列番号20内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、DAS−59122−7特異的領域の検出を包含する、種子純度を確認する方法。
(項目34)
イベントDAS−59122−7の存在について種子をスクリーニングする方法であって、種子ロットのサンプル中の配列番号19または配列番号20内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、DAS−59122−7特異的領域の検出を包含する、方法。
(項目35)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するDNAが、植物ゲノムの一部を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部。
(項目36)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するDNAが、植物ゲノムの一部を形成する、項目35に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の子孫植物。
(項目37)
項目35または36に記載の植物の種子。
(項目38)
項目35または36に記載の植物と交配させる工程、ならびに、配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体について分析することにより後代を選択する工程を包含する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法。
(項目39)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離されたDNA配列。
(項目40)
各々が少なくとも10個のヌクレオチドを含み、かつ、DNA増幅手順において一緒に用いられた場合にイベントDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成する、1対の単離されたDNA配列。
(項目41)
各々の配列が、以下:
a)配列番号21の配列;および
b)配列番号22の配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列の中から選択される、項目40に記載の1対の単離されたDNA配列。
(項目42)
トウモロコシ組織中のDAS−59122−7イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)プライマー対の各々が、配列番号21または配列番号22由来の少なくとも10個のヌクレオチドを含み、該プライマー対の各メンバーが、上記DAS−59122−7イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、プライマー対を選択する工程;
(b)該トウモロコシ組織のサンプルを該プライマー対と接触させる工程;
(c)DNA増幅を行い、そしてアンプリコンについて分析する工程
を包含する、方法。
(項目43)
上記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37またはその相補体からなる群より選択される、項目42に記載の方法。
(項目44)
トウモロコシ組織中のDAS−59122−7イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該トウモロコシ組織のサンプルを、配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される1つ以上のDNA配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに
(c)該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程
を包含する、方法。
(項目45)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される1つ以上のDNA配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブを含む、DNA検出キット。
(項目46)
プライマー対の各々が、配列番号21および配列番号22の中から少なくとも10個のヌクレオチドを含む、プライマー対を含むDNA検出キットであって、該プライマー対の各々が、上記DAS−59122−7イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、DNA検出キット。
(項目47)
上記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37ならびにその相補体からなる群より選択される、項目46に記載のDNA検出キット。
(項目48)
配列番号23内のDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキット。
(項目49)
配列番号23内のDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のDAS−59122−7を同定するための方法。
以下の定義および方法は、本発明をよりよく規定し、かつ、本発明の実施において当業者を導くために提供される。他に断らない限り、用語は、関連分野の当業者によって慣例的用法に従って理解されるべきである。分子生物学の共通語の定義は、Riegerら,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,第5版,Springer−Verlag;New York,1991;およびLewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994にも見出され得る。米国特許法施行規則1.822に示されるようなDNA塩基に関する命名法が用いられる。
PHI17662Aと称される、約7.4KbのDNA分子(配列番号24)は、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry34Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,127,180号、同第6,624,145号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン(Ubi−1)遺伝子のプロモーター、5’側非翻訳エキソン、および第1イントロンを含むDNA分子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689、ならびにChristensenおよびQuail(1996)Transgenic Res.5:213−218)を含む、第一の導入遺伝子発現カセットを含む。DNA構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry35Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,083,499号、同第6,548,291号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするDNA分子(Hertigら(1991)Plant Mol.Biol.16:171−174)を含む。DNA構築物の第3の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーターを含むDNA分子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59を参照)に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子をコードするDNA分子(Wohlleben W.ら(1988)Gene 70:25−37)に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターのDNA分子(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を含み、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いた。
イベントDAS−59122−7からの種子を評価した。T1S2種子は、Hi−IIバックグラウンドへの形質転換の後、近交系PH09Bとの交配および2回の自家交配を行ったことを表す。全ての種子を、Pioneer Hi−Bred(Johnston,IA)から得た。主要な特徴付けは、側方流動デバイスを用いた除草剤の葉面塗布およびCry34Abl発現による、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)活性の確認によって、本研究の間に植物葉組織について行った。
1グラム量の葉サンプルを液体窒素下で粉砕し、ゲノムDNAを、DNeasy(登録商標)Plant Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いるか、または標準尿素抽出緩衝液手順を用いて単離した。抽出後にDNAを、DNA品質を決定するためにアガロースゲル上で可視化し、Pico Green(登録商標)試薬(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)および分光蛍光分析を用いて定量した。
T−DNA挿入および隣接境界領域を、図2および3に図示するように、PCRに基づく方法を用いてB.t.Cry34/35Ab1イベントDAS59122−7からクローン化した。具体的には、イベントDAS−59122−7中の挿入物の5’および3’末端に接する配列を、2つのゲノムウォーキング技術を用いて得た。第一のウォーキング方法は、本質的には、Universal Genome Walker Kit(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)について記載されるような方法であり、そして第二の方法は、Stover(2001年、U.C.Irvine(私信))によって記載されるように改変された、Devonら(1995)Nucleic Acids Research 23(9):1644−1645に概説されたsplinkeretteプロトコルに従って行った。
DNAイベント特異的プライマー対を用いて、DAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成した。これらのイベントプライマー対としては、配列番号18および配列番号1;配列番号2および配列番号17;配列番号10および配列番号9;ならびに配列番号8および配列番号17;ならびに配列番号36および配列番号37が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプライマー対に加えて、DNA増幅反応に用いた場合にDAS−59122−7に特徴的なDNAアンプリコンを生成する、配列番号21および配列番号22に由来する任意のプライマー対も、本発明の実施形態である。DNAプライマーまたはその相補体を用いてDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンDNA分子を生成する、これらの方法の任意の改変は、当該分野の通常の技術範囲内である。さらに、内在性トウモロコシ遺伝子の増幅のためのIVR1(O197)/IVR2(O198)(配列番号39/配列番号40)を含む、コントロールプライマー対は、反応条件についての内部標準として含まれる。
Claims (28)
- イベントDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットであって、該キットが、イベントDAS−59122−7特異的領域を検出し得るプライマー対を含み、該プライマー対は、第一および第二のプライマーを含み、ここで、該第一および第二のプライマーは、少なくとも18ヌクレオチドであり、そして、該第一および第二のプライマーは、以下:
a)配列番号19に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第一のプライマー、および、配列番号20に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第二のプライマー;
b)配列番号19に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第一のプライマー、および、配列番号24に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第二のプライマー;ならびに、
c)配列番号20に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第一のプライマー、および、配列番号24に示されるヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子にアニーリングし得る第二のプライマー;
からなる群から選択され、
ここで、該イベントDAS−59122−7特異的領域は、イベントDAS−59122−7の異種挿入DNAの一部と連続する5’または3’の隣接領域内の領域であり、そして、該5’隣接領域は配列番号19であり、該3’隣接領域は配列番号20であり、そして、該異種挿入DNAが配列番号24である、キット。 - 前記第一および第二のプライマーがそれぞれ、以下:
a)配列番号18および配列番号1の配列;
b)配列番号10および配列番号9の配列;
c)配列番号2および配列番号17の配列;
d)配列番号8および配列番号17の配列;ならびに
e)配列番号36および配列番号37の配列
からなる群より選択される1対の配列を含む、請求項1に記載のキット。 - 生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するための方法であって、該方法は、少なくとも2つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該生物学的サンプル中の核酸からDNAフラグメントを増幅することによって、イベントDAS−59122−7特異的領域を検出する工程を包含し、該少なくとも2つのプライマーが、配列番号19と配列番号24内、配列番号20と配列番号24内、または配列番号19と配列番号20内の配列を認識し、ここで、該2つのプライマーの各々は、少なくとも18ヌクレオチドであり、そして、該イベントDAS−59122−7特異的領域は、イベントDAS−59122−7の異種挿入DNAの一部と連続する5’または3’の隣接領域内の領域であり、そして、該5’隣接領域は配列番号19であり、該3’隣接領域は配列番号20であり、そして、該異種挿入DNAが配列番号24である、方法。
- 前記第一のプライマーが、配列番号19内の配列を認識し、そして前記第二のプライマーが、配列番号24内の配列を認識する、請求項3に記載の方法。
- 前記第一のプライマーが、配列番号20内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号24内の配列を認識する、請求項3に記載の方法。
- 前記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号18および配列番号1の配列を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号10および配列番号9の配列を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号2および配列番号17の配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号8および配列番号17の配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号36および配列番号37の配列を含む、請求項4に記載の方法。
- DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約555bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項6に記載の方法。
- DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約313bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項7に記載の方法。
- DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約547bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項8に記載の方法。
- DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約754bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項9に記載の方法。
- DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約104bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項10に記載の方法。
- 生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7またはその後代の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)以下:
i)配列番号18および配列番号1の配列;
ii)配列番号10および配列番号9の配列;
iii)配列番号2および配列番号17の配列;ならびに
iv)配列番号8および配列番号17の配列
からなる群より選択される、1対のDNAプライマー分子を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を行って、DNAアンプリコン分子を生成する工程;ならびに
(e)該DNA増幅反応における該DNAアンプリコン分子の検出が、イベントDAS−59122−7の存在を示す、該DNAアンプリコン分子を検出する工程を包含する、方法。 - 請求項16に記載の方法によって生成されるアンプリコンのいずれか1つを含む、イベントDAS−59122−7を検出するための単離されたDNA分子。
- 第一のDNA分子および第二のDNA分子を含む、1対のDNA分子であって、該DNA分子が、イベントDAS−59122−7形質転換トウモロコシ植物またはその後代から抽出されるDNAに特徴的なDNAプライマーまたはプローブとして機能するために、以下:
a)配列番号21に示される配列またはその相補体;および
b)配列番号22に示される配列またはその相補体
からなる群より選択される配列の連続ヌクレオチドを含み、ここで、該DNAプライマーのうち一方が、配列番号21の5’隣接領域の一部または配列番号22の3’隣接領域の一部の連続ヌクレオチドであり、他方のDNAプライマーが、配列番号21の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドまたは配列番号22の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドであり、そして、該プローブは、配列番号21および配列番号22の異種DNAの一部と連続する5’または3’の隣接領域の一部を含み、ここで、該DNAプライマーまたはプローブの各々は、少なくとも18ヌクレオチドである、1対のDNA分子。 - 配列番号32、33、34、35および38ならびにその相補体からなる群より選択される配列を含む、イベントDAS−59122−7を検出するための、単離されたDNA分子。
- 特異的プライマーまたはプローブを用いた、イベントDAS−59122−7特異的領域の検出を包含する、種子純度を確認する方法であって、ここで、該特異的プライマーまたはプローブは、種子サンプル中において、配列番号19および配列番号24内、または、配列番号20および配列番号24内の配列を認識し、該イベントDAS−59122−7特異的領域は、イベントDAS−59122−7の異種挿入DNAの一部と連続する5’または3’の隣接領域内の領域であり、そして、該5’隣接領域は配列番号19であり、該3’隣接領域は配列番号20であり、そして、該異種挿入DNAが配列番号24であって、ここで、該プライマーまたはプローブの各々は、少なくとも18ヌクレオチドである、方法。
- イベントDAS−59122−7の存在について種子をスクリーニングする方法であって、該方法は、特異的プライマーまたはプローブを用いてイベントDAS−59122−7特異的領域を検出する工程を包含し、ここで、種子ロットのサンプル中において、該特異的プライマーまたはプローブは、配列番号19および配列番号24内、または、配列番号20および配列番号24内の配列を認識し、ここで、該イベントDAS−59122−7特異的領域は、イベントDAS−59122−7の異種挿入DNAの一部と連続する5’または3’の隣接領域内の領域であり、そして、該5’隣接領域は配列番号19であり、該3’隣接領域は配列番号20であり、そして、該異種挿入DNAが配列番号24であって、ここで、該プライマーまたはプローブの各々は、少なくとも18ヌクレオチドである、方法。
- 各々が少なくとも18個のヌクレオチドを含み、かつ、DNA増幅手順において一緒に用いられた場合にイベントDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成する、1対の単離されたDNAプライマーであって、各プライマーは、以下:
a)配列番号21の配列;および
b)配列番号22の配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列の中から選択され、
ここで、該プライマーのうちの一方は、配列番号21の5’隣接領域の一部または配列番号22の3’隣接領域の一部の連続ヌクレオチドであり、もう一方のプライマーは、配列番号21の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドまたは配列番号22の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドである、1対の単離されたDNAプライマー。 - トウモロコシ組織中のイベントDAS−59122−7挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)プライマー対の各々が、配列番号21または配列番号22由来の少なくとも18個のヌクレオチドを含む、プライマー対を選択する工程;
(b)該トウモロコシ組織のサンプルを該プライマー対と接触させる工程;
(c)DNA増幅を行い、そしてアンプリコンについて分析する工程
を包含し、
ここで、該プライマーのうちの一方は、配列番号21の5’隣接領域の一部または配列番号22の3’隣接領域の一部の連続ヌクレオチドであり、もう一方のプライマーは、配列番号21の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドまたは配列番号22の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドであり、
ここで、該イベントDAS−59122−7特異的配列は、配列番号21または配列番号22の異種挿入DNAの一部と連続する隣接領域の一部を含む、方法。 - 前記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37、または、その相補体からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- トウモロコシ組織中のイベントDAS−59122−7挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該トウモロコシ組織のサンプルを、配列番号32、33、34、35および38ならびにその相補体からなる群より選択される1つ以上のDNA配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、ここで、該ポリヌクレオチドプローブは、配列番号19および配列番号24の連続配列を含む配列を認識するか、または、配列番号20および配列番号24の連続配列を含む配列を認識する、工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに
(c)該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程
を包含し、ここで、該ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも18ヌクレオチドであり、そして、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS中の37℃であり、60〜65℃における0.1×SSC中の洗浄である、方法。 - 配列番号32、33、34、35および38ならびにその相補体からなる群より選択される1つ以上のDNA配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブを含む、DNA検出キットであって、ここで、該ポリヌクレオチドプローブは、配列番号19および配列番号24の連続配列を含む配列を認識するか、または、配列番号20および配列番号24の連続配列を含む配列を認識し、ここで、該ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも18ヌクレオチドであり、そして、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS中の37℃であり、60〜65℃における0.1×SSC中の洗浄である、キット。
- プライマー対の各々が、配列番号21および配列番号22の中から少なくとも18個のヌクレオチドを含む、プライマー対を含むDNA検出キットであって、ここで、該配列は、配列番号21または配列番号22の異種挿入DNAの一部と連続する隣接領域の一部を含み、ここで、該プライマーのうちの一一方は、配列番号21の5’隣接領域の一部または配列番号22の3’隣接領域の一部の連続ヌクレオチドであり、もう一方のプライマーは、配列番号21の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドまたは配列番号22の異種挿入DNAの一部の連続ヌクレオチドである、キット。
- 前記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37ならびにその相補体からなる群より選択される、請求項27に記載のDNA検出キット。
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