TWI414236B - 玉米品件ｄａｓ-５９１２２-７及測定該品件的方法 - Google Patents

玉米品件ｄａｓ-５９１２２-７及測定該品件的方法 Download PDF

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Description

玉米品件DAS-59122-7及測定該品件的方法 相關申請案之交互參照
本案請求美國臨時申請案第60/614,225號，申請日2004年9月29日之優先權，該案全文內容以引用方式併入此處。
發明領域
本發明係有關植物分子生物學領域，特別，本發明係有關對植物提供昆蟲抗性的DNA構成體。特別，本發明係有關昆蟲抗性的玉米植株DAS-59122-7，以及檢測於樣本及其組成物中是否存在有玉米植株DAS-59122-7 DNA的檢定分析。
 發明背景
本發明之具體例係有關昆蟲抗性的玉米(Zea mays)植株DAS-59122-7，也稱作為玉米種系DAS-59122-7或玉米品件DAS-59122-7，以及關於玉米植株DAS-59122-7的DNA植株表現構成體，以及於玉米植株DAS-59122-7及其子代的轉殖基因區/側出插入區之檢測。
玉米是一項重要農作物，於地球上許多區域是主要食物來源。儘管已經使用保護措施，諸如施用化學品農藥，但玉米受害蟲之害乃全球玉米收成損失的主要因素。有鑑於此，利用基因工程方法將昆蟲抗性結合至農作物例如玉米，意圖控制昆蟲的損害，且減少傳統化學農藥的需求。用來產生轉殖基因昆蟲抗性農作物的一組基因為得自蘇桿 菌(Bacillus thuringiensis(B.t.))之δ-內毒素。δ-內毒素已經成功地表現於諸如棉花、馬鈴薯、稻米、向日葵及玉米等多種農作物，已經證實可對害蟲提供絕佳控制(Perlak,F.J等人(1990)生物/技術8,939-943；Perlak,F.J等人(1993)植物分子生物學22：313-321；Fujimoto H.等人(1993)生物/技術11：1151-1155；Tu等人(2000)自然生物技術18：1101-1104；PCT公告案編號WO 01/13731；及Bing JW等人(2000)Cry34Ab1轉殖基因玉米之功效，第14屆兩年一度國際植物對昆蟲抗性工作坊，克羅拉多州克林堡)。
外來基因於植物的表現，已知受到該外來基因於植物基因體所在位置的影響，可能原因為染色質結構(例如異染色質)、或轉錄調節元體(促進基因)與接合位置的接近程度(Weising等人，遺傳綜論年報22：421-477，1988)。同時，於基因體不同位置存在有轉殖基因，將以不同方式影響植物的整體表現型。因此理由故，經常需要篩選大量品件，來識別具有該感興趣的所導入基因最佳表現特徵的品件。舉例言之，於植物及其它有機體觀察到多種品件對導入基因的表現程度有寬廣變化。表現的空間樣式或表現的時間樣式也有差異，舉例言之，轉殖基因於不同植物組織的相對表現差異可能非與由存在於被導入的基因構成體之轉錄調節元體所預期的樣式相應。因此理由故，常見製造數百種至數千種不同的品件，從該等品件中，篩檢出具有預定轉殖基因表現程度和表現樣式具有商用價值的單一品件。具有預定轉殖基因表現程度或樣式的品件，可用於使用習知 育種方法，藉有性雜交，將該轉殖基因導入其它遺傳背景。此種有性雜交的子代維持原先轉形株的轉殖基因表現特徵。此項策略用來確保於多種變種之可靠基因表現，其極為適合於局部生長條件。
較佳可檢測是否存在有特定品件，來判定雜交子代是否含有感興趣的轉殖基因。此外，一種檢測特定品件之方法將有助於符合法令規定，法令規定要求衍生自重組農作物的食品須在上市前經過核准且加以標示，例如用來環保監視，用來田間監視農作物的特徵，或用來監視衍生自該農作物生成的產品，以及用來確保受法規規範或契約規範雙方是否符合條款。
可藉技藝界已知之任一種核酸檢測方法來檢測是否存在有轉殖基因，檢測方法包括但非限於聚合酶連鎖反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交。此等檢測方法的目光焦點通常係集中於常用的遺傳元體，例如啟動基因、終結基因、標記基因等，原因在於對多種DNA構成體而言，編碼區為可互換。結果，除非毗鄰於所插入的異種基因DNA之側出DNA的DNA序列為已知，否則此種方法無法用於甄別不同的品件，特別，為使用相同的DNA構成體或極為類似的DNA構成體製造的品件。例如品件特異性PCR檢定分析述於美國專利第6,395,485號來檢測菁英品件GAT-ZM1。如此，希望能有簡單且有鑑別力的方法來識別品件DAS-59122-7。
 發明概要
本發明之具體例係有關製造與選擇昆蟲抗性的單子葉農作物植株之方法。特別，提供一種DNA構成體，其當於植物細胞及植物表現時可提供昆蟲抗性。根據本發明之一具體例，提供一種DNA構成體，其可被導入宿主細胞內部，且於宿主細胞複製，該DNA構成體當於植物細胞及植物表現時，可對植物細胞及植物提供昆蟲抗性。DNA構成體係由定名為PHI17662A的DNA分子組成，包括三個轉殖基因表現卡匣。第一表現卡匣包含一個DNA分子，其包括啟動基因、5’非轉譯表現序列、及玉米泛素(Ubi-1)基因之插入序列(Christensen等人(1992)植物分子生物學18：675-689；及Christensen及Quail(1996)轉殖基因研究5：213-218)操作式連結至編碼B.t. δ-內毒素、識別為Cry34Ab1的DNA分子(美國專利第6,127,180、6,624,145及6,340,593號)，其係操作式連結至從馬鈴薯分離的包含Pin II轉錄終結子的DNA分子(Gyheung An等人(1989)植物細胞1；115-122)。該DNA構成體的第二表現卡匣包含編碼小麥過氧化酶啟動基因的DNA分子(Hertig等人(1991)植物分子生物學16；171-174)操作式連結至編碼B.t. δ-內毒素、識別為Cry35Ab1的DNA分子(美國專利第6,083,499、6,548,291及6,340,593號)，其係操作式連結至從馬鈴薯分離的包含Pin II轉錄終結子的DNA分子(Gyheung An等人(1989)植物細胞1；115-122)。該DNA構成體之第三轉殖基因表現卡匣包含花椰菜嵌紋病毒(CaMV)的 DNA分子35S啟動基因(Odell J.T.等人(1985)自然313：810-812；Mitsuhara等人(1996)植物細胞生理學37：49-59)操作式連結至編碼膦赤素(phosphinothricin)乙醯基轉移酶(PAT)基因的DNA分子(Wohlleben W.等人(1988)基因70：25-37)，操作式連結至包含得自(CaMV)35S之3’轉錄終結基因的DNA分子(參考Mitsuhara等人(1996)植物細胞生理學37：49-59)。也提供含有該DNA構成體之植物。
根據本發明之另一具體例，提供識別定名為DAS-59122-7之新穎玉米植株之組成物及方法，該方法係基於可特別辨識DAS-59122-7之5’及/或3’側出序列之引子或探針。提供DNA分子，其包含當用於PCR反應時將產生轉殖基因品件DAS-59122-7之獨特染色體擴增子的引子序列。此等分子可選自於由下列組成之群組：5’-GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC-3’(SEQ ID NO：1)；5’-CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG-3’(SEQ ID NO：2)；5’-AATTGAGCGCTTGCACGTTT-3’(SEQ ID NO：3)；5’-AACAACAAGACCGGCCACACCCTC-3’(SEQ ID NO：4)；5’-GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA-3’(SEQ ID NO：5)；5’-TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA-3’(SEQ ID NO：6)；5’-GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA-3’(SEQ ID NO：7)；5’-AACCCTTAGTATGTATTTGTATT-3’(SEQ ID NO：8)；5’-CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG-3’(SEQ ID NO：9)；5’-TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG-3’(SEQ ID NO：10)；5’-GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT-3’(SEQ ID NO：11)； 5’-GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC-3’(SEQ ID NO：12)；5’-CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA-3’(SEQ ID NO：13)；5’-CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC-3’(SEQ ID NO：14)；5’-GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA-3’(SEQ ID NO：15)；5’-GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG-3’(SEQ ID NO：16)；5’-CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG-3’(SEQ ID NO：17)；5’-AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC-3’(SEQ ID NO：18)5’-CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG-3’(SEQ ID NO：36)；5’-GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG-3’(SEQ ID NO：37)及其互補序列。包含此等分子的玉米植株和種子構成本發明之一具體例。此外，提供利用此等引子序列來識別DAS-59122-7品件之套件組。
本發明之又一具體例係有關此處所述DAS-59122-7之特定側出序列，其可用來發展出於生物樣本中所含DAS-59122-7的特定識別方法。特別，本發明係有關DAS-59122-7的5’及/或3’側出區、SEQ ID NO：19的5’側出區、和SEQ ID NO：20的3’側出區，其可用於發展特定引子及探針。本發明之又一具體例係有關基於使用此等特定引子及探針識別於生物樣本是否存在有DAS-59122-7之方法。
根據本發明之另一具體例，提供之檢測於樣本內是否存在有相對應玉米品件DAS-59122-7的DNA之方法。該種方法包含：(a)讓包含DNA之樣本與DNA引子集合接觸，該引子集合當用於與萃取自玉米品件DAS-59122-7之基因體DNA進行核酸擴大反應時，可產生一種對玉米品件 DAS-59122-7具有診斷作用之染色體擴增子；(b)進行核酸擴大反應，因此產生染色體擴增子；以及(c)檢測該擴增子。
包含新穎轉殖基因/側出插入區SEQ ID NO：21的5’側出加1000內部和SEQ ID NO：22的3’側出加1000內部的DNA分子，且為SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之同質或互補的DNA分子構成本發明之一具體例。
包含新穎轉殖基因/側出插入區SEQ ID NO：21的DNA序列屬於本發明之一具體例。包含足夠長度轉殖基因插入序列的多核苷酸、和包含足夠長度得自玉米植株DAS-59122-7之玉米基因體及/或側出序列的多核苷酸SEQ ID NO：21的DNA序列也含括於本發明，其可用作為引子序列用來製造可診斷玉米植株DAS-59122-7的擴增子產物。
此外，提供包含新穎轉殖基因/側出插入區SEQ ID NO：22的DNA序列。包含足夠長度轉殖基因插入序列的多核苷酸以及足夠長度得自玉米植株DAS-59122-7之玉米基因體及/或側出序列多核苷酸SEQ ID NO：22的DNA序列也含括於本發明，其可用作為引子序列用來製造可診斷玉米植株DAS-59122-7的擴增子產物。
根據本發明之另一具體例，包含至少11個或11個以上SEQ ID NO：21或其互補序列的DNA序列轉殖基因部分的核苷酸，以及包含類似長度之SEQ ID NO：21或其互補序列的5’側出玉米DNA序列之該DNA序列可用作為DNA擴大方法的DNA引子。使用此等引子製造的擴增子可診斷玉米品件DAS-59122-7。因此本發明也包括藉SEQ ID NO：21同 質或互補DNA引子所製造的擴增子。
根據本發明之另一具體例，包含至少11個或11個以上SEQ ID NO：22或其互補序列的DNA序列轉殖基因部分的核苷酸，以及類似長度之SEQ ID NO：22或其互補序列的3’側出玉米DNA序列之該DNA序列可用作為DNA擴大方法的DNA引子。使用此等引子製造的擴增子可診斷玉米品件DAS-59122-7。因此本發明也包括藉SEQ ID NO：22同質或互補DNA引子所製造的擴增子。
特別，一對DNA分子包含DNA引子集合，其中該DNA分子被識別為SEQ ID NO：18或其互補序列及SEQ ID NO：1或其互補序列；SEQ ID NO：2或其互補序列及SEQ ID NO：17或其互補序列；SEQ ID NO：10或其互補序列及SEQ ID NO：9或其互補序列；SEQ ID NO：8或其互補序列及SEQ ID NO：17或其互補序列；以及SEQ ID NO：36或其互補序列及SEQ ID NO：37或其互補序列構成本發明之具體例。
本發明之進一步具體例包括包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：1 DNA分子的擴增子；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：17 DNA分子的擴增子；SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：9 DNA分子的擴增子；SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：17 DNA分子的擴增子；以及SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37 DNA分子的擴增子。
本發明之又一具體例包括可用於檢測或決定品件DAS-59122-7的特徵的下列引子：SEQ ID NO：11或其互補序列；SEQ ID NO：5或其互補序列；SEQ ID NO：4或其互 補序列；SEQ ID NO：7或其互補序列；SEQ ID NO：6或其互補序列；SEQ ID NO：3或其互補序列；SEQ ID NO：18或其互補序列；SEQ ID NO：14或其互補序列；SEQ ID NO：13或其互補序列；SEQ ID NO：15或其互補序列；SEQ ID NO：17或其互補序列；SEQ ID NO：16或其互補序列；以及SEQ ID NO：12或其互補序列。額外具體例也包括經由將前文列舉的任何引子配對所製造的擴增子。
根據本發明之另一具體例，檢測於樣本是否存在有相對應於DAS-59122-7品件之一種DNA分子之方法，該方法包含：(a)讓包含萃取自玉米植株的DNA之樣本與DNA探針接觸，該探針分子於最嚴苛雜交條件下，可與萃取自玉米品件DAS-59122-7的DNA雜交，但於嚴苛雜交條件下不會與對照玉米植株DNA雜交；(b)將該樣本之探針置於嚴苛雜交條件下；以及(c)檢測探針雜交至DNA。特別，一種檢測樣本中是否存在有相對應於DAS-59122-7品件的DNA分子之方法，該方法包含(a)讓包含萃取自玉米植株的DNA之樣本與DNA探針分子接觸，該DNA探針分子係由對該品件為獨特的序列(例如接合序列)組成，其中該DNA分子於最嚴苛雜交條件下，可與萃取自玉米品件DAS-59122-7的DNA雜交，但於嚴苛雜交條件下不會與對照玉米植株DNA雜交；(b)將該樣本之探針置於嚴苛雜交條件下；以及(c)檢測探針雜交至DNA。
此外提供可於生物試樣識別品件DAS-59122-7之套件組及方法，其可檢測出於SEQ ID NO：23內部之 DAS-59122-7特定區。
提供DNA分子其包含至少一個DAS-59122-7接合序列，該接合序列係選自於由SEQ ID NO：32、33、34、和35及其互補序列組成之群組；其中接合序列跨據介於插入基因體之非同質DNA與側出插入位置之得自玉米細胞DNA(亦即側出DNA)間之接頭，可供診斷DAS-59122-7品件。
根據本發明之另一具體例，產生昆蟲抗性的玉米植株之方法，包含下列步驟：(a)有性雜交包含本發明之表現卡匣之第一親代玉米種系(其提供昆蟲抗性)與缺昆蟲抗性之第二親代玉米種系，因此產生多種子代植株；以及(b)選擇具有昆蟲抗性之子代植株。此種方法選擇性包含：回交子代植株與第二親代玉米種系，來產生具有昆蟲抗性之真正育種用玉米植株之額外步驟。
本發明提供一種製造一對昆蟲有抗性的玉米植株之方法，包含以DNA構成體PHI17662A(SEQ ID NO：24)轉形玉米細胞，將該轉形的玉米細胞生長成為玉米植株，選出對昆蟲顯示抗性的玉米植株，進一步將該玉米植株生長成多產的玉米植株。多產的玉米植株可自我授粉、或與相容之玉米變異株交叉授粉，來產生昆蟲抗性子代。
本發明之另一具體例進一步係關於一種於生物樣本識別玉米品件DAS-59122-7的DNA檢測套件組。套件組包含：用於PCR識別方案的第一引子其可特別識別DAS-59122-7之5’或3’側出區，以及第二引子其可特別識別於DAS-59122-7之外來DNA內部、或側出DNA內部的序列。 本發明之又一具體例亦係關於一種識別於生物樣本的品件DAS-59122-7之套件組，該套件組包含一特定探針，該探針具有一序列其係相對應於或互補於一序列，後者序列具有與品件DAS-59122-7特定區80%至100%序列相同型。較佳探針序列係相對應於包含品件DAS-59122-7的5’側出區或3’側出區部分之特定區。
本發明之具體例涵蓋之方法及套件組可用於不同目的，諸如但非限於下列目的：識別於植株、植物材料或產物中的品件DAS-59122-7，該產物諸如但非限於包含或衍生自植物材料之食品或飼料產品(新鮮或加工產品)；另外或此外，本發明方法及套件組可用於識別轉殖基因植物產物用於轉殖基因材料與非轉殖基因材料間之區隔；另外或此外，本發明方法及套件組可用於測定包含玉米品件DAS-59122-7之植物材料含量。套件組也包含發揮檢測方法效能所需之試劑及材料。
本發明進一步係關於DAS-59122-7玉米植株或其部分包括但非限於玉米植株DAS-59122-7及其衍生子代的花粉、胚珠、營養細胞、花粉細胞核、及卵細胞核。DNA引子分子可從其中提供特定擴增子產物的玉米植株和種子DAS-59122-7構成本發明之一具體例。
前述及其它本發明之態樣由後文詳細說明及附圖將更為明瞭。
圖式簡單說明
第1圖為DNA序列(SEQ ID NO：23)顯示轉殖基因插子 PHI17662A及轉殖基因插子的側出序列。5’及3’邊緣區亦即bp 1至bp 2593及bp 9937至bp 11922分別於下方畫線。基於與轉形質體PHP17622比較，發現兩個核苷酸差異(bp 6562及bp 6562)以粗體字與下方畫線標示。
第2圖為B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7插子區之示意圖被劃分成為三個分開區段：帶有玉米基因體DNA之5’邊緣區、完好T-DNA插子、及帶有玉米基因體DNA之3’邊緣區。插子圖下方的兩個箭頭表示由5’及3’基因體行走片段衍生而得的序列之起點及終點。於插子圖下方的其它方框表示由品件DAS-59122-7的基因體DNA擴大且經過定序涵蓋完好T-DNA插子及5’及3’插子/邊緣接頭區的PCR片段。
第3圖為B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7插子區之示意圖被劃分成為三個分開區段：帶有玉米基因體DNA之5’邊緣區、完好T-DNA插子及帶有玉米基因體DNA之3’邊緣區。插子圖下方的方框表示位在基因體邊緣區或跨帶有玉米基因體DNA的T-DNA插子之5’及3’接頭區而係從得自品件DAS-59122-7之基因體DNA擴大的PCR片段。
 較佳實施例之詳細說明
後文定義及方法係供更明白瞭解本發明以及導引熟諳技藝人士實施本發明。除非另行指示，否則各術語係依據技藝界人士之習慣用法。分子生物學常用術語定義可參考Rieger等人，基因詞彙：傳統與分子第5版，Springer-Verlag； 紐約，1991；及Lewin,Genes V，牛津大學出版社：紐約1994。使用於37CFR 1.822列舉的DNA鹼基命名。
用於此處，「包含」一詞表示「包括但非限於」。
用於此處，「玉米」一詞表示Zea mays或玉蜀黍，且包括全部可與玉米育種之植物變種，包括野生種玉米。
用於此處，「DAS-59122-7特異性」一詞表示核苷酸序列，其適合用於植物、植物材料、或產品，例如但非限於包含或衍生自植物材料之食品或飼料產品(新鮮或加工)的品件DAS-59122-7的鑑別。
用於此處，「昆蟲抗性」及「影響害蟲」等詞表示於任何發育階段執行昆蟲進食、生長及/或行為的改變，包括但非限於：殺滅昆蟲；延遲生長；阻礙繁殖能力；抑制進食等。
用於此處，「殺害蟲活性」及「殺蟲活性」等詞表示同義詞，表示有機體或物質(例如蛋白質)之能力可藉多項參數測定，該等參數包括但非限於害蟲進食及/或暴露於該有機體或物質經歷適當長度時間後害蟲死亡、害蟲體重減輕、害蟲被誘捕、驅逐害蟲及、害蟲之其它行為變化及生理變化。例如「殺害蟲蛋白質」為其本身或組合其它蛋白質顯示殺害蟲活性的蛋白質。
「編碼序列」表示編碼特定胺基酸序列的核苷酸序列。用於此處，「編碼」或「經編碼」等詞用於特定核酸，表示核酸包含指導核苷酸序列轉譯成為特定蛋白質的所需資訊。蛋白質被編碼之資訊係使用字碼子規定。編碼蛋白質之核酸包含於核酸轉譯區之非轉譯序列(例如插入序 列)、或可缺乏此種介入的非轉譯序列(例如於cDNA)。
「基因」表示可表現特定蛋白質之核酸片段，包括於編碼序列之前(5’非編碼序列)及編碼序列之後(3’非編碼序列)的調節序列。「天然基因」表示帶有其本身的調節序列的天然出現基因。「嵌合體基因」表示任何非天然基因之基因，其包含非天然出現的調節序列及編碼序列。如此，嵌合體基因包含調節序列及編碼序列，其係衍生自不同來源，或包含衍生自相同來源的調節序列及編碼序列，但排列方式與天然出現的排列方式不同。「內生基因」表示於其有機體基因體之自然所在位置的天然基因。「外來」表示一種物質，其並非該感興趣位置天然出現之物質。如此「外來DNA」包含植物的重組DNA、以及新導入且經過重排之植物DNA。「外來」基因表示通常非出現於宿主有機體之基因，反而係藉基因移轉而被導入宿主有機體的基因。外來基因包含被插入非天然有機體之天然基因，或嵌合體基因。「轉殖基因」係已經藉轉形程序而被導入基因體之基因。已經有重組DNA插入的植物基因體位置，可稱作為「插入位置」或「目標位置」。
用於此處，「插子DNA」表示表現卡匣內部之非同質DNA用來轉形植物材料，而「側出DNA」可存在於天然存在於有機體如植物之基因體DNA，或透過轉形處理而被導入之外來DNA(非同質DNA)，其為原先插子DNA分子以外的部分，例如與轉形品件關聯的片段。用於此處，「側出區」或「側出序列」表示至少20鹼基對，較佳至少50鹼基對， 且高達5000鹼基對的序列，其係緊鄰於原先外來插子DNA分子上游且連續、或緊鄰原先外來插子DNA分子下游，且與原先外來插子DNA分子連續。結果導致外來DNA隨機整合之轉形程序，將獲得含有對各轉形株具有特徵性且獨特不同的側出區的轉形株。當重組DNA經由傳統雜交而被導入植物時，其側出區通常不變。轉形株也含有一塊介於非同質插子DNA與基因體DNA間的獨特接合，或介於兩塊基因體DNA間、或介於兩塊非同質DNA間的獨特接合。「接合」為二特定DNA片段的接合點。例如一接合點存在於插子DNA與側出DNA接合位置。一接合點也存在於二DNA片段共同接合之轉形有機體，該接合方式係與天然有機體不同。「接合DNA」表示包含一接合點的DNA。
用於此處，「非同質」述及核酸，表示核酸係來自異種，或核酸來自同種，但經由蓄意的人為介入，而就組成及基因體位置於天然形式實質上修改。例如操作式聯結至非同質核酸序列之啟動基因可來自於與核苷酸序列衍生之種屬不同種；或若啟動基因係來自於同種，則啟動基因未天然操作式鍵聯至核苷酸序列。非同質蛋白質可來自於不同種，或若來自於同種，則非同質蛋白質藉蓄意人為介入，而與其原先形式實質上修改。
「調節序列」表示位在編碼序列的上游(5’非編碼序列)、內部、或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關編碼序列之轉錄、RNA處理或穩定性、或轉譯。調節序列包括啟動基因、轉譯前導子序列、插入序列、及聚腺 苷化辨識序列。
「啟動基因」表示可控制編碼序列或功能RNA表現的核苷酸序列。通常編碼序列係位於啟動基因序列之3’。啟動基因序列係由近端元體、和較為遠端之上游元體組成，後者元體俗稱為促進基因。如此，「促進基因」為可刺激啟動基因活性的核苷酸序列，促進基因可為啟動基因的內生元體，或為插入來促進啟動基因的濃度或組織特異性的非同質元體。啟動基因可全部從天然基因衍生而得，或可由衍生自自然界不同啟動基因的不同元體組成，或甚至包含合成核苷酸節段。熟諳技藝人士須瞭解不同啟動基因可指導於不同組織或不同細胞類型的基因表現，或於不同發育階段或回應於不同環境條件的基因表現。可造成核酸片段於大部分細胞類別被表現最多次的啟動基因，俗稱為「組成啟動基因」。經常發現可用於植物細胞之各類型新的啟動基因；多個實例可參考Okamuro及Goldberg(1989)植物生物化學15：1-82之實例。進一步瞭解，因大部分情況下，調節序列之確切邊界尚未完全界定，故具有不同長度之核酸片段可有相同啟動基因活性。
「轉譯前導子序列」表示位在一個基因之啟動基因序列與編碼序列間的核苷酸序列。轉譯前導子序列係存在於轉譯起點序列上游，完全經過處理的mRNA。轉譯前導子序列影響多項參數，該等參數包括：一次轉錄本被加工成為mRNA、mRNA安定性、及/或轉譯效率。已經說明轉譯前導子序列實例(Turner及Foster(1995)分子生物技術 3：225-236)。
「3’非編碼序列」表示位在編碼序列下游的核苷酸序列，包括聚腺苷化辨識序列、和其它編碼調節信號而可影響mRNA處理或基因表現的序列。聚腺苷化信號通常係以影響聚腺苷酸加至mRNA前驅物3’端為其特徵。使用不同3’非編碼序列係舉例說明於Ingelbrecht等人(1989)植物細胞1：671-680。
「蛋白質」或「多肽」為排列成特定順序之胺基酸鏈，該特定順序係由編碼多肽的多核苷酸編碼序列決定的。
DNA構成體為DNA分子聯結在一起提供一或多個表現卡匣之總成。DNA構成體可為質體，質體可於細菌細胞自我複製，含有各種核酸內切酶限剪位置，其可用於導入可提供功能基因元體的DNA分子，亦即啟動基因、插入序列、前導子、編碼序列、3’終結區等；或DNA構成體可為DNA分子的線性總成，例如表現卡匣。含於DNA構成體內部之表現卡匣包含提供信使RNA轉錄需要的基因元體。表現卡匣可設計成於原核細胞表現、或於真核細胞表現。本發明之具體例的表現卡匣係設計成於植物細胞表現。
本發明之具體例的DNA分子提供於可於感興趣之有機體表現的表現卡匣。表現卡匣包括5’及3’調節序列，其係操作式聯結至編碼序列。「操作式聯結」聯結的核酸序列為毗連，若有所需，接合二蛋白質編碼區、毗連、且於相同讀取架構。操作式聯結一詞意圖指示啟動基因與第二序列間之功能聯結，其中啟動基因序列初始化且媒介與第二序列 相應的DNA序列轉錄。表現卡匣可額外含有至少一個額外基因來共同轉形至該有機體。另外，額外基因可提供於多個表現卡匣或多個DNA構成體上。
於5’至3’轉錄方向，表現卡匣包括：於作為宿主之有機體內可發揮功能的轉錄起始區和轉譯起始區、編碼區、及轉錄終結區或轉譯終結區。轉錄起始區(亦即啟動基因)可為宿主有機體之天然或類似基因、或外來或非同質基因。此外，啟動基因可為天然序列，或另外，啟動基因為合成序列。表現卡匣可額外含有5’前導子序列於表現卡匣構成體。此種前導子序列可用來促進轉譯。
須瞭解，此處使用的「轉殖基因」一詞包括任一種細胞、細胞系、胼胝體、組織、植物部分、或植物，其基因型已經藉非同質核酸的存在而改變，包括最初被改變的轉殖基因，以及經由最初轉殖基因之有性雜交或無性繁殖所形成的轉殖基因。「轉殖基因」一詞用於此處，並未涵蓋藉習知植物育種法或天然事件所造成的基因體(染色體或外染色體)變更，該等天然事件例如為隨機雜交受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉形、非重組轉位、或自發突變。
轉殖基因「品件」係使用非同質DNA構成體來轉形植物細胞而產生，該非同質DNA構成體包括核酸表現卡匣，其包含感興趣的轉殖基因、由轉殖基因插入植物基因體而再生之一群植物，以及藉插入特定基因體位置為特徵之特殊植物選擇。一種品件係以轉殖基因之表現為表現型特徵。於基因層面，一種品件為植物的基因組成的一部分。「品 件」一詞也表示藉轉形株與另一種包括非同質DNA之變異株間之有性雜交所產生的子代。即使重複回交至親代，來自轉形的親代之插入DNA及側出DNA係存在於雜交子代的相同染色體位置。「品件」一詞也表示來自原先轉形株的DNA，該DNA包含插入DNA及緊鄰插入DNA之側出序列，該DNA預期將移轉給接收插入DNA包括感興趣轉殖基因的子代，該轉殖基因係由一種包括插入DNA之親代種系(例如原先轉形株、和由自體受精所得子代)與一種不含插入DNA之親代種系進行有性雜交的結果。
昆蟲抗性DAS-59122-7玉米植株之育種，係經由首先有性雜交第一親代玉米植株與第二親代玉米植株，該第一親代玉米植株包含衍生自轉形而帶有本發明之表現卡匣可賦予昆蟲抗性的轉殖基因DAS-59122-7玉米植株及其子代生長所得玉米植株組成；以及該第二親代玉米植株缺昆蟲抗性，因此產生多種第一子代植株；以及然後選擇對昆蟲有抗性之第一子代植株；以及第一子代植株自體受精，因而產生多種第二子代植株；然後由該第二子代植株選出昆蟲抗性植株。此等步驟進一步包括第一昆蟲抗性子代植株或第二昆蟲抗性子代植株回交至第二親代玉米植株或第三親代玉米植株，因而產生對昆蟲有抗性的玉米植株。
用於此處，「植株」一詞包括對全株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細胞、及其子代。須瞭解轉殖基因植物部分屬於本發明之範圍，例如包含植物細胞、原生質體、組織、胼胝體、胚以及花、莖、果實、葉、及根， 其係來自於轉殖基因植株、或其原先使用本發明DNA分子轉殖之子代，因此至少部分係由轉殖細胞組成，也構成本發明之一具體例。
用於此處，「植物細胞」一詞包括但非限於種子、懸浮培養、胚、分生子區、胼胝體組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、及微孢子。可用於本發明方法之植物類別通常係廣達適合轉形技術之高等植物類別，包括單子葉植物及雙子葉植物。
「轉形」表示核酸片段移轉至宿主有機體基因體，結果獲得基因穩定的繼承。含有轉形核酸片段之宿主有機體稱作為「轉殖基因」有機體。植物轉形方法例如包括土壤桿菌(Agrobacterium)媒介的轉形(De Blaere等人(1987)酶學方法143：277)、及粒子加速轉形技術或「基因槍」轉形技術(Klein等人(1987)自然(倫敦)327：70-73；美國專利第4,945,050號，以引用方式併入此處)。額外轉形方法揭示如後。
如此，本發明之離體多核苷酸可結合於重組構成體，典型為DNA構成體，其可被導入宿主細胞，且於宿主細胞複製。此種DNA構成體為載體，載體包括可轉錄及轉譯於一指定宿主細胞之多肽編碼序列的複製系統及序列。多種適合穩定轉移感染植物細胞、或適合建立轉殖基因植株之載體，說明於例如Pouwels等人(1985；補遺1987)轉殖載體：實驗室手冊，Weissbach及Weissbach(1989)植物分子生物學方法(學術出版社，紐約)；及Flevin等人(1990)植物分子生 物學手冊(Kluwer學術出版社)。典型植物表現載體例如包括，於5’及3’調節序列及主控可選擇標記的轉錄控制之下，一或多種經選殖的植物基因。此種植物表現載體也含有啟動基因調節區(例如控制可誘生表現或組成表現、環境調節或發育調節表現、或細胞特異性或組織特異性表現的調節區)、轉錄引發起點位置、核糖體結合位置、RNA處理信號、轉錄終結位置、及聚腺苷化信號。
也須瞭解兩種不同轉殖基因植株也可配種，來產生含有兩種獨立分開的額外外來基因之子代。適當子代的自體受精可產生兩種增加的外來基因的同質接合。如同營養繁殖般，也預期包含回交至親代植物，以及與非轉殖基因植株作異種雜交。其它常用於不同形質及農作物的育種方法說明可參考若干參考文獻，例如Fehr，培養變種發育之育種法，Wilcos J.編輯，美國農藝學會，威斯康辛州麥迪遜(1987)。
「探針」是一種離體核酸，該離體核酸附接有習知可檢測之標記分子或通報子分子，例如放射性同位素、配位子、化學發光劑(冷光劑)、或酵素。此種探針係與目標核酸股互補，於本發明之情況下，係與來自玉米品件DAS-59122-7之離體DNA股互補，無論該DNA股係來自於玉米植株、或來自於該品件DNA之樣本。根據本發明之探針不僅包括去氧核糖核酸或核糖核酸，同時也包括聚醯胺類，及可特異性結合至目標DNA序列的、且可用來檢測是否存在有該目標DNA序列的其它探針材料。
「引子」為離體核酸，引子藉核酸雜交而煉合(annealing)至互補目標DNA股，來形成引子與目標DNA股間之雜交體，然後藉聚合酶例如DNA聚合酶而順著目標DNA股延長。本發明之引子對可用於擴大目標核酸序列，例如藉聚合酶連鎖反應(PCR)或其它習知核酸擴大方法擴大。「PCR」或「聚合酶連鎖反應」為一種用於擴大特定DNA節段之技術(參考美國專利第4,683,195號及第4,800,159號；二案以引用方式併入此處)。
探針及引子有足夠核苷酸長度，可於操作員測定之雜交條件或反應條件下特異性結合至目標DNA序列。此種長度可為任一種夠長而可用於首選檢測方法之長度。通常使用11核苷酸或以上，較佳18核苷酸或以上，及更佳22核苷酸或以上。於高度嚴苛的雜交條件下，此種探針及引子特異性雜交至目標序列。較佳根據本發明之探針及引子具有毗鄰核苷酸與目標序列的完整DNA序列類似性，但可藉習知方法設計與目標DNA序列不同的、且保有雜交至目標DNA序列能力的探針。探針可用作為引子，但探針通常係設計成結合至目標DNA或目標RNA，而非用於擴大方法。
特定引子可用來擴大整合片段，製造擴增子，擴增子可用作為識別於生物樣本中的品件DAS-59122-7的「特定探針」。當於允許探針結合至樣本的條件下，探針與生物樣本核酸雜交時，此種結合可被檢測，如此允許指示生物樣本中存在有品件DAS-59122-7。此種結合探針之識別已經技藝界說明。特定探針較佳為序列，該序列於最佳條件下，可 特異性雜交至品件5’側出區或3’側出區內部的一區，特定探針也較佳包含毗連外來DNA的一部分。較佳特定探針包含與該品件特定區有至少80%，較佳為80%至85%，更佳為85%至90%，特佳為90%至95%及最佳為95%至100%相同(或互補)的序列。
探針及引子之製備及使用方法例如述於分子選殖：實驗室手冊第2版第1-3集，編者Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港1989年(後文稱作「Sambrook等人1989」)：分子生物學之流行方案：編者Ausubel等人，Greene出版社及約翰威力父子公司，紐約1992年(定期更新)(後文稱作「Ausubel等人1992」)；及Innis等人，PCR方案：方法與應用指南，學術出版社：聖地牙哥，1990年。PCR引子對可衍生自已知序列，例如使用意圖用於該項目的之電腦程式而衍生，例如PCR引子分析工具於向量NTI版本6(Informax公司馬里蘭州貝塞達)；PrimerSelect(DNASTAR公司，威斯康辛州麥迪遜)；及Primer(0.5版權，1991年，麻省劍橋白頭生醫研究協會)。此外，序列可以視覺掃描，引子可使用熟諳技藝人士已知之指南人工識別。
「套件組」一詞用於此處，表示一組試劑用來進行本發明方法，特別識別於生物樣本的品件DAS-59122-7。本發明之套件組可用於、而其組成元件可特別經調整用於品質控制(例如種子批料純度之品質控制)、植物材料的品件DAS-59122-7之檢測、或包含植物材料或衍生自植物材料之材料，諸如但非限於食品或飼料產品。「植物材料」一詞用 於此處，表示得自或衍生自植物之材料。
基於此處揭示之側出DNA及插子序列之引子及探針可用來藉習知方法例如藉序列的再度轉殖及序列的定序方法而證實所揭示的序列(或若有所需，校正所揭示的序列)。本發明之核酸探針及引子於嚴苛條件下雜交至目標DNA序列。任一種習知核酸雜交或擴大方法皆可用來識別樣本存在有得自轉殖基因品件的DNA。核酸分子或其片段於某些條件下，可特異性雜交至其它核酸分子。用於此處，兩個核酸分子若可形成逆平行雙股核酸結構，則稱作可特異性彼此雜交。
核酸分子若有完整互補性，則稱作可為另一個核酸分子的「互補序列」。用於此處，當一個分子每個核苷酸係互補於另一個分子的核苷酸時，該分子稱作為具有「完整互補性」。兩個分子若可彼此雜交，且有足夠穩定性，可讓其至少於習知「低嚴苛度」條件下維持煉合，則兩分子稱作為「最小互補性」。同理，若二分子可彼此雜交，且有足夠穩定性，讓其於習知「高度嚴苛」條件下，可維持彼此煉合，則二分子稱作為「互補」。習知嚴苛條件係如Sambrook等人1989所述，以及Haymes等人於：核酸雜交，實用辦法，IRL出版社，華盛頓特區(1985年)所述；因此，悖離完全互補性為可被允許，只要此種悖離不會完全排除分子形成雙股結構的能力即可。為了讓核酸分子用作為引子或探針，於序列上只需要足夠互補，來於採用的特定溶劑及鹽濃度下形成穩定雙股結構即可。
於雜交反應，特異性典型係依據雜交後洗滌之函數而改變，關鍵因素為最終洗滌溶液之離子強度及溫度。熱熔點(Tm)為(於所定義之離子強度及pH下)有50%互補目標序列可雜交至完美匹配的探針之溫度。對DNA-DNA雜交體，Tm可由Meinkoth及Wahl(1984)分析生物化學138：267-284之方程式估算：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L；此處M為一價陽離子之莫耳濃度，%GC為DNA之鳥苷及胞苷核苷酸百分比，%form為雜交溶液之甲醯胺百分比，以及L為雜交體長度，以鹼基對為單位。Tm對於每1%錯誤雜交減少約1℃；因此Tm、雜交及/或洗滌條件可經調整來雜交至預定身分的序列。例如若追求序列有大於90%相同性，則Tm可降低10℃。通常苛刻條件係選擇對特定序列及其互補序列於定義的離子強度及pH，比Tm低約5℃。但嚴重苛刻條件可利用比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃雜交及/或洗滌；中等苛刻條件利用於比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃雜交或洗滌；低度苛刻條件利用於比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、或20℃。
使用該方程式、雜交、及洗滌組成物、以及預定Tm，熟諳技藝人士瞭解將描述雜交及/或洗滌溶液的苛刻程度變化。若預定不匹配程度導致Tm低於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，則較佳提高氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)濃度，因而可使用較高溫度。核酸雜交之綜合指南可參考Tijssen(1993)生物化學及分子生物學實驗室技術-與核酸探針雜交，第一部分，第2章(Elsevier，紐約)；以及Ausubel等人 編輯(1995年)分子生物學流行方案第2章(格林出版社及威力科技公司，紐約)。參考Sambrook等人(1989)分子選殖：實驗室手冊(第2版冷泉港實驗室出版社，紐約平景市)。
用於此處，實質上同質序列為核酸分子，於高度苛刻條件下，該核酸分子特異性雜交至可媲美之核酸分子互補序列。可促進DNA雜交之適當苛刻度條件，例如6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)於約45℃，接著於50℃使用2X SSC洗滌，為熟諳技藝人士已知，或可參考分子生物學流行方案，約翰威力父子公司，紐約(1989年)，6.3.1-6.3.6。典型之苛刻條件為鹽濃度低於約1.5M鈉離子，典型於pH 7.0至pH 8.3為約0.01M至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，用於短探針(例如10至50核苷酸)溫度至少為約30℃，用於長探針(例如大於50核苷酸)溫度至少為約60℃。苛刻條件也可以加入去穩定劑如甲醯胺達成。低度嚴苛條件例如包括與30至50%甲醯胺緩衝溶液、1M氯化鈉、1% SDS(硫酸十二烷酯鈉)於37℃雜交，於1X SSC至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)於50℃至55℃洗滌。實例中等苛刻條件包括於40至45%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS於37℃雜交；以及於0.5X SSC至1X SSC於55℃至60℃洗滌。高度苛刻條件的實例包括於50%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS於37℃雜交；以及於0.1X SSC於60℃至65℃洗滌。較佳具體例中，本發明核酸特別於中等苛刻條件下，雜交至DAS-59122-7品件或其互補序列或任一種片段所獨特之一或多個核酸分子。
供比較用序列校準方法為技藝界眾所周知。如此，二 序列間相同性百分比之測定可使用數學演繹法則達成。此種數學演繹法則之非限制例為Myers及Miller(1988)CABIOS 4：11-17的演繹法則；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482之局部同質性演繹法則；Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453之同質校準演繹法則；Pearson及Lipman(1988)美國國家科學院議事錄85：2444-2448之搜尋類似性方法；Karlin及Altschul(1990)美國國家科學院議事錄87：2264的演繹法則，修改為如Karlin及Altschul(1993)美國國家科學院議事錄90：5873-5877。
此等數學演繹法則之電腦實施例可用來比較各序列來決定序列的相同性。此等實施例包括但非限於：CLUSTAL於PC/Gene程式(得自Intelligenetics，加州山景市)；ALIGN程式(版本2.0)；ALIGN PLUS程式(版本3.0，版權1997年)；及GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA於威斯康辛基因軟體，版本10(得自Accelrys，美國加州92121聖地牙哥史奎頓路9685號)。使用此等程式之校準可採用內設參數進行。
CLUSTAL程式係由下列參考文獻詳細說明：Higgins及Sharp，基因73：237-244(1988)；Higgins及Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet等人，核酸研究16：10881-90(1988)；Huang等人，生物科學之電腦應用8：155-65(1992)及Pearson等人，分子生物學方法24：307-331(1994)。ALIGN及ALIGN PLUS程式係基於Myers及Miller(1988)(參見上文) 的演繹法則。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403之BLAST程式係基於Karlin及Altschul(1990)參見上文的演繹法則。可用於資料庫的類似性搜尋之BLAST族程式包括：BLASTN用於相對於核苷酸資料庫序列作核苷酸查詢序列；BLASTX用於相對於蛋白質資料庫序列作核苷酸查詢序列；BLASTP用於相對於蛋白質資料庫序列作蛋白質查詢序列；TBLASTN用於相對於核苷酸資料庫序列作蛋白質查詢序列；及TBLASTX用於相對於核苷酸資料庫序列作核苷酸查詢序列。參考分子生物學流行方案第19章，Ausubel等人編輯，格林出版社及威力科技公司，紐約(1995年)。也可藉目測檢視以人工進行校準。
為了獲得供比較用之有間隙的校準，可利用有間隙的BLAST(於BLAST 2.0)，如Altschul等人(1997年)核酸研究25：3389所述。另外PSI-BLAST(於BLAST 2.0)可用來進行迭代搜尋，檢測分子間之距離關係。參見Altschul等人(1997)參見上文。當利用BLAST、間隙BLAST、PSI-BLAST時，可使用個別程式之內設參數(例如BLASTN用於核苷酸序列、BLASTX用於蛋白質)。參考www.ncbi.hlm.nih.gov。
用於此處，二核苷酸或多肽序列內文之「序列相同性」或「相同性」係參照於二序列之殘基，其當於特定比較視窗校準最大相對應關係時為相同。當序列相同性百分比用於蛋白質時，瞭解非相同之殘基位置經常因保留胺基酸取代而有差異，此處胺基酸殘基係以類似化學性質(例如電荷或疏水性)之殘基取代其它胺基酸，因此不會改變分子之功 能性質。當保留取代的序列有差異時，序列相同性百分比向上調整而修正取代之保留性質。由於如此保留取代而不會的序列稱作具有「序列相似性」或「相似性」。進行此種調整之手段為熟諳技藝人士眾所周知。典型地，涉及將保留取代評級為部分不匹配，而非完全不匹配，因此提高序列相同性百分比。如此例如若相同胺基酸評分為1，非保留取代被評分為0，則保留取代被評分為0至1間。保留取代之分數例如如程式PC/GENE(Intelligenetics，加州山景市)進行計算。
用於此處，「序列相同性百分比」表示於比較窗比較兩個最佳校準序列之測定值，其中於比較窗之多肽序列部分，比較參考序列(不含加成或刪除)可包含加成或刪除(亦即間隙)來獲得兩個序列之最佳校準。百分比係由於二序列之相同核酸鹼殘基或胺基酸殘基之位置編號測定，獲得匹配位置編號，將匹配位置編號除以於比較視窗之總位置數目，乘以100，來獲得序列相同性百分比計算而得。
有關使用特定擴大引子對來擴大目標核酸序列(例如藉PCR)，「苛刻條件」為允許引子對只雜交至目標核酸序列的條件，該目標核酸序列為具有相對應野生型序列之引子(或其互補序列)將結合的核酸序列，較佳於DNA高溫擴大反應產生獨特擴大產物，亦即擴增子。
「(目標序列)特定」一詞指示探針或引子於苛刻條件下，只雜交至包含目標序列樣本之目標序列。
用於此處，「擴大的DNA」或「擴增子」表示目標核酸 序列之核酸擴大產物為核酸樣板之一部分。例如為了測定來自有性雜交的玉米植株是否含有來自本發明玉米植株的轉殖基因品件的基因體DNA，萃取自玉米植株組織樣本的DNA可使用DNA引子對來進行核酸擴大方法，該DNA引子對包括毗鄰於所插入之非同質DNA插入位置之側出序列衍生而得之第一引子，以及包括衍生自插入之非同質DNA之第二引子，來產生擴增子，該擴增子可診斷是否存在有該品件DNA。另外，第二引子可衍生自側出序列。擴增子具有某種長度，以及有某種序列，其也可診斷該品件。擴增子之長度可由引子對加一個核苷酸鹼基對之組合長度、至DNA擴大方案所能產生的擴增子之任一種長度。另外，引子對可衍生自於插入DNA兩側之側出序列，因而產生包括PHI17662A表現構成體之整個插入核苷酸序列的擴增子，參考第1圖(SEQ ID NO：23)，大小約12 Kb。衍生自側出序列之引子對之一成員可位在距離插入DNA序列之一段距離。此種距離由約一對核苷酸鹼基對至擴增子極限，或約20Kb核苷酸鹼基對。使用「擴增子」一詞，特別排除於DNA高溫擴大反應可形成之引子二元體。
核酸擴大可藉技藝界已知之多種核酸擴大方法之任一種，包括聚合酶連鎖反應(PCR)來達成。多種擴大方法為技藝界已知述於美國專利第4,683,195號及第4,683,202號以及PCR方案：方法與應用指南，編者Innis等人，學術出版社，聖地牙哥1990年。PCR擴大方法已經發展成擴大高達22 Kb基因體DNA及至多42 Kb噬菌體DNA(Cheng等人，美國國 家科學院議事錄91：5695-5699，1994)。此等方法以及技藝界已知之其它DNA擴大方法可用於實施本發明。須瞭解，於特定PCR方案之多種參數須調整來配合特定實驗室條件，可略經修改而又允許收集類似結果。此等調整為熟諳技藝人士顯然易知。
藉此種方法所產生的擴大可藉多項技術檢測，檢測技術包括但非限於基因位元分析(Nikiforov等人，核酸研究22：4167-4175，1994)，此處DNA寡核苷酸係設計成毗鄰側出DNA序列重疊插入DNA序列。寡核苷酸於微孔孔板之孔內被制動。於感興趣該區PCR後(使用一個引子於插入序列，以及一個引子於毗鄰側出序列)，單股PCR產物可雜交至制動寡核苷酸，作為使用DNA聚合酶以及對預期次一鹼基之特異性經過標記之ddNTP，進行單一鹼基延伸反應之樣板。可藉螢光讀取，或基於ELISA讀取。信號指示由於成功地擴大、雜交、及單一鹼基延伸，而存在有插入序列/側出序列。
另一種檢測方法為熱解定序技術(Pyrosequencing technique)，如Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24,2000)所述。於此種方法，寡核苷酸被設計為重疊毗鄰DNA及插入DNA接合。寡核苷酸雜交至得自感興趣該區的單股PCR產物(一個引子於插入序列，以及一個引子於側出序列)，以及於DNA聚合酶、ATP、硫酸酶、蟲螢光素酶、apyrase、腺苷5’硫代磷酸及蟲螢光素存在下培養。個別添加dNTP，結合獲得之光信號經測定。光信號指示因成功的擴大、雜 交、以及單鹼基延伸或多鹼基延伸，存在有轉殖基因插入序列/側出序列。
螢光偏極化係如Chen等人(基因體研究9：492-498，1999)所述，為一種檢測本發明的擴增子之方法。使用此種方法，寡核苷酸設計成重合側出DNA與插入DNA接合。寡核苷酸雜交至得自感興趣該區之單股PCR產物(一個引子於插入DNA，一個引子於側出DNA序列)，於DNA聚合酶及螢光標記ddNTP存在下培養。單一鹼基延伸，結果攙混入ddNTP。攙混可使用螢光劑以偏光的改變來測定。偏光改變指示由於成功地擴大、雜交及單股延長而存在有轉殖基因插入序列/側出序列。
Taqman®(PE應用生物系統公司，加州福斯特城)描述為檢測與定量是否存在有DNA序列之方法，可由製造商提供之指令而更完整瞭解。簡言之，設計FRET寡核苷酸探針，其重疊側出DNA及插入DNA接合。FRET探針及PCR引子(一個引子於插入DNA序列，一個引子於側出基因體序列)於熱穩定聚合酶及dNTP存在下循環。FRET探針的雜交，結果導致遠離FRET探針之淬熄部分之螢光部分的裂解與釋放。螢光信號指示由於成功地擴大與雜交而存在有側出序列及轉殖基因插入序列。
分子呼叫台描述用於序列檢測，如Tyangi等人(自然生技14：303-308,1996)所述。簡言之，FRET寡核苷酸探針設計為重疊側出DNA及插入DNA接合。FRET探針的獨特結構結果導致其含有二次結構，二次結構可維持螢光部分及淬熄 部分緊鄰。FRET探針及PCR引子(一個引子於插入DNA序列，以及一個引子於側出序列)係於熱穩定聚合酶及dNTP存在下循環。於成功的PCR擴大之後，FRET探針雜交至目標序列，結果導致探針二次結構的去除，以及螢光部分與淬熄部分的空間隔開。獲得螢光信號。螢光信號指示由於成功地擴大與雜交，而存在有側出序列/轉殖基因插入序列。
使用的擴增子內部序列特異性探針進行雜交反應，乃又另一種用來藉PCR反應檢測產生之擴大之方法。
本發明進一步於下列實施例定義。須瞭解此等實施例雖然指示本發明之較佳具體例，但僅供舉例說明之用。由前文討論及實施例，熟諳技藝人士確定本發明之基本特性，可未悖離本發明之精髓及範圍，對本發明做出多項變化及修改來配合多項用途及條件。如此除了此處所示及所述之外，本發明之各項修改為熟諳技藝人士由前文說明為已知。此等修改也意圖落入隨附之申請專利範圍。
此處引述之各參考文獻之揭示以引用方式併入此處。
實施例 實施例1. 玉米藉土壤桿菌(Agrobacterium)轉形而轉形以及含有Cry34Ab1及Cry35Ab1(Cry34/35Ab1)基因之轉殖基因植株的再生
定名為PHI17662 A(SEQ ID NO：24)之約7.4 Kb的DNA分子包括包含DNA分子的第一轉殖基因表現卡匣，包括玉米泛素(Ubi-1)基因的啟動基因、5’未轉譯表現序列、及第 一插入序列(Christensen等人(1992)植物分子生物學18：675-689及Christensen及Quail(1996)轉殖基因研究5：213-218)操作式連結至識別為Cry34Ab1的編碼蘇桿菌(B.t.)δ內毒素之DNA分子(美國專利第6,127,180、6,624,145及6,340,593號)，二者係操作式連結至包含分離自馬鈴薯的Pin II轉錄終結序列之DNA分子(Gyheung An等人(1989)植物細胞1：115：122)。DNA構成體之第二轉殖基因表現卡匣包含編碼小麥過氧化酶啟動基因之DNA分子(Hertig等人(1991)植物分子生物學16：171-174)操作式連結至被標示為Cry35Ab1之編碼蘇桿菌(B.t.)δ內毒素之DNA分子(美國專利第6,083,499、6,548,291及6,340,593號)操作式連結至分離自馬鈴薯的包含Pin II轉錄終結序列之DNA分子(Gyheung An等人(1989)植物細胞1：115：122)。基因構成體的第三轉殖基因表現卡匣包含花椰菜嵌紋病毒(CaMV)35S啟動基因之DNA分子(Odell J.T.等人(1985)自然313：810-812；Mitsuhara等人(1996)植物細胞生理學37：49-59)操作式連結至編碼膦赤素乙醯轉移酶(phoshinothricin acetyltransferase(PAT))基因之DNA分子(Wohlleben W.等人(1988)基因70：25-37)操作式連結至得自(CaMV)35S之包含3’轉錄終結序列之DNA分子(參考Mitsuhara等人(1996)植物細胞生理學37：49-59)用來轉形玉米胚組織。
B.t. Cry34/35 Ab1玉米植株係經由採用Zhao方法藉土壤桿菌轉形獲得(美國專利第5,981,840號及PCT專利公告案WO98/32326號；其內容以引用方式併入此處)。簡言之，從 玉米分離未成熟胚，胚接觸土壤桿菌懸浮液，細菌可轉殖PHI17662 DNA(SEQ ID NO：24)至未成熟胚中之至少一個胚的至少一個細胞(步驟1：感染步驟)。特別於本步驟中，未成熟胚係浸泡於土壤桿菌懸浮液內來開始接種。胚係與土壤桿菌共同培養一段時間(步驟2：共同培養步驟)。特別，於感染步骤後，未成熟胚係於固體培養基上培養。於此共同培氧期之後，提供「靜止」步驟。於此靜止步驟中，於至少一種已知可抑制土壤桿菌生長的抗生素存在下，但未添加植物轉形株選擇劑來培養胚(步驟3：靜止步驟)。特別，未成熟胚係於含抗生素的固體培養基上培養，但不含選擇劑來消除土壤桿菌且用於感染細胞之靜止期。其次，接種胚係於含有選擇劑之培養基上培養，回收生長的轉形胼肢體(步驟4：選擇步驟)。特別，未熟胚係於含選擇劑之固體培養基上培養，結果獲得轉形細胞的選擇性生長。然後胼肢體於植株體內再生(步驟5：再生步驟)，且特別，於選擇性培養基上生長的胼肢體於固體培養基上培養來再生植株。培養期間個別胚係維持實體上分開，大部分培植體皆於選擇性培養基上死亡。
存活且產生健康的固弗辛內(glufosinate)抗藥性胼肢體組織的該等胚被分派一個獨特的識別碼來表示推定轉形品件，且連續轉殖至新鮮選擇培養基。由各個獨特品件衍生的組織再生植株，移到溫室。取葉樣本來進行分子分析，藉PCR證實轉殖基因的存在，且藉ELISA來驗證Cry34/35Ab1蛋白質的表現。然後植株使用西方玉米螟蟲來 接受全株生物檢定分析。陽性植株與近親種系交配來從最初的轉形植株獲得種子。於田間評估多種種系。基於具有包括昆蟲抗性及農事性能等優異特性的組合，從一群各自獨立的轉殖基因品件中選出DAS-59122-7。
實施例2. 蘇桿菌(Bacillus thuringiensis)Cry34/35Aab1玉米種系DAS-59122-7之識別
評估得自品件DAS-59122-7的種子。T1S2種子表示轉形入Hi-II背景，接著與近親種系PH09B交配，以及二回合自我交配。全部種子皆係得自派尼爾海布雷德(Pioneer Hi-Bred)(愛荷華州強斯頓)。於研究期間透過殺草劑之葉塗刷來驗證膦赤素乙醯轉移酶(PAT)活性以及使用橫向流裝置來驗證Cry34Ab1的表現，對植物葉組織初步判定其特徵。
本研究對照物質係定義為代表試驗物質背景的未修飾種子。Hi-II及PH09B背景的對照種子係用作為陰性對照。未經修飾之種子不含cry34Ab1、cry35Ab1、及pat基因的植物轉錄單元。全部種子皆係得自派尼爾海布雷德(愛荷華州強斯頓)。
得自另二B.t. Cry34/35Ab1品件亦即品件DAS-45214-4及品件DAS-45216-6的DNA樣本用作為品件特異性PCR分析的陰性對照。該二品件係使用用來製造品件DAS-59122-7的相同品件，透過土壤桿菌轉形而製造，因含有cry34Ab1、cry35Ab1、及pat基因之植物轉錄單元。但T-DNA於品件DAS-45214-4及品件DAS-45216-6的插入位置包括基體DNA邊緣區係與品件DAS-59216-6不同。得自品件 DAS-45214-4及品件DAS-45216-6的DNA樣本經分離且藉南方墨點分析來決定特徵(未顯示資料)。
品件DAS-59122-7的玉米種子及未經修飾的對照種子(Hi-II及PH09B)係於杜邦實驗站(德拉威州威明頓)的生長室內種植，來產生足夠供DNA分析用的植株。為了決定品件DAS-59122-7的特徵，種植10棵T1S2種子。對各個未經修飾的對照種系也種植10棵種子。每盆栽種一棵種子，各盆作獨特標示。栽種條件與生長條件係有助於健康植株的生長，包括調節光照及澆水。
對各個對照植株及品件DAS-59122-7植株收集葉樣本。對各個樣本，從生長點上方取足量葉材料，收集放置於預先標識的樣夲袋內。樣本放置於乾冰上，於收集後移至超低溫冷凍器內。全部樣本至處理之前皆維持冷凍。全部葉樣本皆以植物的識別號碼及收穫日期作各別標示。
為了證實Cry34Ab1蛋白質於品件DAS-59122-7的表現以及對照組不存在有表現，從全部品件DAS-59122-7植株及對照植株收集葉樣本，使用Cry34Ab1專用的橫向流裝置(史崔吉克診斷公司(Strategic Diagnostics,Inc.)，德拉威州紐華克)篩檢轉殖基因蛋白質。由各個植物取得葉衝孔，於磷酸鹽晚衝食鹽水溶液內以吞恩(Tween)20共同研磨來粗略萃取蛋白質。長條裝置浸泡於萃取物內來判定是否存在有Cry34Ab1蛋白質。免疫檢定分析結果係用來於分子分析前證實試驗物質植株的身分，如表1所示。
為了驗證於品件DAS-59122-7植株中膦赤素乙醯轉移 酶(PAT)表現，進行殺草劑的葉塗刷。本研究使用的全部植株的葉皆經過塗刷來驗證植物的身分。植物係於R1生長期之前檢定分析。檢定分析係遵照技藝界已知用於殺草劑葉塗刷來識別PAT表現轉殖基因植株的標準程序進行。特別，各植株之一片葉子部分使用約2%固弗辛內殺草劑，巴斯塔(Basta)(拜耳農作物科學公司(Bayer CropScience))於水處理，施用後4-12日目測檢查葉子塗刷區的褐色組織或壞死組織。記錄各植株的結果，且用來決定於各試驗植株的PAT的表現，如表1所示。如表所示，10植株測試品件DAS-59122-7 T1S2的生成，6植株表現Cry34A1及PAT二者，4植株未表現任一種蛋白質。全部未經修飾的對照組對於CryAb1及PAT檢定分析二者皆獲得試驗陰性結果(未顯示其資料)。
實施例3. 蘇桿菌Cry34/35b1玉米種系DAS-59122-7之南方墨點分析
1克葉樣本於液態氮下研磨，使用尼日(Dneasy)植物迷你套件組(快晶(Qiagen)公司，加州瓦倫西亞)分離基因體DNA，或使用標準尿素萃取緩衝液程序來分離基因體DNA。萃取後，DNA於瓊脂糖凝膠上目測觀察來判定DNA 的品質，且使用皮可格林(Pico Green)試劑(分子探針公司(Molecular Probes,Inc.)，俄勒岡州尤金市)及螢光光度測量分析來定量DNA。
1Kb DNA梯階(Ladder)(英微崔晶(Invitrogen)公司，加州卡士伯)用來估計瓊脂糖凝膠上的DNA片段大小。
由品件DAS-59122-7植株分離的基因體DNA使用Nco I消化，藉電泳分開，移轉至尼龍膜上，使用技藝界已知之標準程序而雜交至cry34Ab1、cry35Ab1及pat基因探針。打點曝光於X光底片一段時間或多段時間來檢測雜交片段，且讓分子量標準變成為目測可見。然後藉照相X光底片數位拍攝影像，及/或使用光成像器(Lumi-Imager)儀器(羅氏公司(Roche)，印第安納州印第安納波麗市)檢測影像。對各個探針登錄檢測帶大小。南方墨點分析用作為證試驗植株中存在有插入的手段，且驗證得自品件DAS-59122-7的全部植株皆含有如表1所示的相同插入(未顯示南方墨點)。南方墨點分析顯示品件DAS-59122-7含有得自質體PHP17662之T-DNA區的完好複本所組成的單一插入，而無效地分離種，藉蛋白質表現分析測定，不會雜交至基因探針。此外，表現兩種蛋白質的品件DAS-59122-7植株於南方墨點分析具有相同的雜交樣式(資料未顯示)。特別，cry34Ab1基因探針係雜交至1.915 kb之預期的內部T-DNA片段，cry35Ab1基因探針係雜交至2.607 kb預期的內部T-DNA片段及pat基因探針係雜交至3.4 kb邊緣片段，符合藉南方墨點結果測得有單一完好T-DNA插入。
實施例4. 蘇桿菌Cry34/35Ab1玉米種系DAS-59122-7之T-DNA插子及測出邊緣區定序
T-DNA插子及側出邊緣區係使用基於PCR之方法從B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7選殖，如第2圖及第3圖之略圖所示。特別，使用二基因體行走技術獲得品件DAS-59122-7插子5’端及3’端的邊緣序列。第一行走法基本上係如通用基因體行走套件組(BD生科公司克隆鐵克(Clontech)，加州保羅奧圖)所述之方法，而第二方法係根據史伯林瑞特(splinkerette)計畫進行，該計畫係摘述於Devon等人(1995)核酸研究23(9)：1644-1645，修改係如Stover(2001)加州大學愛文分校(個人通訊)所述。
簡言之，基因體DNA使用多種限剪酶(Dra I、EcoR V、Pvu II、Sma I、及Stu I用於通用基因體行走法；而BamH I、EcoR I、Hind III及Xba I用於史伯林瑞特方法)，然後接合至用於基因體行走法之鈍端配接子，以及結合至用於史伯林瑞特方法的限剪酶專一性配接子。兩種基因體行走法的配接子皆設計來防止PCR期間配接子的3’端的延長，如此可減少或消除非特異性擴大。則與配接子接合的基因體DNA片段被稱作為基因體行走存庫或史伯林瑞特存庫，每個限剪酶有一個存庫。存庫係從分離自三株個別B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7的植株；植株DAS-59122-7 T1S2 1、DAS-59122-7 T1S2 2及DAS-59122-7 T1S2 10、以及分離自一株Hi-II對照植株以及一株PH09B對照植株的基因體DNA製備而得。
於組成存庫後，完成巢套PCR擴大，來使用爾汶堤吉(Advantage)-GC基因體PCR套件組(BD生科公司克隆鐵克，加州保羅奧圖)擴大目標序列。一次PCR擴大係使用一個與配接子身分相同的引子以及一個基因專一性引子。配接子引子不會於一次PCR的第一週期擴大產物，而只會製造得自基因專一性引子的產物。來自配接子引子的煉合及擴大係出現於由基因專一性引子已經製造互補股之後。於一次PCR擴大後，進行二次巢套PCR反應來提高基因體PCR反應的專一性。巢套引子係由用於一次PCR的各別引子內部的基因專一性序列與配接子專一性序列所組成。
對於5’側出邊緣序列，使用所插入之T-DNA 5’端之專一性引子、連同與接合至經過消化DNA上的配接子序列互補的引子來引發。同理，3’側出邊緣序列，轉殖係始於所插入之T-DNA 3’端的專一性引子、和配接子序列互補的引子。T-DNA區內部的T-DNA右緣及左緣區序列內部的DNA序列，用作為玉米基因體序列「走出」的起點，原因在於該等序列表示可錨定基因體行走引子的獨特序列(非與內生性玉米基因體序列同源)。
藉巢套PCR製造的產物係藉瓊脂糖凝膠電泳分析(資料未顯示)。從一或多個品件DAS-59122-7 DNA樣本所製造的存庫中可見的片段，但該片段係不存在於從Hi-II及PH09B基因體DNA樣本所製備的存庫，該等片段經識別出用來進一步決定特徵。識別出的PCR放大片段係藉製備性凝膠電泳分離，使用QIAquick凝膠萃取套件組(快晶公司)分離，直 接送至定序，或使用pGEM-T易極載體系統I(普羅米加公司(Promega Corp.)，威斯康辛州馬里森)轉殖入pGEM-T易極質體載體內部，隨後進行DNA定序。定序反應係使用用於巢套PCR擴大的引子進行，或使用用於pGEM-T易極載體的專一性引子進行。所得序列用來設計額外基因專一性引子，來繼續「走出」進入未知的玉米基因體序列。進行多個回合的基因體行走，直到從T-DNA插子末端獲得至少500 bp邊緣序列為止。
為了確保側出邊緣序列的有效性，於得自品件DAS-59122-7的基因體DNA進行額外品件專一性PCR擴大。擴大的片段經過定序，來進一步從T-DNA插子區延伸序列的重疊區進入5’及3’邊緣基因體DNA。如表2顯示的引子係基於得自基因體行走實驗的序列設計，來擴大跨T-DNA與玉米基因體DNA的獨特接頭的片段。引子集合03-O-506/02-O-476(SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：9)跨5’接頭且擴大323 bp片段(由bp 2427至bp 2739，參考第1圖)；而引子集合02-O-447/03-O-577(SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：17)跨3’接頭，且擴大754 bp片段(由bp 9623至bp 10376，參考第1圖)。
為了證實插入玉米基因體DNA的序列，進行PCR來擴大、選殖及定序來自品件DAS-59122-7所插入的T-DNA。表3所示PCR引子集合(SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：5)；(SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：7)及(SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：3)用來擴大三個重疊片段，標示為22I-1(SEQ ID NO：25)、22I-2(SEQ ID NO：26)、22I-3(SEQ ID NO：27)；表示品件DAS-59122-7從T-DNA 5’區通過T-DNA 3’區的bp 2687至bp 9846的插子(參考第1圖)。PCR擴增子資訊報告於表3，引子序列列舉於表2。
PCR GC2爾汶堤吉聚合酶套件組(BD生科克隆鐵克公 司)係根據製造商的指示用來擴大插子片段(22I-1(SEQ ID NO：25)、22I-2(SEQ ID NO：26)、22I-3(SEQ ID NO：27))。簡言之，50微升反應含有5’引子及3’引子，終濃度為0.2 μM及40奈克基因體DNA。PCR反應係使用得自植株DAS-59122-7 T1S2 1及DAS-59122-7 T1S2 2的基因體DNA製備品重複建立。PCR條件如後：於95℃初步變性1分鐘，接著為35週期的94℃/95℃經歷30秒，55℃經歷30秒及68℃經歷5分鐘，最鐘於68℃延長6分鐘。於透過1%瓊脂糖凝膠於1X TBE(89mM Tris-硼酸鹽，2mM EDTA,pH 8.3)電泳後，使用伊西登溴(ethidium bromide)染色，於紫外光下目測觀察PCR擴大產物。
PCR片段(22I-1(SEQ ID NO：25)、22I-2(SEQ ID NO：26)、22I-3(SEQ ID NO：27)之純化方式，係從使用伊西登溴染色的0.8%瓊脂糖凝膠於1X TBE切下片段，使用快奎克凝膠萃取套件組(快晶公司)純化該片段。PCR片段係使用pGEM-T載體易極載體系統I(普羅米加公司)選殖入pGEM-T易極質體載體內。選殖後的片段係藉質體DNA的米你製備(可麗爾培旋轉迷你製備套件組(QIAprep Spin Miniprep Kit)，快晶公司)及使用Not I的限剪消化來證實。然後送出質體純株及/或純化後的PCR插子片段來進行完整插子的定序。定序反應係以設計對已知T-DNA序列有專一性的引子、或使用對用於pGEM-T易極載體有專一性的引子來進行。西格瑪吉諾西公司(Sigma-Genosys,Inc.)(德州兀蘭)合成全部PCR引子，以終濃度0.2-0.4μ M用於PCR反應。
PCR反應係使用分離自B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7、DAS-45214-4及DAS-45216-6的基因體DNA及未經修飾之對照種系Hi-II及PH09B進行，PCR反應用來證實(1)於品件DAS-59122-7的定序邊緣區存在有玉米基因體DNA，以及(2)於品件DAS-59122-7跨T-DNA插子與基因體DNA邊緣的接頭有品件專一性擴大。
設計用來於品件DAS-59122-7擴大插子側出邊緣序列的PCR引子，用來證實該等區存在於未經修改的對照種系以及存在於品件DAS-59122-7。試驗兩組引子各別用於5’邊緣及3’邊緣(共四組)。引子集合03-O-784/03-O-564(SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：14及03-O-784/03-O-543(SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：13)分別係用來擴大於品件DAS-59122-7從邊緣序列5’至T-DNA插子的136 bp片段及263 bp片段(第2圖及第3圖)。同理，引子集合03-O-569/03-O-577(SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：17)及03-O-570/03-O-542(SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：12)分別係用來從3’基因體邊緣擴大227 bp片段及492 bp片段(第2圖及第3圖)。
設計用來跨邊緣序列與T-DNA插子的接頭擴大片段用的引子，該引子用來對品件DAS-59122-7建立品件專一性PCR片段。對兩個接頭各別選用一個引子集合。引子集合03-O-784/02-O-215(SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：1)設計用來擴大跨5’接頭的555 bp片段；而引子集合02-O-219/03-O-577(SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：17)係設計用來擴大3’接頭的547 bp片段。基於內生性玉米反錄酶基因(Hurst等人，(1999)分 子育種5(6)：579-586)，一組引子IVR1(0197)(SEQ ID NO：39)5’-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3’及IVR2(0198)(SEQ ID NO：40)5’-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3’，用來產生226 bp擴大產物，作為全部玉米基因體DNA樣本的內部陽性對照。
全部PCR引子皆係由西格瑪吉諾西公司合成，以終濃度0.2-0.4 μM用於PCR反應。PCR引子序列列舉於表2。用於PCR擴大，爾汶堤吉-GC 2 PCR套件組(BD生科公司)係根據製造商的指示來使用。每50微升PCR反應使用約10-100奈克基因體DNA樣板。PCR條件如後：最初樣本於94℃變性5分鐘，接著為35週期，95℃經歷1分鐘，60℃經歷2分鐘及72℃經歷3分鐘，最後於72℃延長7分鐘。於透過1%瓊脂糖凝膠電泳後，使用1X TBE及伊西登溴染色，於紫外光下目測觀察PCR擴大產物。
對品件DAS-59122-7的T-DNA插子及邊緣區所得的序列資料使用Seqman II軟體4.0.5版本(DNA史達公司(DNAStar,Inc.)，威斯康辛州馬里森)檢討與組譯。存在於品件DAS-59122-7的插子側出的5’及3’邊緣序列用來對基因存庫(GenBank)公開資料庫進行同源性搜尋，俾便進一步決定玉米基因體中的插入位置。識別於品件DAS-59122-7介於側出邊緣與T-DNA插子間的接頭區的開放讀取框之分析係使用Vector NTI 8,0(英弗美斯公司(InforMax,Inc.)，馬里蘭州非德瑞克)進行。
共證實11922 bp得自品件DAS-59122-7的基因體DNA 序列(參考第1圖)。於T-DNA插子的5’端，識別2593 bp側出邊緣序列，從衍生自基因體行走實驗的片段而於3’端獲得1986 bp側出邊緣序列。共7160 bp T-DNA插子經過選殖及使用PCR引子集合定序，該PCR引子集合係設計用來擴大三個重疊片段分別標示為22I-1(2501 bp)(SEQ ID NO：25)、22I-2(3027 bp)(SEQ ID NO：26)及22I-3(2830 bp)(SEQ ID NO：27)表示對品件DAS-59122-7從bp 2687至bp 9846之從T-DNA 5’區至T-DNA插子3’區的序列(參考第1圖)。T-DNA插子區的其餘部分係從二PCR片段定序，亦即O506/O476(SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：9)及O447/O557(SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：17)其分別跨距具有玉米基因體DNA的T-DNA插子的5’接頭及3’接頭。引子係基於得自基因體行走實驗的序列設計，用來擴大跨具有玉米基因體DNA的T-DNA獨特接頭的片段。引子集合03-O-506/03-O-476(SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：9)跨5’接頭，擴大的313 bp片段(得自bp 2427至bp 2739)；以及引子集合03-O-447/03-O-577(SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：17)跨3’接頭及擴大754 bp片段(由bp 9623至bp 10376)。組合共計選殖及定序7343 bp品件DAS-59122-7的T-DNA插子(由bp 2594至bp 9936，參見第1圖)，且與轉形質體PHP17662的序列作比較。於bp 6526與bp 6562的兩個核苷酸差異係於T-DNA插子的未經轉譯的小麥過氧化酶啟動基因區觀察(參考第1圖)。觀察得的鹼基變化皆不影響T-DNA插子的開放讀取框的組成。發現T-DNA插子的3’端區及5’端區為完好，但分別刪除涵蓋右及左 T-DNA邊緣區的5’端最末22 bp以及3’端最末25 bp。雖然已知T-DNA邊緣序列於T-DNA插入基因體扮演關鍵角色，但此項結果並非出乎意外，原因在於插入經常為不完美，特別於左T-DNA邊緣經常不完美(Tinland(1996)植物科學趨勢1(6)：178-184)。
品件DAS-59122-7的基因體邊緣區進行BLAST(基本局部校準搜尋工具)顯示與公開可得的序列的同源性有限(公開138.0基因存庫，2003年10月25日)。分析5’邊緣區，發現兩區與玉米基因體序列及EST(表現序列標籤)序列有顯著同源性。第一區涵蓋179 bp(邊緣序列的bp 477至bp 655)顯示與藉各種EST校準獲得的若干分子標記、染色體序列、及同位序列顯示相似性。第二區係出現於5’邊緣序列的bp 1080至bp 1153(74 bp)，顯示與多種不同玉米EST及基因體序列的相似性。3’邊緣區也具有與植物DNA序列相似的兩個小型非連續區。162 bp(bp 9954至bp 10115)的內3’區顯示與兩個基因體玉米姿亞美斯(Zea mays)酒精去氫酶(adhl)基因之3’未轉譯端的相似性，以及與若干EST同位序列的相似性。3’邊緣中央的較小型區(57 bp)(bp 10593至bp 10649)顯示與得自多個玉米基因體序列的非邊碼區的相似性。
整體言之，於基因體邊緣序列，於得自相同已知序列的多於一個同源區皆未發現大於179鹼基對的同源區。個別存取顯示與品件DAS-59122-7邊緣序列的相似性，經檢視來判定於品件DAS-59122-7的插入是否出現於特徵化蛋白質編碼序列。於任何已知蛋白質編碼序列內部皆未出現類似 性區。整個轉形質體序列PHP17662與品件DAS-59122-7邊緣序列的局部校準，未顯示顯著同源性，表示T-DNA插子的側出邊緣區未含轉形質體片段。因此由於對已知序列不存在有顯著同源區，故品件DAS-59122-7的插入序列側出的基因體位置的識別與特徵化受限制。
玉米基因體邊緣序列與品件DAS-59122-7的T-DNA插子間的5’接頭區及3’接頭區分析是否存在有新穎開放讀取框。於5’或3’邊緣接頭區並未識別有顯著大小(大於100個胺基酸)的開放讀取框，指示未因T-DNA插入結果而產生新穎的開放讀取框。此外，同源性搜尋並未指示於邊緣區存在有內生性玉米開放讀取框，可能已經於B.t. Cry34/35 Ab1品件DAS-59122-7的T-DNA插入時被岔斷。
實施例5. PCR引子
DNA品件專一性引子對用來產生DAS-59122-7診斷用的擴增子。此等品件引子對包括但非限於SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：9；及SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：17；及SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37。除了此等引子對之外，任何由SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22所衍生而得之引子對其當用於DNA擴大反應時可產生品件DAS-59122-7的DNA擴增子診斷的引子對皆屬於本發明之具體例。使用DNA引子或其互補序列而對此等方法作任何修改來產生DAS-59122-7的擴增子DNA分子診斷也屬於熟諳技藝人士的技巧範圍。此外，用於擴大內生性玉米基因之包括 IVR1(O197)/IVR2(O198)(SEQ ID NO：39/SEQ ID NO：40)的對照引子對係含括作為反應條件的內部標準。
植物組織DNA萃取物分析來測試是否存在有DAS-59122-7品件包括陽性組織DNA萃取物對照(已知含有轉殖基因序列的DNA樣本)。也須含括陽性對照成功地擴大，驗證PCR係於允許目標序列擴大的條件下操作，其中提供樣板DNA的陰性或野生型DNA萃取對照為從非轉殖基因植株所製備的基因體DNA，或為非DAS-59122-7轉殖基因植株。此外，未含樣板玉米DNA萃取物之陰性對照係屬於PCR計畫中使用的反應劑及條件的有用的量表。
額外有足夠長度的DNA引子分子係由DNA擴大方法之熟諳技藝人士選自於SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22，其條件係對於產生品件DAS-59122-7的診斷用擴增子加以優化的條件。使用此等有修改的DNA引子序列於實施例所示方法係屬於本發明之範圍。至少一個衍生自SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的夠長的DNA引子分子屬於品件DAS-59122-7的診斷之該擴增子也屬於本發明之具體例。至少一個衍生自PHI17662A之基因元體的夠長的DNA引子分子屬於品件DAS-59122-7的診斷之該擴增子也屬於本發明之具體例。擴增子的檢定分析可使用史崔吉克羅伯賽克勒(Stratagene Robocycler)、MJ引擎(MJ Engine)、伯京艾瑪(Perkin-Elmer)9700或伊本朵夫主循環器(Eppendorf Mastercycler)梯度熱循環器或藉熟諳技藝人士已知之方法及裝置進行。
已經舉例說明本發明之原理，熟諳技藝人士顯然易知可未悖離此等原理而於排列及細節上做修改。發明人對屬於隨附之申請專利範圍的精髓及範圍內的全部修改例皆請求專利。
本說明書所引述的全部的公開文獻及公開專利文件皆以引用方式併入此處彷彿個別公開文獻或專利申請案已經特地個別併入本文以供參考。
第1圖為DNA序列(SEQ ID NO：23)顯示轉殖基因插子PHI17662A及轉殖基因插子的側出序列。5’及3’邊緣區亦即bp 1至bp 2593及bp 9937至bp 11922分別於下方畫線。基於與轉形質體PHP17622比較，發現兩個核苷酸差異(bp 6562及bp 6562)以粗體字與下方畫線標示。
第2圖為B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7插子區之示意圖被劃分成為三個分開區段：帶有玉米基因體DNA之5’邊緣區、完好T-DNA插子、及帶有玉米基因體DNA之3’邊緣區。插子圖下方的兩個箭頭表示由5’及3’基因體行走片段衍生而得的序列之起點及終點。於插子圖下方的其它方框表示由品件DAS-59122-7的基因體DNA擴大且經過定序涵蓋完好T-DNA插子及5’及3’插子/邊緣接合區的PCR片段。
第3圖為B.t. Cry34/35Ab1品件DAS-59122-7插子區之示意圖被劃分成為三個分開區段：帶有玉米基因體DNA之5’邊緣區、完好T-DNA插子及帶有玉米基因體DNA之3’邊 緣區。插子圖下方的方框表示位在基因體邊緣區或跨帶有玉米基因體DNA的T-DNA插子之5’及3’接合區而係從得自品件DAS-59122-7之基因體DNA擴大的PCR片段。
<110> 先鋒海-布瑞德國際股份有限公司 陶氏農業科學公司 杜邦公司
<120> 玉米品件DAS-59122-7及測定該品件的方法
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<151> 2004-09-29
<160> 40
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 1
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<223> 寡核苷酸引子
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<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<212> DNA
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<223> 寡核苷酸引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<212> DNA
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<223> 寡核苷酸引子
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<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
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<223> 寡核苷酸引子
<400> 14
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<223> 寡核苷酸引子
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<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
<400> 16
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 寡核苷酸引子
<400> 17
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 18
<210> 19
<211> 2593
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DAS-59122-7之5’側出序列。
<400> 19
<210> 20
<211> 1986
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DAS-59122-7之3’側出序列。
<400> 20
<210> 21
<211> 3594
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 表示PHI17662A插子之一部分及插子之5’側出序列之序列。
<400> 21
<210> 22
<211> 2987
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 表示PHI17662A插子之一部分及插子之3’側出序列之序列。
<400> 22
<210> 23
<211> 11922
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 表示插子之完整序列及品件DAS-59122-7之完整序列之側出區之序列。
<400> 23
<210> 24
<211> 7390
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 本序列表示用來轉形玉米種系DAS-59122-7及表示插子PHI 17662A之DNA 分子。
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> T-DNA右緣
<221> misc_feature
<222> (7366)...(7390)
<223> T-DNA左緣
<400> 24
<210> 25
<211> 2501
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子22I-1
<400> 25
<210> 26
<211> 3027
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子22I-2.
<400> 26
<210> 27
<211> 2830
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子22I-3.
<400> 27
<210> 28
<211> 136
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O784/O564
<400> 28
<210> 29
<211> 263
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O784/O543
<400> 29
<210> 30
<211> 227
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O569/O577
<400> 30
<210> 31
<211> 492
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O570/O542
<400> 31
<210> 32
<211> 555
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O784/O215
<400> 32
<210> 33
<211> 547
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O219/O577
<400> 33
<210> 34
<211> 243
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O506/O476
<400> 34
<210> 35
<211> 754
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> PCR擴增子O447/O577
<400> 35
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 36
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 37
<210> 38
<211> 104
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> SEQ ID NOs：36及37之擴增子
<400> 38
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 用來產生226 bp擴增子作為內部陽性對照之IVR1(0917)引子
<400> 39
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 用來產生226 bp擴增子作為內部陽性對照之IVR2(0918)引子
<400> 40

Claims (29)

  1. 一種單離的DNA分子，其係選自於由下列組成之組群：a)SEQ ID NO：23之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：21之核苷酸序列；及c)SEQ ID NO：22之核苷酸序列。
  2. 一種檢測品件DAS-59122-7專一性區來識別生物樣本中的品件DAS-59122-7之套件組，該套件組包含一引子對，其可偵測一DAS-59122-7專一性區，該引子對係由第一引子及第二引子所組成，其中該第一引子及該第二引子係選自由下述所組成的群組：a)第一引子，其可煉合(annealing)至SEQ ID NO：19之核苷酸序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：20之核苷酸序列或其互補序列；b)第一引子，其可煉合至SEQ ID NO：19之核苷酸序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：24之核苷酸序列或其互補序列；c)第一引子，其可煉合至SEQ ID NO：20之核苷酸序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：24之核苷酸序列或其互補序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之套件組，其中該第一引子及第二引子分別選自於由如下所組成之組群：a)SEQ ID NO：18之序列和SEQ ID NO：1之序列；b)SEQ ID NO：10之序列和SEQ ID NO：9之序列；c)SEQ ID NO：2之序列和SEQ ID NO：17之序列； d)SEQ ID NO：8之序列和SEQ ID NO：17之序列；及e)SEQ ID NO：36之序列和SEQ ID NO：37之序列。
  4. 一種識別於生物樣本之品件DAS-59122-7之套件組，該套件組包含一專一性辨識玉米品件DAS-59122-7的專一性探針，該專一性探針包含一序列，該序列係可與連續選自於由下列所組成之組群之序列雜交：a)一序列，包含SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：24之連續序列；b)一序列，包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24之連續序列(contiguous sequence)；及c)一序列，其係上述a)或b)序列的互補序列。
  5. 一種於生物樣本中識別品件DAS-59122-7之方法，包含藉由下述方法檢測DAS-59122-7專一性區：使用聚合酶連鎖反應以至少兩個引子擴大得自存在於該生物樣本中的核酸之DNA片段，其中該至少兩個引子之第一引子與第二引子係選自由下述所組成的群組：a)第一引子，其可煉合至SEQ ID NO：19之核苷酸序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：20之核苷酸序列或其互補序列；b)第一引子，其可煉合至SEQ ID NO：19之核苷酸序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：24之核苷酸序列或其互補序列；c)第一引子，其可煉合至SEQ ID NO：20之核苷酸 序列或其互補序列；第二引子，其可煉合至SEQ ID NO：24之核苷酸序列或其互補序列。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一引子及第二引子分別包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：1之序列。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一引子及第二引子分別包含SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：9之序列。
  8. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一引子及第二引子分別包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：17之序列。
  9. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一引子及第二引子分別包含SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：17之序列。
  10. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一引子及第二引子分別包含SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37之序列。
  11. 如申請專利範圍第6項之方法，包含使用DAS-59122-7 PCR識別方案來擴大約555 bp的片段。
  12. 如申請專利範圍第7項之方法，包含使用DAS-59122-7 PCR識別方案來擴大約313 bp的片段。
  13. 如申請專利範圍第8項之方法，包含使用DAS-59122-7 PCR識別方案來擴大約547 bp的片段。
  14. 如申請專利範圍第9項之方法，包含使用DAS-59122-7 PCR識別方案來擴大約754 bp的片段。
  15. 如申請專利範圍第10項之方法，包含使用DAS-59122-7PCR識別方案來擴大約104 bp的片段。
  16. 一種檢測生物樣本中存在有玉米品件DAS-59122-7或其子代之方法，包含： (a)從該生物樣本萃取DNA樣本；(b)提供選自於下列所組成之組群中之一對DNA引子分子：i)SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：1之序列；ii)SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：9之序列；iii)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：17之序列；及iv)SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：17之序列；(c)提供DNA擴大反應條件；(d)進行DNA擴大反應，藉此製造DNA擴大分子；以及(e)檢測DNA擴大分子，其中於DNA擴大反應中檢測得DNA擴大分子，表示存在有玉米品件DAS-59122-7。
  17. 一種單離的DNA分子，包含經由如申請專利範圍第16項之方法所製造的擴增子。
  18. 一種單離的DNA核苷酸引子序列，包含選自於由下列所組成之組群之序列：SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36及37或其互補序列。
  19. 如申請專利範圍第19項之單離的DNA核苷酸引子序列，包含選自於由下列組成之組群之序列：SEQ ID NOs：1、2、8、9、10、17及18或其互補序列。
  20. 一種包含接合序列之單離的DNA分子，包含選自於由SEQ ID NO：32、33、34及35及其互補序列所組成之組群中之序列。
  21. 一種驗證種子純度之方法，包含於種子樣本中，使用可專一性辨識於SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22內部之序列的專一性引子或探針來檢測DAS-59122-7專一性區。
  22. 一種篩檢種子是否存在有品件DAS-59122-7之方法，包含於種子批料樣本中，使用可專一性辨識於SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22內部之序列的專一性引子或探針來檢測DAS-59122-7專一性區。
  23. 一種製造昆蟲抗性玉米植物之方法，包含：a)培育一種製造昆蟲抗性玉米植物或其世系植物，其中下述DNA形成了該植物基因組的一部份，該DNA係具有至少一選自由SEQ ID NO：21、22、23、32、33、34及35及其互補序列所構成之群組的核苷酸序列；以及b)經由分析選自於由SEQ ID NO：32、33、34及35及其互補序列所組成之組群的至少一個核苷酸序列來選出其子代。
  24. 一種檢測於玉米組織是否存在有DAS-59122-7品件插入之方法，包含：(a)選出引子對，其係選自於由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36及37及其互補序列所組成之組群，其中該引子對的各個成員係位於可供診斷該DAS-59122-7品件插入之序列的相對兩側上； (b)該玉米組織樣本與該引子對接觸；(c)進行DNA擴大與分析擴增子。
  25. 一種檢測玉米組織是否存在有DAS-59122-7品件插入之方法，包含：(a)該玉米組織樣本接觸多核苷酸探針，該探針於高度嚴苛雜交條件下可與選自於由SEQ ID NO：32、33、34及35及其互補序列所組成之組群中之一個或多個DNA序列雜交；(b)將該樣本及探針置於高度嚴苛雜交條件下；以及(c)分析探針的雜交。
  26. 一種DNA檢測套件組，包含多核苷酸探針，該探針於嚴苛雜交條件下可與選自於由SEQ ID NO：32、33、34及35及其互補序列所組成之組群中之一個或多個DNA序列雜交。
  27. 一種DNA檢測套件組，其包含一選自於由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36及37及其互補序列所組成之組群的引子對，其中該引子對的各個成員係位於序列的相對兩側上以供診斷該DAS-59122-7品件插入。
  28. 一種於生物樣本識別DAS-59122-7之套件組，其係檢測在SEQ ID NO：23內部的DAS-59122-7專一性區，該套件組包含一選自於由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36及37及 其互補序列所組成之組群的引子對。
  29. 一種於生物樣本識別DAS-59122-7之方法，其係檢測在SEQ ID NO：23內部的DAS-59122-7專一性區，該套件組包含一選自於由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36及37及其互補序列所組成之組群的引子對。
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