KR20070059196A - 옥수수 이벤트 ｄａｓ-59122-7 및 그의 탐지 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형질전환 해충 저항성 옥수수 식물에 관한 DNA 조성물을 제공한다. 또한, 옥수수 게놈 내로 삽입된 재조합 구조물의 DNA 서열과, 삽입 부위를 플랭킹하는 DNA 서열에 기초하여, 옥수수 DAS-59122-7 이벤트의 존재 여부를 탐지하는 검정이 제공된다. 이러한 검정을 수행하는데 유용한 키트와 조건이 제공된다.
형질전환 해충 저항성 옥수수 식물, DAS-59122-7 이벤트

Description

옥수수 이벤트 ＤＡＳ-59122-7 및 그의 탐지 방법 {Corn Event DAS-59122-7 and Methods for Detection Thereof}
본 발명의 양태는 식물 분자 생물학 분야에 관한 것이고, 구체적으로 본 발명의 양태는 식물에 해충 저항성 (insect resistance)을 부여하기 위한 DNA 구조물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 양태는 해충 저항성 옥수수 식물 DAS-59122-7, 및 그의 샘플 및 조성물 중에 옥수수 식물 DAS-59122-7 DNA가 존재하는지를 탐지하기 위한 검정법에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 해충 저항성 옥수수 (제아 마이스: Zea mays) 식물 DAS-59122-7 (이는 옥수수 계통 DAS-59122-7 또는 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로서 지칭되기도 한다); 옥수수 식물 DAS-59122-7의 DNA 식물 발현 구조물; 및 옥수수 식물 DAS-59122-7 및 그의 자손에게서 형질전환유전자 (transgene)/플랭킹 (flanking) 삽입 영역을 탐지하는 것에 관한 것이다.
옥수수는 중요한 작물이고 전 세계 여러 지역에서 주요 식품원으로 이용되고 있다. 화학적 살충제와 같은 보호 조치를 취함에도 불구하고, 전 세계 옥수수 작물 손실에 있어서의 주요 원인은 해충에 의한 피해이다. 이러한 관점에서, 해충 피해를 방제하고 전통적인 화학적 살충제에 대한 필요성을 감소시키기 위해, 옥수 수 등의 작물을 유전 공학적으로 처리하여 해충 저항성을 부여하였다. 형질전환 (transgenic) 해충 저항성 작물을 생산하기 위해 활용되어 온 유전자들 중의 하나가 바실루스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis: B.t.)로부터의 델타-내독소이다. 델타-내독소는 옥수수 뿐만 아니라 목화, 감자, 벼, 해바라기 등의 작물에도 성공적으로 발현되었고, 해충 전반에 걸쳐 탁월한 방제를 제공하는 것으로 입증되었다 [참고: Perlak, F.J. et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; PCT 공개특허공보 WO 01/13731; and Bing JW et al. (2000) Efficacy of CryIF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO].
외래 유전자가 식물에서 발현하는 것은 식물 게놈 내에서의 그의 위치에 의해 영향을 받는 것으로 공지되어 있는데, 이는 염색질 구조 (예: 이종-염색질) 때문이거나 전사 조절 요소 (예: 증강인자)가 통합 부위에 아주 근접하여 위치하기 때문인 것으로 추정된다 [참고: Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988]. 이와 동시에, 형질전환유전자가 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 것은 식물의 전반적인 표현형에 상이한 방식으로 영향을 미칠 것이다. 이러한 이유로 인해, 관심있는 도입된 유전자를 최적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 이벤트 (event)를 확인 (동정)하기 위해서는 다수의 이벤트를 스크리닝하는 것이 종종 필 요하다. 예를 들어, 식물 및 기타 유기체에서는, 이벤트들 간에 도입된 유전자의 발현 수준에 광범위한 차이 (변동)이 있을 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 공간적 또는 시간적 발현 패턴 상의 차이, 예를 들어 각종 식물 조직 내에서의 형질전환유전자의 상대적 발현 상의 차이가 있을 수 있는데, 이는 도입된 유전자 구조물 내에 존재하는 전사 조절성 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다. 이러한 이유로 인해, 수백 내지 수천 가지의 상이한 이벤트를 생성시키고, 이들 이벤트를 대상으로 하여 상업적 목적에 요망되는 형질전환유전자 발현 수준과 패턴을 나타내는 단일 이벤트를 스크리닝하는 것이 통상적이다. 목적하는 형질전환유전자 발현 수준 또는 패턴을 나타내는 이벤트는, 통상적인 육종 방법을 사용하여 유성 이계-교배함으로써 형질전환유전자를 다른 유전적 배경 내로 유전자 이입하는데 유용한다. 이러한 교배 자손은 본래 형질전환체의 형질전환유전자 발현 특징을 유지하고 있다. 이러한 전략을 사용하여 국소 생육 환경에 잘 맞도록 적응시킨 수 많은 변종에서 신뢰할 만한 유전자 발현을 보장한다.
유성 교배 자손이 관심있는 형질전환유전자를 함유하고 있는지를 결정하기 위해, 특정한 이벤트가 존재하는지를 탐지할 수 있는 것이 유리할 것이다. 또한, 특정한 이벤트를 탐지하는 방법은 시장에 출하하기 전에 승인을 받아야 하는 규정에 따르고, 예를 들어 재조합 작물로부터 유래된 식품에 라벨을 붙여 분류하는데 도움을 주거나, 또는 대상체가 규제 또는 계약 조항에 따르도록 하는데 사용할 뿐만 아니라 환경적으로 모니터링하거나, 현지 작물의 특징을 모니터링하거나 또는 작물 수확으로부터 유래된 생성물을 모니터링하는데 사용하기 유용할 것이다.
핵산 프로브를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 DNA 혼성화를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 모든 핵산 탐지 방법에 의해 형질전환유전자의 존재 여부를 탐지하는 것이 가능하다. 이들 탐지 방법은 일반적으로, 자주 사용되고 있는 유전적 요소들, 예를 들어 프로모터, 종결인자, 마커 유전자 등에 촛점을 맞추고 있는데, 이는 많은 DNA 구조물의 경우에는 암호화 영역이 상호 교환가능하기 때문이다. 그 결과, 상기 방법들은 삽입된 이종 DNA와 인접한 플랭킹 DNA의 DNA 서열이 공지되어 있지 않은 경우에는, 특히 동일한 DNA 구조물 또는 극히 유사한 구조물을 사용하여 생성시킨 상이한 이벤트들 간을 식별하는데 유용하지 않을 수 있다. 예를 들어, 엘리트 (elite) 이벤트 GAT-ZMl을 탐지하기 위한 이벤트-특이적 PCR 검정이 미국 특허 제6,395,485호에 기재되어 있다. 따라서, 이벤트 DAS-59122-7을 확인 (동정)하기 위한 간단하고도 차별적인 방법이 요망된다.
발명의 요약
본 발명의 양태는 해충 저항성 단자엽 작물을 생성 및 선별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 식물 세포 및 식물에서 발현된 경우에 해충 저항성을 부여해주는 DNA 구조물이 제공된다. 본 발명의 한 국면에 따르면, 식물 세포 및 식물에서 발현된 경우에 이러한 식물 세포 및 식물에 해충 저항성을 부여해주는, 숙주 세포 내로 도입되어 복제할 수 있는 DNA 구조물이 제공된다. 이러한 DNA 구조물은 PHI17662A로 명명된 DNA 분자로 구성되고, 이에는 3개의 형질전환유전자 발현 카세트가 포함된다. 제1 발현 카세트는 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인 자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry34Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,127,180호, 제6,624,145호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 프로모터, 5' 비해독 엑손, 및 옥수수 유비퀴틴 (Ubi-1) 유전자의 제1 인트론을 포함하는 DNA 분자 [참고: Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 and Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218]를 포함한다. DNA 구조물의 제2 형질전환유전자 발현 카세트는 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry35Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,083,499호, 제6,548,291호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 밀 (wheat) 퍼옥시다제 프로모터를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174]를 포함한다. DNA 구조물의 제3 형질전환유전자 발현 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S로부터의 3' 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]에 작동가능하게 연결된, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 유전자를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70:25-37]에 작동가능하게 연결된, (CaMV) 35S 프로모터의 DNA 분자 [참고: Odell J.T. et al (1985) Nature 313:810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]를 포함한다. 이러한 DNA 구조물을 함유하는 식물이 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, DAS-59122-7로 명명된 신규한 옥수수 식물을 확인하기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이러한 방법은 DAS-59122-7의 5' 및/또는 3' 플랭킹 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브를 기초로 한다. PCR 반응에 활용된 경우에 형질전환 이벤트 DAS-59122-7에 대해 독특한 앰플리콘 (amplicon)을 생성시킬 프라이머 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공된다. 이들 분자는 다음 서열들 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다:
Figure 112007032172130-PCT00001
이들 분자를 포함하는 옥수수 식물 및 종자가 본 발명의 한 양태이다. 추가 로, DAS-59122-7 이벤트를 확인하기 위해 이들 프라이머 서열을 활용하는 키트가 제공된다.
본 발명의 부가의 양태는 본원에 기재된 DAS-59122-7의 특이적 플랭킹 서열에 관한 것인데, 이는 생물학적 샘플 중에서 DAS-59122-7을 특이적으로 확인하는 방법을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 보다 특히, 본 발명은 DAS-59122-7의 5' 및/또는 3' 플랭킹 영역, 즉 서열 19, 5' 플랭킹 영역 및 서열 20, 3' 플랭킹 영역에 관한 것인데, 이는 특이적 프라이머와 프로브를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태는 상기 특이적 프라이머와 프로브의 사용을 기초로 하여, 생물학적 샘플 중에 DAS-59122-7이 존재하는지를 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 특정 샘플 중에서 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 상응하는 DNA의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출된 게놈성 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용된 경우에, 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시키는 DNA 프라이머 세트를, DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및 (c) 이러한 앰플리콘을 탐지하는 단계를 포함한다.
신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 21, 5' 플랭킹 + 1000개 내부 서열 및 서열 22, 3' 플랭킹 + 1000개 내부 서열을 포함하고, 서열 21 및 서열 22와 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 분자가 본 발명의 한 양태이다.
신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 21을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 한 양태이다. 옥수수 식물 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘 생성물을 생성시키기 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열 21의 옥수수 식물 DAS-59122-7로부터의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 옥수수 게놈 및/또는 플랭킹 서열과, 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 형질전환유전자 삽입물 서열을 포함하는 DNA 서열이 포함된다.
또한, 신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 22를 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 옥수수 식물 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘 생성물을 생성시키기 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열 22의 옥수수 식물 DAS-59122-7로부터의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 옥수수 게놈 및/또는 플랭킹 서열과, 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 형질전환유전자 삽입물 서열을 포함하는 DNA 서열이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열 21 또는 그의 상보체의 DNA 서열의 형질전환유전자 부분의 적어도 11개 이상의 뉴클레오티드와, 서열 21 또는 그의 상보체의 유사한 길이의 5' 플랭킹 옥수수 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열이 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생성된 앰플리콘이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자이다. 따라서, 본 발명의 양태에는 또한, 서열 21과 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열 22 또는 그의 상보체의 DNA 서열의 형질전환유전자 부분의 적어도 11개 이상의 뉴클레오티드와, 서열 22 또는 그의 상 보체의 유사한 길이의 3' 플랭킹 옥수수 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열이 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생성된 앰플리콘이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자이다. 따라서, 본 발명의 양태에는 또한, 서열 22와 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘이 포함된다.
보다 구체적으로는, DNA 프라이머 세트를 포함하는 DNA 분자 쌍이 본 발명의 양태인데, 이러한 DNA 분자는 서열 18 또는 그의 상보체와 서열 1 또는 그의 상보체; 서열 2 또는 그의 상보체와 서열 17 또는 그의 상보체; 서열 10 또는 그의 상보체와 서열 9 또는 그의 상보체; 서열 8 또는 그의 상보체와 서열 17 또는 그의 상보체; 및 서열 36 또는 그의 상보체와 서열 37 또는 그의 상보체로서 확인된다.
본 발명의 추가 양태에는 서열 18과 서열 1의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 2와 서열 17의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 10과 서열 9의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 8과 서열 17의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 및 서열 36과 서열 37의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘이 포함된다.
본 발명의 추가 양태에는 다음 프라이머가 포함되는데, 이들은 이벤트 DAS-59122-7를 탐지하거나 성상 확인하는데 유용하다: 서열 11 또는 그의 상보체; 서열 5 또는 그의 상보체; 서열 4 또는 그의 상보체; 서열 7 또는 그의 상보체; 서열 6 또는 그의 상보체; 서열 3 또는 그의 상보체; 서열 18 또는 그의 상보체; 서열 14 또는 그의 상보체; 서열 13 또는 그의 상보체; 서열 15 또는 그의 상보체; 서열 17 또는 그의 상보체; 서열 16 또는 그의 상보체; 및 서열 12 또는 그의 상보체. 추 가의 양태에는 또한, 상기 열거된 프라이머들의 쌍을 형성함으로써 생성된 앰플리콘이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 엄격한 혼성화 조건 하에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출한 DNA와 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 옥수수 식물 DNA와는 혼성화하지 않는 DNA 프로브 분자를, 옥수수 식물로부터 추출한 DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 이러한 샘플과 프로브에 엄격한 혼성화 조건을 적용하는 단계; 및 (c) 상기 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 탐지하는 단계를 포함하여, 특정 샘플 중에서 DAS-59122-7 이벤트에 상응하는 DNA 분자의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다. 보다 구체적으로는, (a) DAS-59122-7 이벤트에 대해 독특한 서열, 예를 들어 연접부 서열로 이루어진 DNA 프로브 분자 [이러한 DNA 프로브 분자는 엄격한 혼성화 조건 하에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출한 DNA와 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 옥수수 식물 DNA와는 혼성화하지 않는다]를, 옥수수 식물로부터 추출한 DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 이러한 샘플과 프로브에 엄격한 혼성화 조건을 적용하는 단계; 및 (c) 상기 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 탐지하는 단계로 이루어진, 특정 샘플 중에서 DAS-59122-7 이벤트에 상응하는 DNA 분자의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다.
또한, 서열 23 내의 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는, 특정 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 키트 및 방법이 제공된다.
서열 32, 33, 34 및 35, 및 그들의 상보체로 이루어진 군 중에서 선택된 DAS-59122-7의 하나 이상의 연접부 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공되는데, 연접부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종 DNA와, 삽입 부위를 플랭킹하는 옥수수 세포로부터의 DNA, 즉 플랭킹 DNA 간의 연접부에 걸쳐 있고, DAS-59122-7 이벤트에 대한 진단인자이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 해충에 대한 저항성을 부여해 주는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 제1의 모 옥수수 계통과, 해충 저항성이 결여된 제2의 모 옥수수 계통을 유성 교배함으로써, 복수 개의 자손 식물을 생성시키는 단계; 및 (b) 해충 저항성인 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하여, 해충 저항성 옥수수 식물을 생성시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 자손 식물을 제2의 모 옥수수 계통과 역교배시켜 해충 저항성인 진성 (true)-육종 옥수수 식물을 생성시키는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 옥수수 세포를 DNA 구조물 PHIl7662A (서열 24)로 형질전환시키는 단계; 이와 같이 형질전환시킨 옥수수 세포를 옥수수 식물로 성장시키는 단계; 해충에 대한 저항성을 나타내는 옥수수 식물을 선별하는 단계; 및 옥수수 식물을 번식력이 있는 (fertile) 옥수수 식물로 추가로 성장시키는 단계를 포함하여, 해충에 대해 저항성인 옥수수 식물을 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 번식력이 있는 옥수수 식물은 자가 수분할 수 있거나 또는 상용성인 옥수수 변종과 교배하여 해충 저항성 자손을 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 추가로, 생물학적 샘플 중에서 옥수수 이벤트 DAS-59122-7를 확인하기 위한 DNA 탐지용 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 PCR 확인 프로토콜에 사용하기 위한, DAS-59122-7의 5' 또는 3' 플랭킹 영역을 특이적으로 인식하는 제1 프라이머와, DAS-59122-7의 외래 DNA 내의 서열 또는 플랭킹 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 제2 프라이머를 포함한다. 본 발명의 추가의 양태는 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 키트에 관한 것이고, 이러한 키트는 이벤트 DAS-59122-7의 특이적 영역과의 서열 동일률이 80% 내지 100%인 서열과 상응하거나 이에 상보적인 서열을 갖는 특이적 프로브를 포함한다. 이러한 프로브 서열은 이벤트 DAS-59122-7의 5' 또는 3' 플랭킹 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응한다.
본 발명의 양태에 포괄되는 방법 및 키트는 상이한 목적을 위해, 예를 들어 식물, 식물성 재료 또는 생성물 [이에는 식물성 재료를 포함하거나 이로부터 유래된 식품 또는 사료 생성물 (신선하거나 가공됨)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다] 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위하여 사용될 수 있고; 부가적으로 또는 또 다른 한편으론, 상기 방법 및 키트를 사용하여, 형질전환 재료와 비-형질전환 재료 간을 분리시킬 목적으로 형질전환 식물성 재료를 확인할 수 있으며; 부가적으로 또는 또 다른 한편으론, 상기 방법 및 키트를 사용하여, 옥수수 이벤트 DAS-59122-7을 포함하는 식물성 재료의 질을 결정할 수 있다. 키트는 또한, 탐지 방법을 수행하는데 필요한 시약과 재료를 함유할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 DAS-59122-7 옥수수 식물 또는 그의 일부에 관한 것인데, 그의 일부에는 옥수수 식물 DAS-59122-7 및 그로부터 유래된 자손의 화분, 배주, 생장 세포, 화분 세포 핵, 및 난 세포 핵이 포함되지만, 이에 제한되지 않는 다. DNA 프라이머 분자가 특이적 앰플리콘 생성물을 제공하는 옥수수 식물 및 종자 DAS-59122-7이 본 발명의 특정 양태이다.
본 발명의 상기 국면 및 기타 국면은 다음의 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1. 형질전환 삽입물 PHI17662A를 나타내는 DNA 서열 (서열 23) 뿐만 아니라 이러한 형질전환 삽입물을 플랭킹하는 서열을 도시한 것이다. 5' 및 3' 경계 영역, bp 1 내지 bp 2593, 및 bp 9937 내지 bp 11922가 각각 밑줄처져 있다. 형질전환 플라스미드 PHP17662와의 비교를 기초로 한 2개의 뉴클레오티드 차이 (bp 6526과 bp 6562)가 진하게 밑줄처져 있다.
도 2. B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7 삽입물 영역의 도식적 다이아그램은 3가지 별개 영역으로 나누어진다: 옥수수 게놈 DNA를 수반한 5' 경계 영역, 본래의 T-DNA 삽입물, 및 옥수수 게놈 DNA를 수반한 3' 경계 영역. 삽입물의 다이아그램 바로 아래의 2개의 화살표는 5' 및 3' 게놈 워킹 (walking) 단편으로부터 유래된 서열의 출발점과 종점을 표시한 것이다. 삽입물 다이아그램 바로 아래의 기타 박스들은, 이벤트 DAS-59122-7의 게놈 DNA로부터 증폭시켰고 본래의 T-DNA 삽입물 및 5' 및 3' 삽입물/경계 연접부 영역을 포괄하는 것으로 서열 분석된 PCR 단편을 나타낸다.
도 3. B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7 삽입물 영역의 도식적 다이아그램은 3가지 별개 영역으로 나누어진다: 옥수수 게놈 DNA를 수반한 5' 경계 영역, 본래의 T-DNA 삽입물, 및 옥수수 게놈 DNA를 수반한 3' 경계 영역. 삽입물의 다이아그램 바로 아래의 박스는, 게놈 경계 영역에 위치하거나 또는 이벤트 DAS-59122-7로부터의 게놈 DNA로부터 증폭시킨 옥수수 게놈 DNA를 수반한 T-DNA 삽입물의 5' 및 3' 연접부 영역을 가로질러 위치한 PCR 단편을 나타낸다.
다음 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 규정하고 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 업자들이 통상적으로 활용하는 바에 따른다. 분자 생물학 분야에서의 통상적인 용어들에 관한 정의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5 th edition, Springer-Verlag; New York, 1991; and Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994]. 37 CFR §1.822에 제시된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명칭을 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "~가 포함되지만 이에 제한되지 않는다"는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "옥수수"는 제아 마이스 (Zea mays)를 의미하고, 이에는 야생 옥수수 종을 포함하여 옥수수로 번식시킬 수 있는 모든 식물 변종이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DAS-59122-7 특이적"은 식물, 식물성 재료, 또는 생성물 [이에는 식물성 재료를 포함하거나 이로부터 유래된 식품 또는 사료 생성물 (신선하거나 가공됨)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다] 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 차별적으로 확인하는데 적합한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "해충 저항성" 및 "해충에 강한 충격을 주는 것"은 모든 발생 기에서의 해충 영양 공급, 성장 및/또는 행위 상의 변화를 가져다 주는 것을 지칭하는데, 이에는 해충을 사멸시키고; 성장을 지연시키며; 재생 능력을 방지시키고; 영양 공급을 억제시키는 것 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "살충 활성"은 수 많은 파라미터, 예를 들어 해충 사망률, 해충 중량 손실, 해충 유인, 해충 퇴치성, 및 적당한 시간 동안 특정 유기체 또는 물질에 대한 노출 및/또는 영양 공급 후 해충의 기타 행위적 및 물리적 변화에 의해 측정할 수 있는, 상기 유기체 또는 물질 (예: 단백질)의 활성을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "살충 단백질"은 그 자체가 살충 활성을 나타내거나 기타 단백질과 병용해서 살충 활성을 나타내는 단백질이다.
"암호화 서열"은 특이적 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 특이적 핵산의 맥락에서 사용되는 경우의 용어 "암호화하는" 또는 "암호화된"이란, 핵산이 뉴클레오티드 서열을 지정된 단백질로 해독하는 것을 안내해주는 필수 정보를 포함한다는 것을 의미한다. 단백질이 암호화되는 정보는 코돈을 사용함으로써 구체화된다. 단백질을 암호화하는 핵산은 이러한 핵산의 해독된 영역 내에 비해독 서열 (예: 인트론)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 간섭 비해독 서열이 (예를 들어, cDNA에서와 같이) 결여될 수 있다.
"유전자"는 암호화 서열 앞에 (5' 비-암호화 서열) 및 다음에 (3' 비-암호화 서열) 조절 서열을 포함한, 특이적 단백질을 발현하는 핵산 단편을 지칭한다. "본래의 유전자"는 자신의 조절 서열과 함께 천연상 발견되는 바와 같은 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 천연상 함께 발견되지 않는 조절 서열과 암호화 서열을 포함하는, 본래의 유전자가 아닌 모든 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열과 암호화 서열을 포함할 수 있거나, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만, 천연상 발견되는 것 보다는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 암호화 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체 게놈 내의 천연의 위치에 존재하는 본래의 유전자를 지칭한다. "외래"는 관심있는 위치에 정상적으로 발견되지 않는 물질을 지칭한다. 따라서, "외래 DNA"는 재조합 DNA 뿐만 아니라 새로이 도입되고 재배열된 식물의 DNA 둘 다를 포함할 수 있다. "외래" 유전자는 숙주 유기체 내에서는 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 전이에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 본래가 아닌 유기체 내로 삽입된 본래의 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "형질전환유전자"는 형질전환 과정에 의해 게놈 내로 도입시킨 유전자이다. 재조합 DNA가 삽입된 식물 게놈 내의 부위는 "삽입 부위" 또는 "표적 부위"로서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "삽입물 DNA"는 식물성 재료를 형질전환시키기 위해 사용된 발현 카세트 내의 이종 DNA를 지칭하지만, "플랭킹 DNA"는 식물과 같은 유기체에 천연상 존재하는 게놈 DNA를 배출할 수 있거나, 또는 본래의 삽입물 DNA 분자 (예를 들어, 형질전환 이벤트와 연관된 단편)와 관계가 없는 형질전환 과정을 통하여 도입된 외래 (이종) DNA를 배출할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "플랭킹 영역" 또는 "플랭킹 서열"은 본래의 외래 삽입물 DNA 분자의 바로 상단에 연속해서 위치하거나 또는 바로 하단에 연속해서 위치하는 20개 이상의 염기 쌍, 바람직하게는 50개 이상의 염기 쌍 내지 5000개 이하의 염기 쌍 서열을 지칭한다. 외래 DNA를 무작위로 통합시켜 주는 형질전환 과정으로 인해, 각 형질전환체에 대해 특징적이고도 독특한 상이한 플랭킹 영역을 함유하는 형질전환체가 생성될 것이다. 재조합 DNA를 전통적인 교배를 통하여 식물 내로 도입하는 경우에는, 그의 플랭킹 영역이 일반적으로 변하지 않을 것이다. 형질전환체는 또한, 이종 삽입물 DNA의 한 부분과 게놈 DNA 간에, 게놈 DNA의 2개 부분 간에, 또는 이종 DNA의 2개 부분 간에 독특한 연접부를 함유할 것이다. "연접부"는 2개의 특정 DNA 단편이 연결되는 지점이다. 예를 들어, 연접부는 삽입물 DNA가 플랭킹 DNA와 연결되는 곳에 존재한다. 연접점은 또한, 2개의 DNA 단편이 본래의 유기체에서 발견된 것으로부터 변형되는 방식으로 함께 연결되는, 형질전환된 유기체에 존재한다. "연접부 DNA"는 연접점을 포함하는 DNA를 지칭한다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "이종"은 외래 종으로부터 유래된 핵산이거나, 또는 동일한 종으로부터 유래되는 경우에는, 조성에 있어 그의 본래의 형태로부터 실질적으로 변형되고/되거나 계획적인 인간의 조작 하에 게놈 유전자 자리로부터 실질적으로 변형되는 핵산이다. 예를 들어, 이종 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터는 이러한 뉴클레오티드 서열이 유래되는 것과는 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 동일한 종으로부터 유래된 경우에는, 프로모터가 상기 뉴클레오티드 서열과 천연상 작동가능하게 연결되지 않는다. 이종 단백질은 외래 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 동일한 종으로부터 유래된 경우에는, 계획적인 인간의 조작 하에 그의 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된다.
"조절 서열"은 암호화 서열의 상단 (5' 비-암호화 서열), 암호화 서열 내에, 또는 암호화 서열의 하단 (3' 비-암호화 서열)에 위치하고, 연합된 암호화 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 해독에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열에는 프로모터, 해독 리더 서열, 인트론, 및 폴리아데닐화 인식 서열이 포함될 수 있다.
"프로모터"는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터 서열은 근위 및 보다 원위 상단 요소로 이루어지는데, 후자 요소가 종종 증강인자로서 지칭된다. 따라서, "증강인자"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 뉴클레오티드 서열이고, 프로모터의 수준 또는 조직-특이성을 증강시키기 위해 삽입된 이종 요소 또는 프로모터의 선천적인 요소일 수 있다. 프로모터는 그들 전체가 본래의 유전자로부터 유래될 수 있거나, 천연상 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 뉴클레오티드 절편을 포함할 수도 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 상이한 발생 기에서, 또는 상이한 환경적 조건 하에 반응하여 특정 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 핵산 단편이 대부분의 경우에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 해주는 프로모터가 통상적으로 "구성성 프로모터"로서 지칭된다. 식물 세포에 유용한 각종 유형의 신규한 프로모터가 지속적으로 개발되고 있으며; 이의 수 많은 예가 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82]. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계선이 완전히 규명되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 핵산 단편이 동일한 프로모터 활성을 지닐 수 있는 것으로 추가로 인식된다.
"해독 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 해독 리더 서열은 해독 출발 서열의 완전히 프로세싱된 mRNA 상단에 존재한다. 해독 리더 서열은 일차 전사체의 mRNA로의 프로세싱, mRNA 안정성 및/또는 해독 효율을 포함한 수 많은 파라미터에 영향을 미칠 수 있다. 해독 리더 서열의 예가 보고되었다 [참고: Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236].
"3' 비-암호화 서열"은 암호화 서열의 하단에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이에는 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절성 신호를 암호화하는 기타 서열이 포함된다. 폴리아데닐화 신호는 통상적으로, 폴리아데닐산 트랙이 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가되는 것에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다. 상이한 3' 비-암호화 서열의 사용이 다음 문헌에 예시되어 있다 [참고: Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680].
"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내의 암호화 서열에 의해 결정된 특이적 순서로 배열된 아미노산 쇄이다.
DNA 구조물은 하나 이상의 발현 카세트를 제공하기 위해 함께 연결된 DNA 분자의 어셈블리이다. 이러한 DNA 구조물은 세균성 세포에서 자가 복제할 수 있고, 기능적 유전적 요소, 즉 프로모터, 인트론, 리더, 암호화 서열, 3' 종결 영역을 제공하는 DNA 분자를 도입하는데 유용한 각종의 엔도뉴클레아제 효소 제한 부위를 함유하는 플라스미드일 수 있거나; 또는 DNA 구조물은 DNA 분자의 선형 어셈블리, 예를 들어 발현 카세트일 수 있다. DNA 구조물 내에 함유된 발현 카세트는 메신저 RNA의 전사를 제공하는데 필요한 유전적 요소를 포함한다. 발현 카세트는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현하도록 고안될 수 있다. 본 발명의 양태의 발현 카세트는 식물 세포에서 발현하도록 고안된다.
본 발명의 양태의 DNA 분자는 관심있는 유기체에서 발현하기 위해 발현 카세트에 제공된다. 이러한 카세트는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 것이다. "작동가능하게 연결된"이란 연결되는 핵산 서열이 연속되고, 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는, 연속되고 동일한 판독 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된다는 것은 프로모터와 제2 서열 간의 기능적 연쇄를 표시하는데, 이러한 프로모터 서열은 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 카세트는 유기체 내로 공동-형질전환시킬 하나 이상의 부가의 유전자를 부가적으로 함유할 수 있다. 또 다른 한편으론, 부가의 유전자(들)가 다중 발현 카세트 또는 다중 DNA 구조물 상에 제공될 수 있다.
발현 카세트는 전사의 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 포함할 것이다: 전사 및 해독 개시 영역, 암호화 영역, 및 숙주로서 제공되는 유기체에서 기능적인 전사 및 해독 종결 영역. 전사 개시 영역 (즉, 프로모터)는 숙주 유기체와 유사하거나 본래의 것일 수 있거나, 또는 숙주 유기체에 이종이거나 외래일 수 있다. 부가적으로, 프로모터는 천연 서열이거나 합성 서열일 수 있다. 발현 카세트는 발현 카세트 구조물 내에 5' 리더 서열을 부가적으로 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열이 해독을 증강시키는 작용을 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"에는 그의 표현형을 이종 핵산의 존재에 의해 변경시킨 모든 세포, 세포주, 칼루스, 조직, 식물 부위, 또는 식물이 포함되는데, 이에는 초기에 상기와 같이 변경시킨 형질전환 뿐만 아니라 초기 형질전환으로부터 유성 교배하거나 무성 증식시킴으로써 창출시킨 형질전환이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 통상적인 식물 육종 방법 또는 자연적으로 발생하는 이벤트, 예를 들어 무작위 교차-번식, 비-재조합 바이러스성 감염, 비-재조합 세균성 형질전환, 비-재조합 전위, 또는 자발적 돌연변이에 의한 게놈 (염색체 또는 염색체외)의 변경을 포괄하지 않는다.
형질전환 "이벤트"는 식물 세포를, 관심있는 형질전환유전자를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함한 이종 DNA 구조물(들)로 형질전환시키고; 식물 게놈 내로 형질전환유전자가 삽입되어 얻어지는 식물 집단을 재생시키며; 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물을 선별함으로써 생성된다. 이벤트는 형질전환유전자의 발현을 표현형상 특징으로 한다. 유전적 수준에서는, 이벤트가 식물의 유전적 구성의 일부이다. 용어 "이벤트"는 또한, 이종 DNA를 포함하는 또 다른 변종과 해당 형질전환체 간의 유성 이계-교배에 의해 생산된 자손을 지칭한다. 반복친 (recurrent parent)과 반복해서 역교배한 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 DNA 및 플랭킹 DNA는 동일한 염색체 위치에서 교배 자손에 존재한다. 용어 "이벤트"는 또한, 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 부모 계통 [예를 들어, 본래의 형질전환체 및 자가 생식 (selfing)으로부터 비롯된 자손]과, 삽입된 DNA를 함유하지 않는 부모 계통을 유성 교배한 결과로서 관심있는 형질전환유전자를 포함한 삽입된 DNA를 수용한 자손에게 전이될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA에 바로 인접한 플랭킹 서열과 이러한 삽입된 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체로부터의 DNA를 지칭한다.
해충 저항성 DAS-59122-7 옥수수 식물은 먼저, 해충 저항성을 부여해 주는 본 발명의 양태의 발현 카세트로 형질전환시킴으로써 유래된 형질전환 DAS-59122-7 옥수수 식물 및 그의 자손으로부터 성장시킨 옥수수 식물로 이루어진 제1 부모 옥수수 식물과, 해충 저항성이 결여된 제2 부모 옥수수 식물을 유성 교배함으로써, 복수 개의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 해충에 대해 저항성인 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 이러한 제1 자손 식물을 자가 생식시킴으로써, 복수 개의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 및 이러한 제2 자손 식물로부터 해충 저항성 식물을 선별하는 단계에 의해 번식시킬 수 있다. 이들 단계는 제1 해충 저항성 자손 식물 또는 제2 해충 저항성 자손 식물을 제2 부모 옥수수 식물 또는 제3 부모 옥수수 식물과 역교배시킴으로써, 해충에 대해 저항성인 옥수수 식물을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"에는 완전 식물체, 식물 기관 (예: 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 및 이의 자손이 포함된다. 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 인식되는 형질전환 식물 부위는, 예를 들어 식물 세포, 원형질체, 조직, 칼루스, 배아를 포함하고, 본 발명의 DNA 분자로 미리 형질전환시킨 형질전환 식물 또는 그의 자손으로부터 유래되므로 형질전환 세포의 적어도 일부로 이루어진 꽃, 줄기, 과실, 잎 및 뿌리가 또한 본 발명의 양태이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물 세포"에는 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열 조직 영역, 칼루스 조직, 잎, 뿌리, 어린 가지 (새싹), 배우체, 포자체, 화분 및 소포자가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로, 형질전환 기술을 받을 수 있는 고등 식물 부류 만큼이나 광범위하고, 이에는 단자엽 식물과 쌍자엽 식물이 포함된다.
"형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체 게놈 내로 전이시켜, 유전적으로 안정한 유전적 형질을 생성시키는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체가 "형질전환" 유기체로서 지칭된다. 식물 형질전환 방법의 예에는 아그로박테륨 (Agrobacterium)-매개된 형질전환 [참고: De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277], 및 입자-가속화 또는 "유전자 총" 형질전환 기술 [참고: Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; 미국 특허 제4,945,050호: 본원에 참고로 도입된다]이 포함된다. 부가의 형질전환 방법이 다음에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 재조합 구조물, 전형적으로 DNA 구조물 내로 혼입할 수 있는데, 이는 숙주 세포 내로 도입하여 이 세포 내에서 복제할 수 있다. 이러한 구조물은 소정의 숙주 세포에서 폴리펩티드-암호화 서열을 전사 및 해독할 수 있는 복제 시스템 및 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 식물 세포를 안정하게 형질감염시키거나 또는 형질전환 식물을 확립하는데 적합한 수 많은 벡터가, 예를 들어 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York); and Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers)]. 전형적으로, 식물 발현 벡터에는, 예를 들어 5' 및 3' 조절 서열의 전사적 제어 하의 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자, 및 우성 선별성 마커가 포함된다. 이러한 식물 발현 벡터는 프로모터 조절성 영역 (예를 들어, 유도성 또는 구성성, 환경적으로 조절되거나 발생적으로 조절된, 또는 세포-특이적이거나 조직 특이적인 발현을 제어하는 조절성 영역), 전사 개시 출발 부위, 리보솜 결합 부위, RNA 프로세싱 신호, 전사 종결 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수도 있다.
2개의 상이한 형질전환 식물을 짝짓기하여 2개의 독립적으로 분리되는 부가의 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생산할 수도 있다는 것을 인지해야 한다. 적당한 자손을 자가 생식시키면, 부가된 외인성 유전자 둘 다에 대해 동형접합성인 식물이 생산될 수 있다. 영양 증식과 같이, 부모 식물과 역교배시키고 비-형질전환 식물과 이계-교배시키는 것이 또한 고려된다. 상이한 유전 형질과 작물에 흔히 사용되고 있는 기타 육종 방법에 관한 기재 내용은 다음 여러 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 예를 들어, Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)].
"프로브"는 통상적으로 탐지 가능한 표지 또는 리포터 (reporter) 분자에 부착되는 분리된 핵산, 예를 들어 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소이다. 이러한 프로브는 표적 핵산 가닥에 대해 상보적이고, 본 발명의 경우에는 옥수수 식물로부터 유래되든지 아니면 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래되든지 간에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 단리된 DNA 가닥에 대해 상보적이다. 본 발명에 따르는 프로브에는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라 표적 DNA 서열과 특이적으로 결합하고 표적 DNA 서열의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질이 포함된다.
"프라이머"는 이러한 프라이머와 표적 DNA 가닥 간에 하이브리드를 형성하기 위한 핵산 혼성화에 의해 상보적 표적 DNA 가닥으로 어닐링된 다음, 표적 DNA 가닥을 따라 폴리머라제 (예: DNA 폴리머라제)에 의해 연장되는 분리된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 의해 표적 핵산 서열을 증폭시키는데 이들을 사용하는 것을 지칭한다. "PCR" 또는 "폴리머라제 연쇄 반응"은 특이적 DNA 절편을 증폭시키기 위해 사용되는 기술이다 [참고: 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,800,159호].
프로브와 프라이머는 작동인자에 의해 결정된 혼성화 조건 또는 반응 조건에서 특이적으로 표적 DNA 서열과 결합하는데 충분한 길이의 뉴클레오티드이다. 이러한 길이는 선택되는 탐지 방법에 유용하는데 충분한 어떠한 길이일 수도 있다. 일반적으로, 11개 이상 뉴클레오티드 길이, 18개 이상 뉴클레오티드 길이, 및 22개 이상 뉴클레오티드 길이를 사용한다. 이러한 프로브와 프라이머는 고도로 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열과 특이적으로 혼성화한다. 본 발명의 양태에 따르는 프로브와 프라이머는 표적 서열과 인접한 뉴클레오티드의 완전한 DNA 서열 유사성을 지닐 수 있지만, 표적 DNA 서열과 상이하고 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 능력을 보유하고 있는 프로브가 통상적인 방법에 의해 고안될 수 있다. 프로브를 프라이머로서 사용할 수 있지만, 일반적으로 표적 DNA 또는 RNA와 결합하도록 고안하고 증폭 과정에는 사용되지 않는다.
특이적 프라이머는 통합 단편을 증폭시키는데 사용하여, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 "특이적 프로브"로서 사용될 수 있는 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. 프로브가 생물학적 샘플과 결합할 수 있게 해주는 조건 하에 프로브가 이러한 샘플의 핵산과 혼성화하는 경우에는, 상기 결합을 탐지함으로써 생물학적 샘플 중에 이벤트 DAS- 59122-7이 존재하는지를 표시할 수 있다. 이와 같이 결합된 프로브를 확인 (동정)하는 것은 당해 분야에 보고되었다. 본 발명의 특정 양태에서는 특이적 프로브가, 최적화된 조건 하에 이벤트의 5' 또는 3' 플랭킹 영역 내의 영역과 특이적으로 혼성화하고, 이와 연속되는 (인접한) 외래 DNA의 일부를 포함하는 서열이다. 특이적 프로브는 이벤트의 특이적 영역과 동일하거나 상보적인 서열을 80% 이상, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 및 95 내지 100% 포함할 수 있다.
프로브와 프라이머를 제조 및 사용하는 방법이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989 (hereinafter, "Sambrook et al, 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (with periodic updates) (hereinafter, "Ausubel et al., 1992"); and Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990]. PCR 프라이머 쌍은 상기 목적에 의도한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 PCR 프라이머 분석 도구 [Vector NTI 버젼 6 (공급처: Informax Inc., Bethesda MD)]; 프라이머셀렉트 [PrimerSelect (공급처: DNASTAR Inc., Madison, WI)]; 및 프라이머 (버젼 0.5ⓒ, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)를 사용함으로써 공지된 서열로부터 유도시킬 수 있다. 부가적으로, 상기 서열을 가시적으로 스캐닝할 수 있고, 당업자에게 공지된 지침을 이용하여 프라이머를 수동으로 확인하였다.
본원에 사용된 바와 같은 "키트"는 본 발명의 방법 양태를 수행하기 위한, 보다 특히 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 시약 세트를 지칭한다. 본 발명의 키트는 품질 관리 [예: 종자 로트 (seed lots)의 순도)]를 위해, 식물성 재료, 또는 식물성 재료를 포함하거나 이로부터 유래된 재료 (이에는 식품 또는 사료 생성물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다) 내에서 이벤트 DAS-59122-7를 탐지를 위해 사용할 수 있고, 그의 성분들은 이러한 목적을 위해 특이적으로 조정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "식물성 재료"는 식물로부터 수득하거나 이로부터 유래되는 재료를 지칭한다.
본원에 기재된 플랭킹 DNA 서열과 삽입물 서열에 기초한 프라이머와 프로브를 사용하여, 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 상기 서열을 재클로닝 및 서열 분석함으로써 본원에 기재된 서열을 확증 (및 필요한 경우, 교정)할 수 있다. 본 발명의 핵산 프로브와 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열과 혼성화한다. 통상적인 모든 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 사용하여 특정 샘플 중에서의 형질전환 이벤트로부터 DNA의 존재를 확인할 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 상황 하에서 기타 핵산 분자와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 2개의 핵산 분자는, 이러한 2개의 분자가 역평행의 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우에 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 여겨진다.
핵산 분자가 또 다른 핵산 분자와 완전한 상보성을 나타내는 경우에는, 이러한 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같은 분자는, 분자들 중의 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드와 상보적인 경우에는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 여겨진다. 2개의 분자가 적어도 통상적인 "낮은 엄격도" 조건 하에 서로 어닐링될 수 있을 정도로 충분한 안정성을 지니면서 서로 혼성화할 수 있는 경우에 이들 2개 분자는 "최소한 상보적"인 것으로 간주된다. 유사하게, 이들 분자가 통상적인 "고도로 엄격한" 조건 하에 서로 어닐링될 수 있을 정도로 충분한 안정성을 지니면서 서로 혼성화할 경우에 이들 분자는 "상보적인"것으로 간주된다. 통상적인 엄격도 조건이 문헌 [참고: Sambrook et al, 1989, and by Haymes et al, In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C. (1985)]에 기재되어 있고, 따라서 완전한 상보성으로부터의 일탈이 허용될 수 있는데, 단 이러한 일탈이 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 상기 분자들의 능력을 완전히 배제하지 말아야 한다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 제공되기 위해서는, 이용된 특정한 용매와 염 농도 하에 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있기에 충분한 서열 상보성 만을 필요로 한다.
혼성화 반응에서는, 특이성이 전형적으로, 혼성화 후의 세척에 따라 결정되는데, 이러한 결정적인 요인은 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. 열 융점 (Tm)은 상보성 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브와 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하)이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 문헌 [참고: Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 방정식으로부터의 대략치일 수 있다: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% 형태) - 500/L [여기서, M은 1가 양이온의 몰 농도이고, %GC는 DNA 중의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 비율이며, %형태는 혼성화 용액 중의 포름아미드 비율이고, L은 염기 쌍 중의 하이브리드 길이이다]. Tm은 미스매칭 1% 마다 약 1℃씩 저하되므로; Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건은 목적하는 동일성의 서열과 혼성화하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 동일률이 >90%인 서열을 추구하고자 하는 경우에는, Tm이 10℃ 저하될 수 있다. 일반적으로, 규정된 이온 강도와 pH 하에 특이적 서열 및 그의 상보체에 대한 Tm 보다 약 5℃ 낮도록 엄격한 조건을 선택한다. 그러나, 고도로 엄격한 조건은 Tm 보다 1, 2, 3 또는 4℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 활용할 수 있고; 적당한 수준으로 엄격한 조건은 Tm 보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 활용할 수 있으며; 낮은 엄격도 조건은 Tm 보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 활용할 수 있다.
상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성, 및 목적하는 Tm을 사용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도 상의 변동이 본래부터 기재되어 있다는 것을 인지할 것이다. 목적하는 미스매칭 정도로 인해 45℃ 미만 (수성 용액) 또는 32℃ 미만 (포름아미드 용액) Tm이 야기되는 경우에는, 보다 고온이 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 관한 광범위한 지침이 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)].
본원에 사용된 바와 같은 실질적으로 상동성인 서열은 고도로 엄격한 조건 하에 비교되는 핵산 분자의 상보체와 특이적으로 혼성화될 핵산 분자이다. DNA 혼성화를 증진시키는데 적당한 엄격도 조건, 예를 들어 약 45℃ 하의 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC)에 이어, 50℃ 하에 2X SSC로 세척하는 것은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3 하에 약 1.5 M 미만 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과 뉴클레오티드)의 경우에는 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들어 포름아미드를 부가함으로써 달성할 수도 있다. 낮은 엄격도 조건의 예에는 37℃ 하에 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS (나트륨 도데실 설페이트)의 완충제 용액으로 혼성화하고, 50 내지 55℃ 하에 1X 내지 2X SSC (2OX SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 삼나트륨 시트레이트)에서 세척하는 것이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 예에는 37℃ 하에 40 내지 45% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서 혼성화하고, 55 내지 60℃ 하에 0.5X 내지 1X SSC에서 세척하는 것이 포함된다. 고도로 엄격한 조건의 예에는 37℃ 하에 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서 혼성화하고, 60 내지 65℃ 하에 0.1X SSC에서 세척하는 것이 포함된다. 본 발명의 핵산은 적당한 수준으로 엄격한 조건 하에 DAS-59122-7 이벤트에 대해 독특한 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 상보체, 또는 이들 중의 어느 하나의 단편과 특이적으로 혼성화할 수 있다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 두 서열 간의 동일률을 결정하는 것은 수학 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 수학 알고리즘의 비-제한적 예는 문헌 [참고: Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘; 문헌 [참고: Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리즘; 문헌 [참고: Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443-453]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌 [참고: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448]의 유사성 조사 방법; 문헌 [참고: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형시킨, 문헌 [참고: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:2264]의 알고리즘이다.
서열 동일률을 결정하기 위해 서열들을 비교하기 위해 이들 수학 알고리즘을 컴퓨터로 이행하여 활용할 수 있다. 이러한 이행에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: PC/유전자 프로그램의 CLUSTAL (공급처: Intelligenetics, Mountain View, California); ALIGN 프로그램 (버젼 2.0); ALIGN PLUS 프로그램 (버젼 3.0, copyright 1997); 및 위스콘신 제네틱스 (Wisconsin Genetics) 소프트웨어 패키지, 버젼 10의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA (공급처: Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, USA). 이들 프로그램을 이용한 정렬은 디폴트 (default) 파라미터를 사용하여 수행할 수 있다.
CLUSTAL 프로그램은 다음 문헌에 상세히 보고되었다 [참고: Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881 -90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), and Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994)]. ALIGN 및 ALIGN PLUS 프로그램은 문헌 [Myers and Miller (1988) 상기 참고]의 알고리즘에 기초한 것이다. 문헌 [참고: Altschul et al (1990) J. Mol Biol. 215:403]의 BLAST 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul (1990) 상기 참고]의 알고리즘에 기초한 것이다. 데이터베이스 유사성 조사를 위해 사용될 수 있는 BLAST 계열의 프로그램에는 다음이 포함된다: 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대항하여 뉴클레오티드 조회 서열을 알아보기 위한 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대항하여 뉴클레오티드 조회 서열을 알아보기 위한 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대항하여 단백질 조회 서열을 알아보기 위한 BLASTP; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대항하여 단백질 조회 서열을 알아보기 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대항하여 뉴클레오티드 조회 서열을 알아보기 위한 TBLASTX [참고: Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)]. 가시적으로 검사함으로써 정렬을 수동으로 수행할 수도 있다.
비교하기 위해 갭 형성된 정렬을 수득하기 위해서는, 문헌 [참고: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기재된 바와 같이 갭 형성한 (BLAST 2.0 중의) BLAST를 활용할 수 있다. 또 다른 한편으론, (BLAST 2.0 중의) PSI-BLAST를 사용하여 분자들 간의 거리 상관관계를 탐지하는 반복된 조사를 수행할 수 있다 [Altschul et al. (1997) 상기 참고]. BLAST, 갭 형성된 BLAST, PSI-BLAST를 활용하는 경우에는, 각각의 프로그램 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 경우에는 BLASTN이고, 단백질의 경우에는 BLASTX이다)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 [참고: www.ncbi.hlm.nih.gov].
2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "서열 동일률" 또는 "동일률"은 지정된 비교 창 전반에 걸쳐 최대의 상응을 위해 정렬시킨 경우에 동일한 두 서열 내의 잔기를 기준으로 한 것이다. 서열 동일률이 단백질을 기준으로 한 경우에는, 이는 동일하지 않은 잔기 위치가 종종, 보존적 아미노산 치환 [여기서는, 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성 (예: 전하 또는 소수성)을 지닌 기타 아미노산 잔기로 치환시키므로, 분자의 기능적 특성은 변하지 않는다]에 의해 상이한 것으로 인식된다. 서열이 보존적 치환 측면에서 상이한 경우에는, 보존적 치환 특성을 교정하기 위해 서열 동일률을 상향 조정할 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열이 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 지닌 것으로 간주된다. 이와 같이 조정하기 위한 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 보존적 치환을 완전한 미스매치로서가 아니라 부분 미스매치로서 분류함으로써 서열 동일률을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서 예를 들어, 동일한 아미노산이 소정의 스코어 1이고 비-보존적 치환이 소정의 스코어 0인 경우에는, 보존적 치환이 0과 1 사이의 소정의 스코어이다. 보존적 치환의 스코어링은, 예를 들어 프로그램 PC/GENE (공급처: Intelligenetics, Mountain View, California)에서 이행된 바와 같이 계산한다.
본원에 사용된 바와 같은 "서열 동일률"은 비교 창 전반에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하는데, 이러한 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 서열 일부가 두 서열을 최적으로 정렬하기 위해 기준 서열 (이는 부가 또는 결실물을 포함하지 않는다)과 비교해서 부가 또는 결실물 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일률은 매칭된 위치 수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열에서 발생된 위치 수를 결정하고; 매칭된 위치 수를 비교 창 내의 위치 총 수로 나눈 다음; 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일률을 산출함으로써 계산한다.
특별한 증폭 프라이머 쌍을 사용하여 표적 핵산 서열을 증폭시키는 것 (예를 들어, PCR에 의해 수행됨)과 관련하여 "엄격한 조건"은 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 상보체)을 갖는 프라이머가 결합하고, 바람직하게는 DNA 열 증폭 반응에서 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생성시키는 표적 핵산 서열하고만 프라이머 쌍이 혼성화하도록 하는 조건이다.
용어 "(표적 서열)에 대해 특이적인"이란 특정 프로브 또는 프라이머가 엄격한 혼성화 조건 하에, 표적 서열을 포함하는 샘플 중의 표적 서열하고만 혼성화한다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유생 교배로부터 발생한 옥수수 식물이 본 발명의 옥수수 식물로부터의 형질전환 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지를 결정하기 위해, 옥수수 식물 조직 샘플로부터 추출한 DNA를 대상으로 하여, 삽입된 이종 DNA의 삽입 부위에 인접한 플랭킹 서열로부터 유래된 제1 프라이머와, 삽입된 이종 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 DNA 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법을 수행하여, 이벤트 DNA의 존재에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. 또 다른 한편, 제2 프라이머는 플랭킹 서열로부터 유래될 수도 있다. 앰플리콘은 본 발명의 이벤트에 대한 지시인자인 서열 길이를 갖는다. 앰플리콘의 길이는 프라이머 쌍 + 1개 뉴클레오티드 염기 쌍을 합한 길이에서부터 DNA 증폭 프로토콜에 의해 생성 가능한 모든 길이의 앰플리콘 까지의 범위일 수 있다. 또 다른 한편, 프라이머 쌍은 PHI17662A 발현 구조물의 전체 삽입물 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 형질전환 삽입물을 플랭킹하는 서열 [참고: 도 1 (서열 23, 대략 12 Kb 크기]을 포함하는 앰플리콘을 생성하도록, 삽입된 DNA의 양 측면 상의 플랭킹 서열로부터 유래될 수 있다. 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 일정 거리에 위치할 수 있는데, 이러한 위치는 1개 뉴클레오티드 염기 쌍에서부터 증폭 반응의 한계치, 또는 약 2만개 뉴클레오티드 염기 쌍까지의 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용에는 구체적으로, DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체가 배제된다.
핵산 증폭은 당해 분야에 공지된 각종의 핵산 증폭 방법 [이에는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이 포함된다]에 의해 달성할 수 있다. 각종 증폭 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 특히 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic press, San Diego, 1990]. PCR 증폭 방법은 22 Kb 이하의 게놈 DNA 및 42 Kb 이하의 박테리오파아지 DNA를 증폭하도록 개발되었다 [참고: Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994]. 이들 방법 뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 기타 DNA 증폭 방법을 본 발명의 양태 실시에 사용할 수 있다. 특이적 PCR 프로토콜 내의 수 많은 파라미터가 특이적 실험실 조건에 맞도록 조정할 필요가 있을 수 있고, 약간 변형시킬 수 있지만 유사한 결과 수집을 허용한다. 이들 조정은 당업자에게 명백할 것이다.
이들 방법에 의해 생성된 앰플리콘은 복수 개의 기술, 예를 들어 제네틱 비트 분석 (Genetic Bit Analysis) [참고: Nikiforov, et al., Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994] (여기서는, 인접한 플랭킹 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 둘 다와 중복되는 DNA 올리고뉴클레오티드를 고안한다)에 의해 탐지할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드를 마이크로웰 판의 웰에 고정화시킨다. (삽입된 서열 중의 하나의 프라이머 및 인접한 플랭킹 서열 중의 하나의 프라이머를 사용하여) 관심있는 영역을 PCR한 후, 단일 가닥의 PCR 생성물을 상기 고정화 올리고뉴클레오티드와 혼성화하고, 이를 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 DNA 폴리머라제 및 표지된 ddNTPs를 사용하여 단일 염기 연장 반응용 주형으로서 제공할 수 있다. 판독정보 (readout)는 형광성이거나 ELISA에 의거한 것일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인해 삽입물/플랭킹 서열이 존재한다는 지표이다.
또 다른 탐지 방법은 문헌 [참고: Winge, Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000]에 기재된 바와 같은 피로 (Pyro)-서열분석 기술이다. 이러한 방법에서는, 인접한 DNA 및 삽입물 DNA 연접부와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 고안한다. 이 올리고뉴클레오티드를 (삽입된 서열 중의 하나의 프라이머 및 플랭킹 서열 중의 하나의 프라이머를 사용하여) 관심있는 영역으로부터의 단일 가닥의 PCR 생성물과 혼성화하고, 이를 DNA 폴리머라제, ATP, 설푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포설페이트 및 루시페린의 존재하에 항온 배양한다. dNTPs를 개별적으로 가하는데, 이러한 혼입으로 인해 측정 가능한 광 신호가 야기된다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인해 형질전환유전자 삽입물/플랭킹 서열이 존재한다는 지표이다.
문헌 [참고: Chen et al., Genome Res. 9:492-498, 1999]에 기재된 바와 같은 형광 편광이 또한, 본 발명의 앰플리콘을 탐지하기 위해 사용될 수 있는 방법이다. 이러한 방법을 사용하여, 플랭킹 DNA 및 삽입된 DNA 연접부와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 고안한다. 이 올리고뉴클레오티드를 (삽입된 DNA 서열 중의 하나의 프라이머 및 플랭킹 DNA 서열 중의 하나의 프라이머를 사용하여) 관심있는 영역으로부터의 단일 가닥의 PCR 생성물과 혼성화하고, 이를 DNA 폴리머라제 및 형광성 표지된 ddNTP의 존재 하에 항온 배양한다. 단일 염기 연장으로 인해 ddNTP가 혼입된다. 혼입량은 형광계를 사용하여 편광 상의 변화로서 측정할 수 있다. 편광 상의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인해 형질전환유전자 삽입물/플랭킹 서열이 존재한다는 지표이다.
태크만 (Taqman®) (공급처: PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)은 DNA 서열의 존재 여부를 탐지하고 이를 정량화하기 위한 방법으로서 보고되었고, 이는 제조업자가 제공한 지시사항에서 완전히 이해될 수 있다. 간략하게 언급하면, 플랭킹 DNA 및 삽입물 DNA 연접부와 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안한다. 이러한 FRET 프로브와 PCR 프라이머 (하나의 프라이머는 삽입물 DNA 서열 내에 있고, 다른 하나는 플랭킹 게놈 서열 내에 있다)를 열안정한 폴리머라제 및 dNTPs의 존재 하에 폐환시킨다. FRET 프로브를 혼성화시키면, 이러한 FRET 프로브 상의 켄칭 (quenching) 부분으로부터 멀리 떨어진 형광성 부분이 절단 및 방출된다. 형광성 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹/형질전환유전자 삽입물 서열이 존재한다는 지표이다.
분자상 비이콘 (Beacon)은 문헌 [참고: Tyangi et al., Nature Biotech. 14:303-308, 1996]에 기재된 바와 같이 서열 탐지에 사용하도록 보고되었다. 간략하게 언급하면, 플랭킹 DNA 및 삽입물 DNA 연접부와 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드를 고안한다. 이러한 FRET 프로브의 독특한 구조로 인해, 형광성 부분과 켄칭 부분이 아주 근접하여 위치한 2차 구조를 함유하는 것이 생성된다. 상기 FRET 프로브와 PCR 프라이머 (하나의 프라이머는 삽입물 DNA 서열 내에 있고, 다른 하나는 플랭킹 서열 내에 있다)를 열안정한 폴리머라제 및 dNTPs의 존재 하에 폐환시킨다. 성공적인 PCR 증폭 후, FRET 프로브를 표적 서열과 혼성화시키면 프로브 2차 구조가 제거되고 형광성 부분과 켄칭 부분의 공간적 격리가 발생한다. 형광성 신호가 발생한다. 형광성 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹/형질전환유전자 삽입물 서열이 존재한다는 지표이다.
앰플리콘 내에 존재하는 서열에 대해 특이적인 프로브를 사용하는 혼성화 반응이, PCR 반응에 의해 생성된 앰플리콘을 탐지하기 위해 사용되는 또 다른 방법이다.
본 발명의 양태가 다음 실시예에 추가로 규정되어 있다. 이들 실시예는 단지 예시일 뿐이란 사실을 인지해야 한다. 상기 논의 및 다음 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고서도 본 발명의 양태들이 각종의 활용과 조건에 맞도록 적응시킨 본 발명 양태에 대한 각종 변화 및 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의, 본 발명의 양태의 각종 변형들이 상기 기재 내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 역시 첨부된 청구의 범위 내에 속한다.
본원에 제시된 각 참조 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입되어 있다.
실시예 1. 아그로박테륨 ( Agrobacterium ) 형질전환에 의한 옥수수의 형질전환 및 Cry34Abl 및 Cry35Abl (Cry34/35Abl) 유전자를 함유하는 형질전환 식물의 재생
PHI17662A (서열 24)로 명명된 대략 7.4 Kb의 DNA 분자는, 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry34Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,127,180호, 제6,624,145호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 프로모터, 5' 비해독 엑손, 및 옥수수 유비퀴틴 (Ubi-1) 유전자의 제1 인트론을 포함하는 DNA 분자 [참고: Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 and Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218]를 포함하는 제1 형질전환유전자 발현 카세트를 포함한다. DNA 구조물의 제2 형질전환유전자 발현 카세트는 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry35Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,083,499호, 제6,548,291호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 밀 퍼옥시다제 프로모터를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174]를 포함한다. DNA 구조물의 제3 형질전환유전자 발현 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S로부터의 3' 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]에 작동가능하게 연결된, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 유전자를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70:25-37]에 작동가능하게 연결된, (CaMV) 35S 프로모터의 DNA 분자 [참고: Odell J.T. et al. (1985) Nature 313:810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]를 포함하는데, 이를 사용하여 옥수수 배아 조직을 형질전환시켰다.
B.t. Cry34/35 Ab1 옥수수 식물을 아그로박테륨 형질전환에 의해 수득하였는데, 자오 (Zhao)의 방법을 이용하였다 [참고: 미국 특허 제5,981,840호, 및 PCT 특허공개공보 WO98/32326; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 간략하게 언급하면, 미성숙 배아를 옥수수로부터 분리하고, 이 배아를 아그로박테륨 현탁액과 접촉시켰는데, 이러한 세균은 PHI17662 DNA (서열 24)를 미성숙 배아 중의 적어도 하나 의 1개 이상 세포로 전이시킬 수 있었다 (단계 1: 감염 단계). 구체적으로 언급하면, 상기 단계에서는 접종 개시를 위해 미성숙 배아를 아그로박테륨 현탁액에 담궜다. 이 배아를 아그로박테륨과 함께 일정 시간 동안 공동-배양하였다 (단계 2: 공동-배양 단계). 구체적으로 언급하면, 미성숙 배아를 감염 단계 후에 고형 배지 상에서 배양하였다. 이러한 공동-배양 기간 후, "휴지기" 단계가 제공되었다. 이러한 휴지기 단계에서는, 식물 형질전환체에 대한 선별제를 부가하지 않으면서 상기 배아를 아그로박테륨의 성장을 억제시키는 것으로 공지된 하나 이상의 항생제의 존재 하에 항온 배양하였다 (단계 3: 휴지기 단계). 특히, 미성숙 배아를 아그로박테륨을 제거하고 감염된 세포의 휴지기를 위해, 항생제를 수반하지만 선별제는 수반하지 않은 고형 배지 상에서 배양하였다. 이어서, 접종된 배아를 선별제를 함유하는 배지 상에서 배양하고, 성장하고 있는 형질전환된 칼루스를 회수하였다 (단계 4: 선별 단계). 구체적으로 언급하면, 미성숙 배아를 선별제를 수반한 고형 배지 상에서 배양하면, 형질전환된 세포가 선택적으로 성장하게 된다. 이어서, 칼루스를 식물 내로 재생시키고 (단계 5: 재생 단계), 구체적으로는 선별적 배지 상에서 성장시킨 칼루스를 고형 배지 상에서 배양하여 상기 식물을 재생시켰다. 배양 동안 개개의 배아가 물리적으로 격리되도록 유지시켰고, 대다수의 이식편이 상기 선별된 배지 상에서 사멸하였다.
생존하여 건강한 글루포시네이트-저항성 칼루스 조직을 생산하는 배아에, 추정상의 형질전환 이벤트를 나타내는 독특한 확인 (식별) 부호를 할당하였고, 이를 신선한 선별 배지로 지속적으로 전이시켰다. 각각의 독특한 이벤트로부터 유래된 조직으로부터 식물을 재생시키고, 이를 온실에 옮겼다. 분자 분석용 잎 샘플을 취하여 PCR에 의해 형질전환유전자의 존재 여부를 확인하고, ELISA에 의해 Cry34/35Abl 단백질의 발현을 확증하였다. 이어서, 식물을 대상으로 하여 서양 옥수수 뿌리벌레 해충을 이용한 완전 식물 생물학적 검정을 수행하였다. 양성 식물을 근친계와 교배하여 초기 형질전환된 식물로부터 종자를 수득하였다. 수 많은 계통을 현지에서 평가하였다. 해충 저항성 및 농경학적 성능을 포함한 탁월한 특징 조합에 기초하여 독립적인 형질전환 이벤트 집단으로부터 DAS-59122-7 이벤트를 선별하였다.
실시예 2. 바실루스 투링기엔시스 Cry34/35Abl 옥수수 계통 DAS-59122-7의 확인 (동정)
이벤트 DAS-59122-7로부터의 종자를 평가하였다. T1S2 종자는 Hi-II 배경으로의 형질전환에 이어, 근친계 PH09B와의 교배와 2회전의 자가 교배를 나타낸다. 모든 종자는 공급처 [Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA)]로부터 수득하였다. 제초제 잎 페인팅을 통하여 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 활성을 확증하고 측방 유동 장치를 이용하여 Cry34Abl 발현을 확증함으로써 본 연구를 진행하는 동안 식물 잎 조직 상에서 일차 성상 확인을 수행하였다.
본 연구에서의 대조군 물질은 시험 물질 배경을 대표하는 변형되지 않은 종자로서 규정하였다. Hi-II 및 PH09B 배경의 대조군 종자를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이들 변형되지 않은 종자는 cry34Abl, cry35Abl, 및 pat 유전자에 대한 식물 전사 단위를 함유하지 않는다. 모든 종자를 공급처 [Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA)]로부터 수득하였다.
2가지 부가의 B.t. Cry34/35Abl 이벤트, 즉 이벤트 DAS-45214-4와 이벤트 DAS-45216-6으로부터의 DNA 샘플을 이벤트 특이적 PCR 분석용 음성 대조군으로서 사용하였다. 이러한 2가지 이벤트는 이벤트 DAS-59122-7을 생성시키기 위해 사용된 바와 동일한 벡터를 사용하여 아그로박테륨 형질전환시킴으로써 생성시켰으므로, cry34Abl, cry35Abl, 및 pat 유전자에 대한 식물 전사 단위를 함유하였다. 그러나, 이벤트 DAS-45214-4 및 DAS-45216-6 내에서의 T-DNA의 삽입 부위 (게놈 DNA 경계 영역 포함)은 이벤트 DAS-59122-7 내에서의 삽입 부위와 상이하였다. 이벤트 DAS-45214-4 및 이벤트 DAS-45216-6으로부터의 DNA 샘플을 분리하고 서던 블롯 (Southern blot) 분석에 의해 성상 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음).
이벤트 DAS-59122-7에 대한 옥수수 종자와 변형되지 않은 대조군 종자 (Hi-II 및 PH09B)를 듀퐁 (DuPont) 실험 연구소 (Wilmington, DE) 내의 생육실에 뿌려 DNA 분석용으로 충분한 수의 식물을 생산하였다. 이벤트 DAS-59122-7을 성상 확인하기 위해, 10개의 T1S2 종자를 뿌렸다. 각각 변형되지 않은 대조군 계통에 대한 10개 종자를 또한 뿌렸다. 화분 1개당 1개의 종자를 뿌리고, 이 화분을 독특하게 식별 (확인)하였다. 빛과 물을 조절하여 파종하고 생육시키는 조건은 건강한 식물 생육을 증진시켰다.
대조군 식물과 이벤트 DAS-59122-7 식물 각각에 대한 잎 샘플 수집하였다. 각 샘플에 대해, 생육점 위로부터 충분한 잎 재료를 수집하고 예비-표지된 샘플 봉지에 놓아두었다. 이 샘플을 드라이 아이스 위에 놓아두고 수집 후 초저 냉동고에 옮겼다. 모든 샘플을 가공 처리할 때까지 냉동된 채로 두었다. 모든 잎 샘플을 수확일까지 식물 식별자로 독특하게 표지시켰다.
이벤트 DAS-59122-7 중에서의 Cry34Abl 단백질의 발현을 확증하고, 대조군에서의 발현 부재를 확증하기 위해, 모든 이벤트 DAS-59122-7 및 대조군 식물로부터 잎 샘플을 수집하고, 이를 대상으로 하여 Cry34Abl에 대해 특이적인 측방 유동 장치 (공급처: Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE)를 사용하여 형질전환 단백질에 대해 스크리닝하였다. 각 식물로부터 잎 펀치를 수행하고 이를 트윈 20을 수반하는 인산염 완충 식염수 용액에서 연마하여 단백질을 조악하게 추출하였다. 스트립 장치를 상기 추출물에 살짝 담궈 Cry34Abl 단백질의 존재 또는 부재를 결정하였다. 면역검정 결과를 사용하여 표 1에 제시된 바와 같이 분자상 분석에 앞서 시험 물질 식물의 실체를 확증하였다.
이벤트 DAS-59122-7 중에서의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)의 발현을 확증하기 위해, 제초제 잎 페인팅을 수행하였다. 본 연구에 사용된 모든 식물에 잎 페인팅을 수행하여 식물 실체를 확증하였다. R1 생육 단계 이전에 식물을 검정하였다. 제초제 잎 페인팅하기 위해 당해 분야에 공지된 표준 과정을 수행한 후, PAT-발현성 형질전환 식물을 확인 (동정)하기 위한 검정을 수행하였다. 구체적으로 언급하면, 각 식물의 1개 잎 일부를 수중 글루포시네이트 제초제 바스타 (Basta®) (공급처: Bayer CropScience) 대략 2% 용액으로 처리하고, 살포한지 4 내지 12일 후에 페인팅된 잎 부위 내의 갈색 또는 괴사 조직을 알아보기 위해 가시적 으로 검사하였다. 각 식물에 대한 결과를 기록하고, 이를 사용하여 표 1에 제시된 바와 같은 각 시험 식물 중에서의 PAT의 발현을 결정하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 이벤트 DAS-59122-7 T1S2 발생을 알아보기 위해 시험된 10개 식물 중에서 6개 식물이 Cry34Abl과 PAT 둘 다를 발현시킨 반면, 4개의 식물은 어느 단백질도 발현하지 못하였다. 변형되지 않은 모든 대조군은 CryAbl과 PAT 검정 둘 다에 대해 음성인 것으로 시험되었다 (데이터는 제시되지 않음).
[표 1]
B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7에 대한 Cry34Abl 및 PAT 단백질 발현 및 서던 혼성화 데이터
Figure 112007032172130-PCT00002
1. 양성 Cry34Abl 발현은 Cry34Abl 단백질 탐지에 대해 특이적인 면역검정에 의거한 측방 유동 장치에 의해 결정된 바와 같은 단백질 발현의 탐지를 표시한다. 음성은 Cry34Abl 단백질이 전혀 탐지되지 않았다는 지표이다. 양성 PAT 발현은 해당 식물이 제초제 처리에 대해 내성이 있었다는 지표이고, 음성은 식물이 제초제에 대해 민감성이었다는 지표이다.
2. +는 서던 블롯 상의 혼성화 신호를 표시하고; -는 서던 블롯 상의 혼성화 신호가 없다는 지표이다. Cry34Abl 유전자 프로브는 1.915 kb의 예상된 내부 T-DNA 단편과 혼성화하였고, cry35Abl 유전자 프로브는 2.607 kb의 예상된 내부 T-DNA 단편과 혼성화하였으며, pat 유전자 프로브는 서던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 본래의 단일 T-DNA 삽입물과 일치하는 3.4 kb 경계 단편과 혼성화하였다.
실시예 3. 바실루스 투링기엔시스 Cry34/35Abl 옥수수 계통 DAS-59122-7의 서던 블롯 분석
1 그램 양의 잎 샘플을 액체 질소 하에 연마시키고, DNeasy® 식물 미니 키트 (공급처: Qiagen, Valencia, CA)를 사용하거나 또는 표준 영역 추출 완충제 과정을 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출 후, 이러한 DNA를 아가로스 겔 상에서 가시화하여 DNA 질을 결정하였고, 피코 그린 (Pico Green®) 시약 (공급처: Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)과 분광형광측정 분석을 사용하여 정량화하였다.
1 Kb DNA 래더 (Ladder) (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 아가로스 겔 상에서 DNA 단편 크기를 추정하였다.
이벤트 DAS-59122-7 식물로부터 분리한 게놈 DNA를 NcoI로 분해시키고, 전기영동적으로 분리시키며, 나일론 막에 옮긴 다음, 당해 분야에 공지된 표준 과정을 사용하여 cry34Abl, cry35Abl 및 pat 유전자 프로브와 혼성화하였다. 블롯을 X-선 필름에 1회 이상 노출시켜 혼성화 단편을 탐지하고 분자량 표준을 가시화하였다. 이어서, X-선 필름 사진을 찍고/찍거나 루미-영상화™ 기기 (공급처: Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 탐지함으로써 영상을 디지털로 포착하였다. 각 프로브에 대해 탐지된 밴드 크기를 자료로 첨부하였다. 시험 식물에 해당 삽입물이 존재하는지를 확증하기 위한 수단으로서 서던 블롯 분석을 사용하였고, 이는 이벤트 DAS-59122-7로부터의 모든 식물이 표 1에 제시된 바와 동일한 삽입물을 함유하였다는 것을 확증시켜 주었다 (서던 블롯은 제시되지 않았다). 서던 블롯 분석은 이벤트 DAS-59122-7이 플라스미드 PHP17662로부터의 T-DNA 영역의 본래 카피로 이루어진 단일 삽입물을 함유하고 있는 반면, 단백질 발현 분석에 의해 결정된 바와 같은 기능없는 (null) 분리체는 상기 유전자 프로브와 혼성화하지 않았다는 것을 나타내었다. 추가로, 2가지 단백질을 발현하는 이벤트 DAS-59122-7 식물은 서던 블롯 상에 동일한 혼성화 패턴을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 구체적으로 언급하면, cry34Abl 유전자 프로브는 1.915 kb의 예상된 내부 T-DNA 단편과 혼성화하였고, cry35Abl 유전자 프로브는 2.607 kb의 예상된 내부 T-DNA 단편과 혼성화하였으며, pat 유전자 프로브는 서던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 본래의 단일 T-DNA 삽입물과 일치하는 3.4 kb 경계 단편과 혼성화하였다.
실시예 4. 바실루스 투링기엔시스 Cry34/35Abl 옥수수 계통 DAS-59122-7의 T-DNA 삽입물 및 플랭킹 경계 영역 서열 분석
도 2 및 3에 도시된 바와 같이 PCR에 의거한 방법을 사용하여 B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS 59122-7로부터 T-DNA 삽입물 및 플랭킹 경계 영역을 클로닝하였다. 구체적으로 언급하면, 2개의 게놈 워킹 기술을 사용하여, 이벤트 DAS-59122-7 중의 삽입물의 5' 말단과 3' 말단의 경계를 이루는 서열을 수득하였다. 제1 워킹 방법은 본질적으로, 유니버셜 게놈 워커 키트 (Universal Genome Walker Kit; 공급처: BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)에 대해 기재된 바와 같은 방법이었고, 제2 방법은 문헌 [참고: Stover (2001), U. C. Irvine (personal communication)]에 기재된 바와 같이 변형시킨, 문헌 [참고: Devon et al., (1995) Nucleic Acids Research 23(9): 1644-1645]에 요약된 스플링케레트 (splinkerette) 프로토콜에 따라서 수행하였다.
간단하게 언급하면, 게놈 DNA를 각종 제한 효소 (유니버셜 게놈 워커 방법의 경우에는 DraI, EcoRV, PvuII, SmaI 및 StuI이고, 스플링케레트 방법의 경우에는 BamHI, EcoRI, HindIII, 및 XbaI이다)로 분해시킨 다음, 게놈 워커 방법의 경우에는 평활 말단 적응인자에 연결시키고 스플링케레트 방법에 대해 사용된 제한 효소에 특이적인 적응인자에 연결시켰다. 양 게놈 워킹 방법에 대한 적응인자는 PCR 동안 이러한 적응인자의 3' 말단 연장을 방지시켜, 이로써 비특이적 증폭을 저하 또는 제거하도록 고안하였다. 이어서, 적응인자-연결된 게놈 DNA 단편을 게놈 워커 라이브리러 또는 스플링케레트 라이브러리 (각 제한 효소에 대한 1개의 라이브러리)로서 지칭하였다. B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7의 3개 개개의 T1S2 식물, 즉 식물 DAS-59122-7 T1S2 1, DAS-59122-7 T1S2 2 및 DAS-59122-7 T1S2 10으로부터 분리한 게놈 DNA와, 1개의 Hi-II 식물 및 1개의 PH09B 대조군 식물로부터 분리한 게놈 DNA로부터 라이브러리를 제조하였다.
이들 라이브러리를 구축한 후, 축소 (nested) PCR 증폭을 완료시켜 어드밴티지 (Advantage™)-GC 게놈 PCR 키트 (공급처: BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 표적 서열을 증폭시켰다. 일차 PCR 증폭은 적응인자와 동일한 1개의 프라이머와 1개의 유전자 특이적 프라이머를 사용하였다. 적응인자 프라이머는 일차 PCR의 제1 주기에서 생성물을 증폭시키지 않을 것이고, 유전자 특이적 프라이머로부터의 생성물 만이 생성될 것이다. 적응인자 프라이머로부터의 어닐링 및 증폭은, 유전자 특이적 프라이머로부터 상보적 가닥이 생성된 후에만 일어난다. 일차 PCR 증폭 후, 이차 축소 PCR 반응을 수행하여 게놈 PCR 반응의 특이성을 증가시켰다. 축소 프라이머는 일차 PCR에 사용된 각각의 프라이머에 대해 내부인 적응인자-특이적 서열과 유전자-특이적 서열로 이루어졌다.
5' 플랭킹 경계 서열의 경우에는, 분해된 DNA 상으로 연결된 적응인자 서열에 대해 상보적인 프라이머와 함께, 삽입된 T-DNA의 5' 말단에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 축소 PCR을 개시하였다. 유사하게, 3' 플랭킹 경계 서열을 클로닝하는 것은 삽입된 T-DNA의 3' 말단에 대해 특이적인 프라이머와, 적응인자 서열에 대해 상보적인 프라이머를 사용하여 개시하였다. T-DNA 영역 내의 T-DNA 우측 경계와 좌측 경계 서열 내부에 있는 DNA 서열을 옥수수 게놈 서열에 대한 "워킹 아웃"용 출발점으로서 사용하였는데, 이는 이들 서열이 게놈 워킹 프라이머를 고정시 키기 위한 독특한 서열 (내인성 옥수수 게놈 서열과 상동성이 아니다)을 나타내기 때문이다.
축소 PCR에 의해 생성된 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다 (데이터는 제시되지 않음). 하나 이상의 이벤트 DAS-59122-7 DNA 샘플로부터 제조된 라이브러리에 가시적이고 Hi-II 및 PH09B 게놈 DNA 샘플로부터 제조된 라이브러리에는 존재하지 않는 단편을 추가의 성상 확인을 위해 확인 (동정)하였다. 이와 같이 확인된, PCR 증폭된 단편을 예비 겔 전기영동시킴으로써 격리시키고, 퀴아퀵 겔 추출용 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit; 공급처: Qiagen)를 사용하여 분리한 다음, DNA 서열 분석에 앞서 pGEM-T 이지 (Easy) 벡터 시스템 I (공급처: Promega Corp., Madison, WI)을 사용하여, 서열 분석을 위해 pGEM-T 이지 플라스미드 벡터 내로 직접 송부하거나 이러한 벡터 내로 클로닝하였다. 축소 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머를 사용하거나, 또는 pGEM-T 이지 벡터와의 사용에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 서열 분석 반응을 수행하였다. 이로써 수득된 서열을 사용하여 부가의 유전자 특이적 프라이머를 고안하여 공지되지 않은 옥수수 게놈 서열 내로의 "워킹 아웃"을 지속하였다. T-DNA 삽입물의 말단들로부터의 경계 서열의 500 bp 이상이 수득될 때까지 여러 회전의 게놈 워킹을 수행하였다.
플랭킹 경계 서열의 유효성을 보장하기 위해, 이벤트 DAS-59122-7로부터의 게놈 DNA 상의 부가의 이벤트-특이적 PCR 증폭을 수행하였다. 이와 같이 증폭시킨 단편을 서열 분석하여, T-DNA 삽입물 영역으로부터 5' 및 3' 경계성 게놈 DNA 내로의 서열 중복 영역을 추가로 연장시켰다. 옥수수 게놈 DNA와 T-DNA의 독특한 연접 부 전역에 걸쳐 있는 단편을 증폭시키기 위한 게놈 워킹 실험으로부터 수득한 서열을 근거로 하여, 표 2에 제시된 프라이머를 고안하였다. 프라이머 세트 03-O-506/02-O-476 (서열 10/서열 9)는 5' 연접부 전역에 걸쳐 있고 313 bp 단편 (bp 2427에서부터 bp 2739까지의 단편, 도 1 참고)을 증폭시켰으며, 프라이머 세트 02-O-447/03-O-577 (서열 8/서열 17)은 3' 연접부 전역에 걸쳐 있고 754 bp 단편 (bp 9623에서부터 bp 10376까지의 단편, 도 1 참고)을 증폭시켰다.
[표 2]
프라이머 서열
Figure 112007032172130-PCT00003
1. 이벤트 DAS-59122-7의 서열 내의 위치 (도 1 참고). 염기 1 - 2593 = 5' 경계, 염기 2594 - 9936 = T-DNA 삽입물, 염기 9937 - 11922 = 3' 경계.
옥수수 게놈 내로 삽입된 DNA 서열을 확증하기 위해 PCR을 사용하여, 이벤트 DAS-59122-7로부터 삽입된 T-DNA를 증폭, 클로닝 및 서열 분석하였다. 표 3에 제시된 PCR 프라이머 세트 (서열 11/서열 5); (서열 4/서열 7); 및 (서열 6/서열 3)을 사용하여, 22I-1 (서열 25), 22I-2 (서열 26), 및 22I-3 (서열 27)으로 표지된 3가지 중복 단편을 증폭시켰는데, 이들은 이벤트 DAS-59122-7에 대한 bp 2687에서부터 bp 9846 까지의 T-DNA 삽입물의 3' 영역까지 직행하는 T-DNA의 5' 영역으로부터의 서열을 나타낸다 (도 1 참고). PCR 앰플리콘 정보가 표 3에 보고되었고, 프라이머 서열은 표 2에 열거되었다.
[표 3]
PCR 프라이머 및 앰플리콘에 관한 설명
Figure 112007032172130-PCT00004
1. 이벤트 DAS-59122-7의 서열 내의 위치 (도 1 참고). 염기 1 - 2593 = 5' 경계, 염기 2594 - 9936 = T-DNA 삽입물, 염기 9937 - 11922 = 3' 경계.
PCR GC2 어드밴티지™ 폴리머라제 키트 (공급처: BD Biosciences Clontech, Inc.)를 제조업자의 지시에 따라서 사용하여 삽입물 단편 [22I-1 (서열 25), 22I-2 (서열 26), 및 22I-3 (서열 27)]을 증폭시켰다. 간단하게 언급하면, 50 ㎕ 반응물 은 최종 농도 0.2 μM 및 40 ng의 게놈 DNA 하의 5' 프라이머와 3' 프라이머를 함유하였다. 식물 DAS-59122-7 T1S2 1 and DAS-59122-7 T1S2 2로부터의 게놈 DNA 제제를 사용하여 PCR 반응을 두 번 되풀이하도록 설정하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃ 하에 1분 동안 초기 변성시킨 다음, 94/95℃ 하에 30초 동안, 55℃ 하에 30초 동안 및 68℃ 하에 5분 동안 35주기를 수행한 후, 68℃ 하에 6분 동안 최종 연장시킨다. PCR 증폭 생성물을 UV 광 하에 가시화한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색시킨 IX TBE (89 mM 트리스-보레이트, 2 mM EDTA, pH 8.3) 중의 1% 아가로스 겔을 통하여 전기영동시켰다.
PCR 단편 22I-1 (서열 25), 22I-2 (서열 26), 및 22I-3 (서열 27)을 에티듐 브로마이드로 염색시킨 1X TBE 중의 0.8% 아가로스 겔로부터 절단하고, 퀴아퀵 겔 추출용 키트 (공급처: Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 상기 단편을 정제함으로써, 이들 단편을 정제하였다. pGEM-T 이지 벡터 시스템 I (공급처: Promega Corp.)을 사용하여, PCR 단편을 pGEM-T 이지 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 이와 같이 클로닝된 단편은 플라스미드 DNA의 소형 제제 (공급처: QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen)와 NotI로의 제한 분해에 의해 확증하였다. 이어서, 플라스미드 클론 및/또는 정제된 PCR 삽입물 단편을, 완전한 삽입물의 서열 분석을 위해 송부하였다. 공지된 T-DNA 서열에 대해 특이적인 것으로 고안된 프라이머, 또는 pGEM-T 이지 벡터와의 사용에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 서열 분석 반응을 수행하였다. 다음 업체 [Sigma-Genosys, Inc. (The Woodlands, TX)]는 모든 PCR 프라이머를 합성하였고, 이들은 PCR 반응에서 0.2 내지 0.4 μM의 최종 농도로 사용되었다.
B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7, DAS-45214-4, 및 DAS-45216-6, 및 변형되지 않은 대조군 계통 Hi-II 및 PH09B로부터 분리한 게놈 DNA를 이용한 PCR 반응을 사용하여 (1) 이벤트 DAS-59122-7의 서열 분석된 경계 영역 내에 옥수수 게놈 DNA가 존재하는 것을 확증하였고, (2) 이벤트 DAS-59122-7 중의 T-DNA 삽입물과 게놈 DNA 경계의 연접부를 가로지르는 이벤트 특이적 증폭을 확증하였다.
이벤트 DAS-59122-7 중의 삽입물을 플랭킹하는 경계 서열을 증폭하도록 고안된 PCR 프라이머를 사용하여, 이벤트 DAS-59122-7 뿐만 아니라 변형되지 않은 대조군 계통에도 이들 영역이 존재한다는 것을 확증하였다. 5' 경계와 3' 경계에 대한 각각 2 세트의 프라이머 (총 4개 세트)를 시험하였다. 프라이머 세트 03-O-784/03-O-564 (서열 18/서열 14) 및 03-O-784/03-O-543 (서열 18/서열 13)을 사용하여, 이벤트 DAS-59122-7 중의 T-DNA 삽입물에 대해 5'인 경계 서열로부터 각각 136 bp 및 263 bp 단편을 증폭시켰다 (도 2 및 3). 유사하게, 프라이머 세트 03-O-569/03-O-577 (서열 15/서열 17) 및 03-O-570/03-O-542 (서열 16/서열 12)를 사용하여 3' 게놈 경계로부터 각각 227 bp 및 492 bp 단편을 증폭시켰다 (도 2 및 3).
경계 서열과 T-DNA 삽입물의 연접부를 가로지르는 단편을 증폭하도록 고안된 프라이머를 사용하여 이벤트 DAS-59122-7에 대한 이벤트-특이적 PCR 단편을 확립하였다. 2개의 연접부 각각에 대해 1개 프라이머 세트를 선별하였다. 프라이머 세트 03-O-784/02-O-215 (서열 18/서열 1)는 5' 연접부를 가로지르는 555 bp 단편을 증폭하도록 고안하였고, 프라이머 세트 02-O-219/03-O-577 (서열 2/서열 17)은 3' 연접부 하의 547 bp 단편을 증폭하도록 고안하였다. 내인성 옥수수 전화효소 유전자 [참고: Hurst et al., (1999) Molecular Breeding 5 (6):579-586]에 기초한 프라이머 세트 IVRl (0197) (서열 39) 5'- CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC - 3' 및 IVR2 (O198) (서열 40) 5'- GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC - 3'을 사용하여, 모든 옥수수 게놈 DNA 샘플에 대한 내부 양성 대조군으로서 226 bp 증폭 생성물을 생성시켰다.
모든 PCR 프라이머를 다음 업체 [Sigma-Genosys, Inc.]에 의해 합성하였고, 이를 PCR 반응에서 0.2 내지 0.4 μM의 최종 농도로 사용하였다. PCR 프라이머 서열이 표 2에 열거되었다. PCR 증폭하는 경우에는, 어드밴티지™-GC 2 PCR 키트 (공급처: BD Biosciences)를 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 대략 10 내지 100 ng의 게놈 DNA 주형을 50 ㎕ PCR 반응당 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ 하에 5분 동안 초기 주형 변성시킨 다음, 95℃ 하에 1분 동안, 60℃ 하에 2분 동안 및 72℃ 하에 3분 동안 35주기를 수행한 후, 72℃ 하에 7분 동안 최종 연장시켰다. PCR 증폭 생성물을 UV 광 하에 가시화한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색시킨 1X TBE 중의 1% 아가로스 겔을 통하여 전기영동시켰다.
이벤트 DAS-59122-7의 T-DNA 삽입물과 경계 영역에 대해 수득된 서열 데이터를 고찰하고, Seqman II™ 소프트웨어 버젼 4.0.5 (공급처: DNAStar, Inc., Madison, WI)를 사용하여 어셈블리하였다. 이벤트 DAS-59122-7에 존재하는 삽입물을 플랭킹하는 5' 및 3' 경계 서열을, 유전자은행 공개 데이터베이스에 대항하여 상동성 조사하기 위해 사용하여 옥수수 게놈 내의 삽입 위치를 추가로 성상 확인하 였다. 이벤트 DAS-59122-7 중의 플랭킹 경계와 T-DNA 삽입물 사이의 연접부 영역 내의 개방 판독 프레임을 확인하기 위한 분석을, 벡터 NTI8.0 (InforMax™, Inc., Frederick, MD)를 사용하여 수행하였다.
통틀어서, 이벤트 DAS-59122-7의 게놈 DNA로부터의 서열 11922 bp를 확증하였다 (도 1 참고). T-DNA 삽입물의 5' 말단에서 2593 bp의 플랭킹 경계 서열을 확인하였고, 게놈 워킹 실험으로부터 유래된 단편으로부터의 3' 말단 상에서 1986 bp의 플랭킹 경계 서열을 수득하였다. 이벤트 DAS-59122-7에 대한 bp 2687에서부터 bp 9846 까지의 T-DNA 삽입물의 3' 영역까지 직행하는 T-DNA의 5' 영역으로부터의 서열을 나타내는, 22I-1 (2501 bp) (서열 25), 22I-2 (3027 bp) (서열 26), 및 22I-3 (2830 bp) (서열 27)으로 표지시킨 3개의 중복 단편을 증폭하도록 고안된 PCR 프라이머 세트를 사용하여, T-DNA 삽입물의 총 7160 bp를 클로닝하고 서열 분석하였다 (도 1 참고). 나머지 T-DNA 삽입물 영역은 옥수수 게놈 DNA와 T-DNA 삽입물의 5' 연접부 및 3' 연접부 각각의 전역에 걸쳐 있는 2개의 PCR 단편인 0506/0476 (서열 10/서열 9) 및 0447/0577 (서열 8/서열 17)로부터 서열 분석하였다. 사용된 프라이머는 T-DNA와 옥수수 게놈 DNA의 독특한 연접부를 전역에 걸쳐 있는 단편을 증폭하기 위해 게놈 워킹 실험으로부터 수득한 서열에 기초하여 고안하였다. 프라이머 세트 03-O-506/03-O-476 (서열 10/서열 9)은 5' 연접부 전역에 걸쳐 있고 313 bp 단편 (bp 2427에서부터 bp 2739까지의 단편)을 증폭시켰으며, 프라이머 세트 03-O-447/03-O-577 (서열 8/서열 17)은 3' 연접부 전역에 걸쳐 있고 754 bp 단편 (bp 9623에서부터 bp 10376까지의 단편)을 증폭시켰다. 취합해 보면, 이벤트 DAS-59122-7 중의 T-DNA 삽입물의 총 7343 bp를 클로닝 및 서열 분석하였고 (bp 2594에서부터 bp 9936 까지의 서열, 도 1 참고), 이를 형질전환 플라스미드 PHP17662의 서열과 비교하였다. T-DNA 삽입물의 비-해독된 밀 퍼옥시다제 프로모터 영역 내에서는, bp 6526 및 bp 6562 하의 2개의 뉴클레오티드 차이가 관찰되었다 (도 1 참고). 관찰된 염기 변화 어느 것도 T-DNA 삽입물의 개방 판독 프레임 조성에 전혀 영향을 미치지 못하였다. T-DNA 삽입물의 3' 및 5' 말단 영역 둘 다가 본래의 것인 것으로 밝혀졌는데, 단 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역 각각을 포괄하는 3' 말단 하의 25 bp와 5' 말단 하의 마지막 22 bp가 결실되었다. T-DNA 경계 서열이 게놈 내로의 T-DNA 삽입에 있어 결정적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있긴 하지만, 이러한 결과는 삽입이 특히 좌측 T-DNA 경계에서 종종 불완전하기 때문에 예상치 못한 것이다 [참고: Tinland (1996) Trends in Plant Science 1(6):178-184].
이벤트 DAS-59122-7의 게놈 경계 영역을 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 분석한 결과, 공개적으로 입수 가능한 서열 (Release 138.0 GenBank, Oct 25, 2003)과 제한된 상동성을 나타내었다. 5' 경계 영역을 분석한 결과, 옥수수 게놈 및 EST (발현된 서열 태그: Expressed Sequence Tag) 서열과 상당히 상동성인 2개 영역이 밝혀졌다. 제1 영역은 179 bp (경계 서열의 bp 477 내지 bp 655)을 포괄하였고, 각종 ESTs를 정렬함으로써 수득한 컨센서스 서열, 몇 가지 분자상 마커, 및 염색체성 서열과의 유사상을 표시하였다. 제2 영역은 5' 경계 서열의 bp 1080 내지 bp 1153 (74 bp)에 존재하고, 이는 수 많은 상이한 옥수수 ESTs 및 게놈 서열과의 유사성을 나타내었다. 3' 경계 영역은 또한, 식물 DNA 서열과 유사한 2개의 작은 비-연속된 영역을 지녔다. 162 bp (bp 9954 내지 bp 10115)의 내부 3' 영역은 2개의 게놈 제아 마이스 (Zea mays) 알코올 데히드로게나제 (adh1) 유전자의 3' 비해독 말단 뿐만 아니라 몇 가지 EST 컨센서스 서열과도 유사성을 나타내었다. 3' 경계 중앙 (bp 10593 내지 bp lO649) 내의 보다 작은 영역 (57 bp)은 다중 옥수수 게놈 서열로부터의 비-암호화 영역과의 유사성을 나타내었다.
전반적으로, 179개 염기쌍 보다 큰 상동성 영역은 게놈 경계 서열 어느 것에서도 확인되지 않았을 뿐만 아니라 동일한 공지된 서열로부터의 1개 이상의 상동성 영역도 전혀 밝혀지지 않았다. 이벤트 DAS-59122-7 경계 서열과의 유사성을 표시하는 개개의 승인물을 조사하여, 이벤트 DAS-59122-7 내에서의 삽입이 특징적인 단백질 암호화 서열에서 이루어졌는지를 결정하였다. 공지된 어떠한 단백질 암호화 서열 내에서도 유사성 영역이 전혀 존재하지 않았다. 이벤트 DAS-59122-7 경계 서열과, 완전한 형질전환 플라스미드 서열 PHP17662를 국소 정렬한 결과, 유의적인 상동성이 전혀 없는 것으로 밝혀졌는데, 이는 T-DNA 삽입물을 플랭킹하는 경계 영역이 상기 형질전환 플라스미드의 단편을 함유하지 않았다는 지표이다. 따라서, 이벤트 DAS-59122-7 중의 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열을 확인 (동정) 및 성상 확인하는 것은 공지된 서열과의 유의적인 상동성 영역이 부재하기 때문에 제한된다.
이벤트 DAS-59122-7 중의 T-DNA 삽입물과 옥수수 게놈 경계 서열 간의 5' 및 3' 연접부 영역을 대상으로 하여, 신규한 개방 판독 프레임이 존재하는지를 분석하 였다. 이러한 5' 또는 3' 경계 연접부 영역에서는 유의적 크기 (> 100개 아미노산)의 개방 판독 프레임이 전혀 확인되지 않았는데, 이는 T-DNA 삽입 결과로서 신규한 개방 판독 프레임이 전혀 발생하지 않았다는 지표이다. 부가적으로, 상동성 조사는 B.t. Cry34/35Abl 이벤트 DAS-59122-7 중의 T-DNA 삽입에 의해 차단될 수도 있는 경계 영역 내의 내인성 옥수수 개방 판독 프레임의 존재를 나타내지 않았다.
실시예 5. PCR 프라이머
DNA 이벤트 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시켰다. 이들 이벤트 프라이머 쌍에는 서열 18과 서열 1; 서열 2와 서열 17; 서열 10과 서열 9; 및 서열 8과 서열 17; 및 서열 36과 서열 37이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 프라이머 쌍 이외에도, DNA 증폭 반응에 사용된 경우에 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 DNA 앰플리콘을 생성시키는, 서열 21과 서열 22로부터 유래된 모든 프라이머 쌍이 본 발명의 한 양태이다. DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘 DNA 분자를 생성시키기 위해 DNA 프라이머 또는 그의 상보체를 사용하는 이들 방법의 어떠한 변형도 당해 분야의 기술 수준 내이다. 또한, 내인성 옥수수 유전자를 증폭시키기 위한 IVR1 (O197)/IVR2 (O198) (서열 39/서열 40)을 포함하는 대조군 프라이머 쌍이 상기 반응 조건에 대한 내부 표준으로서 포함된다.
DAS-59122-7 이벤트가 존재하는지를 시험하기 위해 식물 조직 DNA 추출물을 분석하는 것은 양성 조직 DNA 추출물 대조군 (형질전환 서열을 함유하는 것으로 공지된 DNA 샘플)을 포함해야 한다. 양성 대조군의 성공적인 증폭은 PCR이 표적 서 열의 증폭을 허용해주는 조건 하에 수행되었다는 것을 입증해준다. 제공된 주형 DNA가 비-형질전환 식물로부터 제조된 게놈 DNA이거나 또는 비-DAS-59122-7 형질전환 식물인 음성 또는 야생형 DNA 추출물 대조군이 또한 포함되어야 한다. 부가적으로, 주형 옥수수 DNA 추출물을 함유하지 않는 음성 대조군은 PCR 프로토콜에 사용된 시약 및 조건의 유용한 평가 기준일 것이다.
충분한 길이의 부가의 DNA 프라이머 분자는 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시키기 위해 최적화시킨 DNA 증폭 방법 및 조건 분야의 당업자에 의해 서열 21과 서열 22 중에서 선택될 수 있다. 이들 실시예에 제시된 방법들을 변형시키면서 이들 DNA 프라이머 서열을 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 속한다. 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인, 서열 21과 서열 22로부터 유래된 충분한 길이의 하나 이상의 DNA 프라이머 분자인 앰플리콘이 본 발명의 한 양태이다. 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인, PHI17662A의 모든 유전적 요소로부터 유래된 충분한 길이의 하나 이상의 DNA 프라이머인 앰플리콘이 본 발명의 한 양태이다. DAS-59122-7 앰플리콘에 대한 검정은 스트라타젠 로보사이클러 (Stratagene Robocycler), MJ 엔진 (Engine), 퍼킨-엘커 (Perkin-Elmer) 9700, 또는 에펜도르프 마스터사이클러 그래디언트 더모사이클러 (Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler)를 사용하거나, 또는 당업자에게 공지된 방법과 장치를 사용함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 윈리들이 예시 및 기재되었지만, 당업자에게는 본 발명이 이러한 원리들로부터 벗어나지 않고서도 배열상 상세하게 변형될 수 있다는 것이 명백해야 한다. 본 발명자들은 첨부된 청구의 범위의 요지 및 범위 내에 있는 모든 변형을 청구하고 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌과 공개 특허 문헌은 개개의 각 공개문헌 또는 특허원이 구체적이고도 개별적으로 참고로써 도입된다고 언급한 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pioneer Hi-Bred International, Inc. Dow AgroSciences LLC E. I. DuPont de Nemours & Co. <120> CORN EVENT DAS-59122-7 AND METHODS FOR DETECTION THEREOF <130> 1895-PCT <150> 60/614,225 <151> 2004-09-29 <160> 40 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 1 gtggctcctt caacgttgcg gttctgtc 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 2 cgtgcaagcg ctcaattcgc cctatagtg 29 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 3 aattgagcgc ttgcacgttt 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 aacaacaaga ccggccacac cctc 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 gaggtggtct ggatggtgta ggtca 25 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 tacaacctca agtggttcct cttcccga 28 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 7 gaggtctgga tctgcatgat gcgga 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 aacccttagt atgtatttgt att 23 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 ctccttcaac gttgcggttc tgtcag 26 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 ttttgcaaag cgaacgattc agatg 25 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 gcgggacaag ccgttttacg ttt 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 gacgggtgat ttatttgatc tgcac 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 13 catctgaatc gttcgctttg caaaa 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 14 ctacgttcca atggagctcg actgtc 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 15 ggtcaagtgg acacttggtc actca 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 16 gagtgaagag ataagcaagt caaag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 17 catgtatacg taagtttggt gctgg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 aatccacaag attggagcaa acgac 25 <210> 19 <211> 2593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' flanking sequence of DAS 59122-7. <400> 19 ctgagcgcac aacagcgagt cgcatggcac cggacgacat gagcgagatt tagatcggag 60 ggtgcggaca tggggcaacc tgcgcagcta acgcagggat ccacacgacc accaacgaag 120 ccaagcccgg gcacgtcccc aggcaggttg ggccctggtt ccaccagcgg atgcatgcag 180 tgaagcgggg acggagagac aagccgaggg cgcgggtggg aatggcgtcc gggaggacga 240 gtggaggaga agaatctaga ggcatcgaga ttcgagaagc cgacggagac aagattcgtg 300 tggggggaga caaaccgcgg ggctgagcgc cgttgatatg ggatcagacg gtgtggataa 360 aaaaagtgac gttgatagaa cgtctggcca gtgaaaaaac aaaacaactc caacaaaata 420 ctttaaaagc tcttataccc taaatgtagg ggatcaaaca cgtctctaca ctatttagca 480 gcgtcctcta aatgatcctc taaatttaga gaacgctact agattctcta tatatagttt 540 ctctaaacga tcttttatcc atttaaatac tttaaataac cggtttaaca aaactaaaat 600 atatacaata catttgagag tatgacaaat acgtatgtat aaaaataaaa aataaaataa 660 tgtattagtc tactttgaat cttcttttct tcataatata atgatgtata gctctcatgt 720 gcgttgagaa aaaagttaga gctagacgtt taatgtgtag tgacagtctt cgacgaaatc 780 tccctaatga gatgaattac tggaggttcc atcagaaagt cccctgaaaa gaggcattta 840 tttagtttag tcagcaattt ctgggaacac aaatattctt ttgttatcac cactattaaa 900 aatctatggt tataacttat aataacatga aaaaataatt tagcatccca tatatataaa 960 aactgaagga agccatatat actaacataa gttaggagaa actaagaagg ttgtgcaaag 1020 cttgcactgc tccaaaatac tgcaaacaac cactctcctc taccaaccaa agaaactcat 1080 gtactccctc cgttcttttt tatttgtcgc attttagttt aaaaatgaac tagcagtcga 1140 caaatattcg agaacagata tagtatatac taacataact taggagatac taagaaagtt 1200 gcgcagagct ttcactgttc caaattactg caaagcctct cccctctgcc agtacatcta 1260 cgagatgttt cagttaaaca aagattcaga caagtgatga gccacttctt gtcatagatt 1320 gtgtggtcaa ccaacccatt gatgccacgg tttttgtgca tccatgcttt tgtattaaaa 1380 catcagttat gtttaccatg tccgatatgc tctacataat gacaatcaac ttggtgttca 1440 ttatatttac aatgttagga atttcaatag ctacgaacac ttcaatagaa gtgcctttgt 1500 gggatcacct taatgtgttg ttgatgtaag gagaagaatc ttaatttact cttgctaaat 1560 ttgaactaca caaaaccact gcactgagga ttgtcctaat aaattactgc tcatacacgt 1620 tagcatctgt tcagatactg agctaatccc taggattaaa ggatttgtaa aagatatgcc 1680 caatcattca ttttagttat ttatttctta gttatccact tgaagattta catacatttg 1740 aaataaattt cttagaggta aagtgaaaat cagttattta aatacatttt agttatttat 1800 tttcttcttt ttcctaattt ttccttgtat ttgaagtctg aaaagataac tttgccctta 1860 tacatatttt atcttctacg tacgcatctg aacaacgtct ctttgtcccc tgatcgtgca 1920 gcaattagtg ctatgaatcg cgtttaagcg ctgcaaaatc atggctgggg cttcgtcctc 1980 gagtcgtcct gctgctcgat gtcacctcga gtcccgcacc gacctcagtg cttgttcttg 2040 ttggagccac ctctctcgga cgatcgccaa agacggataa ggccgaagcc gtcacttcag 2100 accgcgctca tgcgccgtag cagactccta catagcaggg ccagggtatg tggacctttg 2160 caagtttagg attggaacca gcgaccagaa tccacaagat tggagcaaac gaccaaaaat 2220 tcacaaggat tggcggctga cattgccagc gcgggatcgc atgcggcggc ggcggccggg 2280 gcgagcacgg gagcaggcga cagtcgagct ccattggaac gtagaaatac ttaagggcaa 2340 ggtctccaaa tacttgaaaa aataggaaaa agaagaaaat acatgaaatg atattgaaat 2400 caattggaag atgttatgaa tcttgttttt gcaaagcgaa cgattcagat ggcaaaacta 2460 tgaatctttt tgtttgaagt cccaaatata aaattttctc gtactcacca acattggtgc 2520 gcacctgtga ttggctcata aaaattcttg gagggacgga agaaagagtg aagggataag 2580 caagtaaaag cgc 2593 <210> 20 <211> 1986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' flanking sequence of DAS 59122-7. <400> 20 ttcccttcta tggtcccgtt tgtttatcct ctaaattata taatccagct taaataagtt 60 aagagacaaa caaacaacac agattattaa atagattatg taatctagat acctagatta 120 tgtaatccat aagtagaata tcaggtgctt atataatcta tgagctcgat tatataatct 180 taaaagaaaa caaacagagc ccctataaaa aggggtcaag tggacacttg gtcactcatt 240 taatccctcc ctctcctctt ttatccctct ttttggtgta ttcaccaata gtggtgtgca 300 cctgtgattg gctcgtaaaa attcttggac ggatggaaga gtgaagagat aagcaagtca 360 aagaaaagta acaacgaagc ttcatcagct acaaattttg gcccaactgg ttgcaccagc 420 accaaactta cgtatacatg attatctctg tttccctcat ttcgaagaaa aaaacgggtt 480 tcaaaaccca ctgctttcag gagtaaaaaa agataataat ctgaaacatt gcttccacct 540 tggcccttat ttggttacgt tgcaattcac cccaatccac atgtggattg agatggattg 600 cagtgtagct agacaaaccc ttaggccctg tttgcatagg aatacaccag gaattattcc 660 agctaatcaa aatttatata aatgagagaa acaattcgga taggaattgt tccaggactt 720 cattctgcag taaccgaacg gccccttaat ccaccccaat acacgtggat tggagtggat 780 tgaggtacag ccaaacaagg cctaagtgca gatcaaataa atcacccgtc atattcttct 840 acctacaaaa acagcaataa acacctgaat gaagttctaa tttgcacagt gtaggtagga 900 tgaaaatagt tacctcctca tggtcagtaa ctcttggcac acaacttcac atgtaatcga 960 tgtaccactt ggctcttgcc tgaaacccaa tacatcttta gcataagaat aatattatga 1020 tggcaaggca tgatcaccag cactccttta ttgtttagta agtctatcac tccccaaaac 1080 aattcaaatg aacagagatg cattgccccc aatgaattct atttcaatta gccggaaaat 1140 tctacttcat cagaagcatc caaattgcca gcatccctac tagactgacc atgaccaggc 1200 tgccgcagat gcctcttttt ctgtcctctc ctctttgcct tgagtttctc ttcaagatcc 1260 ctcaccccac gtctcttata catcttaaag ctaacatgtc tctcctccgc catcttccta 1320 accttctcag taatctcagc agcaatctga cggttgtaca acttcttcag ccccttcatc 1380 aactttgcaa atgtgtcagg ctgtggcatc agtcctgcct ctagcatgtc taagcaatac 1440 aggcaggcct ccttgacatg tttcttcgca aacagtgcat gaatccagat agtccatgca 1500 ctcacattga gctcacagcc tttgctcaca atacatttcc aaacatcctt tgcaagctca 1560 agtttctcat ctctgaccaa cgcattgagg aggtccttca gcaccccata ttgcggtacc 1620 acaaagagcc ccctcccaac catgtcttta aaataactac atgcctcaat cagcaaaccc 1680 tgcccaacaa ggccactcac cacgatagca aatgtatcga ccacaggact gagcccagca 1740 ctttccatct cattccacaa tgtcatggct tgcttggtct ccccaagcct gcaggccaac 1800 cgaatcacca cattgtatat cttgagatct ggtggacacc ggcactcccg catcctctcc 1860 atcagctcca agcactcctc aagctgctcc ttcttctcgt gtgctacaaa gaaaccatgg 1920 tacacggcag cgtccacccg caggccatcc ctcgacatag catccaagaa ctcgtacccc 1980 tgggat 1986 <210> 21 <211> 3594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence that represents part of the PHI17662A insert as well as flanking sequence 5' to the insert. <400> 21 ctgagcgcac aacagcgagt cgcatggcac cggacgacat gagcgagatt tagatcggag 60 ggtgcggaca tggggcaacc tgcgcagcta acgcagggat ccacacgacc accaacgaag 120 ccaagcccgg gcacgtcccc aggcaggttg ggccctggtt ccaccagcgg atgcatgcag 180 tgaagcgggg acggagagac aagccgaggg cgcgggtggg aatggcgtcc gggaggacga 240 gtggaggaga agaatctaga ggcatcgaga ttcgagaagc cgacggagac aagattcgtg 300 tggggggaga caaaccgcgg ggctgagcgc cgttgatatg ggatcagacg gtgtggataa 360 aaaaagtgac gttgatagaa cgtctggcca gtgaaaaaac aaaacaactc caacaaaata 420 ctttaaaagc tcttataccc taaatgtagg ggatcaaaca cgtctctaca ctatttagca 480 gcgtcctcta aatgatcctc taaatttaga gaacgctact agattctcta tatatagttt 540 ctctaaacga tcttttatcc atttaaatac tttaaataac cggtttaaca aaactaaaat 600 atatacaata catttgagag tatgacaaat acgtatgtat aaaaataaaa aataaaataa 660 tgtattagtc tactttgaat cttcttttct tcataatata atgatgtata gctctcatgt 720 gcgttgagaa aaaagttaga gctagacgtt taatgtgtag tgacagtctt cgacgaaatc 780 tccctaatga gatgaattac tggaggttcc atcagaaagt cccctgaaaa gaggcattta 840 tttagtttag tcagcaattt ctgggaacac aaatattctt ttgttatcac cactattaaa 900 aatctatggt tataacttat aataacatga aaaaataatt tagcatccca tatatataaa 960 aactgaagga agccatatat actaacataa gttaggagaa actaagaagg ttgtgcaaag 1020 cttgcactgc tccaaaatac tgcaaacaac cactctcctc taccaaccaa agaaactcat 1080 gtactccctc cgttcttttt tatttgtcgc attttagttt aaaaatgaac tagcagtcga 1140 caaatattcg agaacagata tagtatatac taacataact taggagatac taagaaagtt 1200 gcgcagagct ttcactgttc caaattactg caaagcctct cccctctgcc agtacatcta 1260 cgagatgttt cagttaaaca aagattcaga caagtgatga gccacttctt gtcatagatt 1320 gtgtggtcaa ccaacccatt gatgccacgg tttttgtgca tccatgcttt tgtattaaaa 1380 catcagttat gtttaccatg tccgatatgc tctacataat gacaatcaac ttggtgttca 1440 ttatatttac aatgttagga atttcaatag ctacgaacac ttcaatagaa gtgcctttgt 1500 gggatcacct taatgtgttg ttgatgtaag gagaagaatc ttaatttact cttgctaaat 1560 ttgaactaca caaaaccact gcactgagga ttgtcctaat aaattactgc tcatacacgt 1620 tagcatctgt tcagatactg agctaatccc taggattaaa ggatttgtaa aagatatgcc 1680 caatcattca ttttagttat ttatttctta gttatccact tgaagattta catacatttg 1740 aaataaattt cttagaggta aagtgaaaat cagttattta aatacatttt agttatttat 1800 tttcttcttt ttcctaattt ttccttgtat ttgaagtctg aaaagataac tttgccctta 1860 tacatatttt atcttctacg tacgcatctg aacaacgtct ctttgtcccc tgatcgtgca 1920 gcaattagtg ctatgaatcg cgtttaagcg ctgcaaaatc atggctgggg cttcgtcctc 1980 gagtcgtcct gctgctcgat gtcacctcga gtcccgcacc gacctcagtg cttgttcttg 2040 ttggagccac ctctctcgga cgatcgccaa agacggataa ggccgaagcc gtcacttcag 2100 accgcgctca tgcgccgtag cagactccta catagcaggg ccagggtatg tggacctttg 2160 caagtttagg attggaacca gcgaccagaa tccacaagat tggagcaaac gaccaaaaat 2220 tcacaaggat tggcggctga cattgccagc gcgggatcgc atgcggcggc ggcggccggg 2280 gcgagcacgg gagcaggcga cagtcgagct ccattggaac gtagaaatac ttaagggcaa 2340 ggtctccaaa tacttgaaaa aataggaaaa agaagaaaat acatgaaatg atattgaaat 2400 caattggaag atgttatgaa tcttgttttt gcaaagcgaa cgattcagat ggcaaaacta 2460 tgaatctttt tgtttgaagt cccaaatata aaattttctc gtactcacca acattggtgc 2520 gcacctgtga ttggctcata aaaattcttg gagggacgga agaaagagtg aagggataag 2580 caagtaaaag cgctcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc 2640 atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt 2700 tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gcttactagt 2760 agcgctgttt aaacgctctt caactggaag agcggttacc cggaccgaag cttgcatgcc 2820 tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa 2880 gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat 2940 ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat 3000 atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag 3060 tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt 3120 tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg 3180 tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta 3240 gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat 3300 aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa 3360 actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac 3420 gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac 3480 ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga 3540 cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agcc 3594 <210> 22 <211> 2987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence that represents part of the PHI17662A insert as well as flanking sequence 3' to the insert. <400> 22 ctccggagag gagaccagtt gagattaggc cagctacagc agctgatatg gccgcggttt 60 gtgatatcgt taaccattac attgagacgt ctacagtgaa ctttaggaca gagccacaaa 120 caccacaaga gtggattgat gatctagaga ggttgcaaga tagataccct tggttggttg 180 ctgaggttga gggtgttgtg gctggtattg cttacgctgg gccctggaag gctaggaacg 240 cttacgattg gacagttgag agtactgttt acgtgtcaca taggcatcaa aggttgggcc 300 taggatccac attgtacaca catttgctta agtctatgga ggcgcaaggt tttaagtctg 360 tggttgctgt tataggcctt ccaaacgatc catctgttag gttgcatgag gctttgggat 420 acacagcccg gggtacattg cgcgcagctg gatacaagca tggtggatgg catgatgttg 480 gtttttggca aagggatttt gagttgccag ctcctccaag gccagttagg ccagttaccc 540 agatctgagt cgacctgcag gcatgcccgc tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta 600 tctctctcta taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcttataggg 660 tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac 720 ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gggcgagctc ggtacccggg 780 gatcctctag agtcgacctg caggcatgcc cgcggatatc gatgggcccc ggccgaagct 840 tcggtccggg ccatcgtggc ctcttgctct tcaggatgaa gagctatgtt taaacgtgca 900 agcgctcaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaatcgt acgcaattca gtacattaaa 960 aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tttcccttct atggtcccgt 1020 ttgtttatcc tctaaattat ataatccagc ttaaataagt taagagacaa acaaacaaca 1080 cagattatta aatagattat gtaatctaga tacctagatt atgtaatcca taagtagaat 1140 atcaggtgct tatataatct atgagctcga ttatataatc ttaaaagaaa acaaacagag 1200 cccctataaa aaggggtcaa gtggacactt ggtcactcat ttaatccctc cctctcctct 1260 tttatccctc tttttggtgt attcaccaat agtggtgtgc acctgtgatt ggctcgtaaa 1320 aattcttgga cggatggaag agtgaagaga taagcaagtc aaagaaaagt aacaacgaag 1380 cttcatcagc tacaaatttt ggcccaactg gttgcaccag caccaaactt acgtatacat 1440 gattatctct gtttccctca tttcgaagaa aaaaacgggt ttcaaaaccc actgctttca 1500 ggagtaaaaa aagataataa tctgaaacat tgcttccacc ttggccctta tttggttacg 1560 ttgcaattca ccccaatcca catgtggatt gagatggatt gcagtgtagc tagacaaacc 1620 cttaggccct gtttgcatag gaatacacca ggaattattc cagctaatca aaatttatat 1680 aaatgagaga aacaattcgg ataggaattg ttccaggact tcattctgca gtaaccgaac 1740 ggccccttaa tccaccccaa tacacgtgga ttggagtgga ttgaggtaca gccaaacaag 1800 gcctaagtgc agatcaaata aatcacccgt catattcttc tacctacaaa aacagcaata 1860 aacacctgaa tgaagttcta atttgcacag tgtaggtagg atgaaaatag ttacctcctc 1920 atggtcagta actcttggca cacaacttca catgtaatcg atgtaccact tggctcttgc 1980 ctgaaaccca atacatcttt agcataagaa taatattatg atggcaaggc atgatcacca 2040 gcactccttt attgtttagt aagtctatca ctccccaaaa caattcaaat gaacagagat 2100 gcattgcccc caatgaattc tatttcaatt agccggaaaa ttctacttca tcagaagcat 2160 ccaaattgcc agcatcccta ctagactgac catgaccagg ctgccgcaga tgcctctttt 2220 tctgtcctct cctctttgcc ttgagtttct cttcaagatc cctcacccca cgtctcttat 2280 acatcttaaa gctaacatgt ctctcctccg ccatcttcct aaccttctca gtaatctcag 2340 cagcaatctg acggttgtac aacttcttca gccccttcat caactttgca aatgtgtcag 2400 gctgtggcat cagtcctgcc tctagcatgt ctaagcaata caggcaggcc tccttgacat 2460 gtttcttcgc aaacagtgca tgaatccaga tagtccatgc actcacattg agctcacagc 2520 ctttgctcac aatacatttc caaacatcct ttgcaagctc aagtttctca tctctgacca 2580 acgcattgag gaggtccttc agcaccccat attgcggtac cacaaagagc cccctcccaa 2640 ccatgtcttt aaaataacta catgcctcaa tcagcaaacc ctgcccaaca aggccactca 2700 ccacgatagc aaatgtatcg accacaggac tgagcccagc actttccatc tcattccaca 2760 atgtcatggc ttgcttggtc tccccaagcc tgcaggccaa ccgaatcacc acattgtata 2820 tcttgagatc tggtggacac cggcactccc gcatcctctc catcagctcc aagcactcct 2880 caagctgctc cttcttctcg tgtgctacaa agaaaccatg gtacacggca gcgtccaccc 2940 gcaggccatc cctcgacata gcatccaaga actcgtaccc ctgggat 2987 <210> 23 <211> 11922 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The sequence represents the complete sequence of the insert and flanking regions of event DAS 59122-7. <400> 23 ctgagcgcac aacagcgagt cgcatggcac cggacgacat gagcgagatt tagatcggag 60 ggtgcggaca tggggcaacc tgcgcagcta acgcagggat ccacacgacc accaacgaag 120 ccaagcccgg gcacgtcccc aggcaggttg ggccctggtt ccaccagcgg atgcatgcag 180 tgaagcgggg acggagagac aagccgaggg cgcgggtggg aatggcgtcc gggaggacga 240 gtggaggaga agaatctaga ggcatcgaga ttcgagaagc cgacggagac aagattcgtg 300 tggggggaga caaaccgcgg ggctgagcgc cgttgatatg ggatcagacg gtgtggataa 360 aaaaagtgac gttgatagaa cgtctggcca gtgaaaaaac aaaacaactc caacaaaata 420 ctttaaaagc tcttataccc taaatgtagg ggatcaaaca cgtctctaca ctatttagca 480 gcgtcctcta aatgatcctc taaatttaga gaacgctact agattctcta tatatagttt 540 ctctaaacga tcttttatcc atttaaatac tttaaataac cggtttaaca aaactaaaat 600 atatacaata catttgagag tatgacaaat acgtatgtat aaaaataaaa aataaaataa 660 tgtattagtc tactttgaat cttcttttct tcataatata atgatgtata gctctcatgt 720 gcgttgagaa aaaagttaga gctagacgtt taatgtgtag tgacagtctt cgacgaaatc 780 tccctaatga gatgaattac tggaggttcc atcagaaagt cccctgaaaa gaggcattta 840 tttagtttag tcagcaattt ctgggaacac aaatattctt ttgttatcac cactattaaa 900 aatctatggt tataacttat aataacatga aaaaataatt tagcatccca tatatataaa 960 aactgaagga agccatatat actaacataa gttaggagaa actaagaagg ttgtgcaaag 1020 cttgcactgc tccaaaatac tgcaaacaac cactctcctc taccaaccaa agaaactcat 1080 gtactccctc cgttcttttt tatttgtcgc attttagttt aaaaatgaac tagcagtcga 1140 caaatattcg agaacagata tagtatatac taacataact taggagatac taagaaagtt 1200 gcgcagagct ttcactgttc caaattactg caaagcctct cccctctgcc agtacatcta 1260 cgagatgttt cagttaaaca aagattcaga caagtgatga gccacttctt gtcatagatt 1320 gtgtggtcaa ccaacccatt gatgccacgg tttttgtgca tccatgcttt tgtattaaaa 1380 catcagttat gtttaccatg tccgatatgc tctacataat gacaatcaac ttggtgttca 1440 ttatatttac aatgttagga atttcaatag ctacgaacac ttcaatagaa gtgcctttgt 1500 gggatcacct taatgtgttg ttgatgtaag gagaagaatc ttaatttact cttgctaaat 1560 ttgaactaca caaaaccact gcactgagga ttgtcctaat aaattactgc tcatacacgt 1620 tagcatctgt tcagatactg agctaatccc taggattaaa ggatttgtaa aagatatgcc 1680 caatcattca ttttagttat ttatttctta gttatccact tgaagattta catacatttg 1740 aaataaattt cttagaggta aagtgaaaat cagttattta aatacatttt agttatttat 1800 tttcttcttt ttcctaattt ttccttgtat ttgaagtctg aaaagataac tttgccctta 1860 tacatatttt atcttctacg tacgcatctg aacaacgtct ctttgtcccc tgatcgtgca 1920 gcaattagtg ctatgaatcg cgtttaagcg ctgcaaaatc atggctgggg cttcgtcctc 1980 gagtcgtcct gctgctcgat gtcacctcga gtcccgcacc gacctcagtg cttgttcttg 2040 ttggagccac ctctctcgga cgatcgccaa agacggataa ggccgaagcc gtcacttcag 2100 accgcgctca tgcgccgtag cagactccta catagcaggg ccagggtatg tggacctttg 2160 caagtttagg attggaacca gcgaccagaa tccacaagat tggagcaaac gaccaaaaat 2220 tcacaaggat tggcggctga cattgccagc gcgggatcgc atgcggcggc ggcggccggg 2280 gcgagcacgg gagcaggcga cagtcgagct ccattggaac gtagaaatac ttaagggcaa 2340 ggtctccaaa tacttgaaaa aataggaaaa agaagaaaat acatgaaatg atattgaaat 2400 caattggaag atgttatgaa tcttgttttt gcaaagcgaa cgattcagat ggcaaaacta 2460 tgaatctttt tgtttgaagt cccaaatata aaattttctc gtactcacca acattggtgc 2520 gcacctgtga ttggctcata aaaattcttg gagggacgga agaaagagtg aagggataag 2580 caagtaaaag cgctcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc 2640 atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt 2700 tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gcttactagt 2760 agcgctgttt aaacgctctt caactggaag agcggttacc cggaccgaag cttgcatgcc 2820 tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa 2880 gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat 2940 ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat 3000 atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag 3060 tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt 3120 tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg 3180 tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta 3240 gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat 3300 aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa 3360 actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac 3420 gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac 3480 ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga 3540 cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg 3600 gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 3660 ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 3720 tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 3780 ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 3840 tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 3900 tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 3960 tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 4020 atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 4080 gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 4140 tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 4200 agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 4260 gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 4320 ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 4380 gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 4440 aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 4500 catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atgtaggata ggtatacatg 4560 ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 4620 ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 4680 gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 4740 atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 4800 ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcc acacgacacc atgtccgccc gcgaggtgca 4860 catcgacgtg aacaacaaga ccggccacac cctccagctg gaggacaaga ccaagctcga 4920 cggcggcagg tggcgcacct ccccgaccaa cgtggccaac gaccagatca agaccttcgt 4980 ggccgaatcc aacggcttca tgaccggcac cgagggcacc atctactact caattaatgg 5040 cgaggccgag atcagcctct acttcgacaa cccgttcgcc ggctccaaca aatacgacgg 5100 ccactccaac aagtcccagt acgagatcat cacccagggc ggctccggca accagtccca 5160 cgtgacctac accatccaga ccacctcctc ccgctacggc cacaagtcct gagtcatgag 5220 tcatgagtca gttaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta attaatgtat 5280 gaaataaaag gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc atcaaagttg 5340 tgtgttatgt gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc catatttctt 5400 atcctaaatg aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc atttcattaa 5460 ccaaatccat atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg ggttagcaaa 5520 acaaatctag tctaggtgtg ttttgcgaat gcggccgcgg accgaattgg ggatctgcat 5580 gaaagaaact gtcgcactgc tgaaccgcac cttgtcactt tcatcgaaca cgacctgtgc 5640 ccaagatgac ggtgctgcgg tctaagtgag gctgaattgc cttggacaga agcggactcc 5700 ctacaattag ttaggccaaa cggtgcatcc atgtgtagct ccgggctcgg gctgtatcgc 5760 catctgcaat agcatccatg gagctcgttc catgtagttg gagatgaacc aatgatcggg 5820 cgtgtggacg tatgttcctg tgtactccga tagtagagta cgtgttagct ctttcatggt 5880 gcaagtgaaa tttgtgttgg tttaattacc cctacgttag ttgcgggaca ggagacacat 5940 catgaattta aaggcgatga tgtcctctcc tgtaatgtta ttcttttgat gtgatgaatc 6000 aaaatgtcat ataaaacatt tgttgctctt tagttaggcc tgatcgtaga acgaaatgct 6060 cgtgtagcgg ggctacgagc ctatgacgca ataacactgg tttgccggcc cggagtcgct 6120 tgacaaaaaa aagcatgtta agtttattta caattcaaaa cctaacatat tatattccct 6180 caaagcaggt tcacgatcac acctgtacct aaaaaaaaca tgaagaatat attactccat 6240 tattatgaga tgaaccactt ggcaagagtg gtaagctata taaaaaaatg aacattatta 6300 cgagatgtta tatgccatta tattgattcg aagatatatg tttctttctc ccacgggcac 6360 ctaacggata catgataagg ccaaggcaga tcacgggaaa ttattcgaat acatgttacg 6420 ccctattgcc ggaaaaaaaa tgcagggcag gtgttggccg tagcgattta agcacttaag 6480 ctggaggttg ccacacttgg atgcaagcgt ctgacccttc taaaacatcg gcggctttgt 6540 ccgtatccgt atcccctatc cgacatctag ctggccacac gacggggctg ggcagatcgt 6600 ggatgccggg tcgacgtcga tcgtcagcca tcatagacca atcgaccatc tgttatggat 6660 gcttgctagc tagactagtc agacataaaa tttggatact ttctcccaac tgggagacgg 6720 ggactgatgt gcagctgcac gtgagctaaa tttttcccta taaatatgca tgaaatactg 6780 cattatcttg ccacagccac tgccacagcc agataacaag tgcagctggt agcacgcaac 6840 gcatagctct ggacttgtag ctaggtagcc aaccggatcc acacgacacc atgctcgaca 6900 ccaacaaggt gtacgagatc agcaaccacg ccaacggcct ctacgccgcc acctacctct 6960 ccctcgacga ctccggcgtg tccctcatga acaagaacga cgacgacatc gacgactaca 7020 acctcaagtg gttcctcttc ccgatcgacg acgaccagta catcatcacc tcctacgccg 7080 ccaacaactg caaggtgtgg aacgtgaaca acgacaagat taatgtgtca acctactcct 7140 ccaccaactc catccagaag tggcagatca aggccaacgg ctcctcctac gtgatccagt 7200 ccgacaacgg caaggtgctc accgccggca ccggccaggc cctcggcctc atccgcctca 7260 ccgacgagtc ctccaacaac ccgaaccagc aatggaacct gacgtccgtg cagaccatcc 7320 agctcccgca gaagccgatc atcgacacca agctcaagga ctacccgaag tactccccga 7380 ccggcaacat cgacaacggc acctccccgc agctcatggg ctggaccctc gtgccgtgca 7440 tcatggtgaa cgacccgaac atcgacaaga acacccagat caagaccacc ccgtactaca 7500 tcctcaagaa gtaccagtac tggcagaggg ccgtgggctc caacgtcgcg ctccgcccgc 7560 acgagaagaa gtcctacacc tacgagtggg gcaccgagat cgaccagaag accaccatca 7620 tcaacaccct cggcttccag atcaacatcg acagcggcat gaagttcgac atcccggagg 7680 tgggcggcgg taccgacgag atcaagaccc agctcaacga ggagctcaag atcgagtatt 7740 cacatgagac gaagatcatg gagaagtacc aggagcagtc cgagatcgac aacccgaccg 7800 accagtccat gaactccatc ggcttcctca ccatcacctc cctggagctc taccgctaca 7860 acggctccga gatccgcatc atgcagatcc agacctccga caacgacacc tacaacgtga 7920 cctcctaccc gaaccaccag caggccctgc tgctgctgac caaccactcc tacgaggagg 7980 tggaggagat caccaacatc ccgaagtcca ccctcaagaa gctcaagaag tactacttct 8040 gagtcatgag tcatgagtca gttaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta 8100 attaatgtat gaaataaaag gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc 8160 atcaaagttg tgtgttatgt gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc 8220 catatttctt atcctaaatg aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc 8280 atttcattaa ccaaatccat atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg 8340 ggttagcaaa acaaatctag tctaggtgtg ttttgcgaat tcccatggag tcaaagattc 8400 aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct 8460 tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acgcttgtct 8520 actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac 8580 aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg 8640 tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg 8700 ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga 8760 gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata 8820 tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta 8880 tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cagggtaccc ggggatccac catgtctccg 8940 gagaggagac cagttgagat taggccagct acagcagctg atatggccgc ggtttgtgat 9000 atcgttaacc attacattga gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca 9060 caagagtgga ttgatgatct agagaggttg caagatagat acccttggtt ggttgctgag 9120 gttgagggtg ttgtggctgg tattgcttac gctgggccct ggaaggctag gaacgcttac 9180 gattggacag ttgagagtac tgtttacgtg tcacataggc atcaaaggtt gggcctagga 9240 tccacattgt acacacattt gcttaagtct atggaggcgc aaggttttaa gtctgtggtt 9300 gctgttatag gccttccaaa cgatccatct gttaggttgc atgaggcttt gggatacaca 9360 gcccggggta cattgcgcgc agctggatac aagcatggtg gatggcatga tgttggtttt 9420 tggcaaaggg attttgagtt gccagctcct ccaaggccag ttaggccagt tacccagatc 9480 tgagtcgacc tgcaggcatg cccgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct 9540 ctctataata atgtgtgagt agttcccaga taagggaatt agggttctta tagggtttcg 9600 ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta 9660 tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagggcg agctcggtac ccggggatcc 9720 tctagagtcg acctgcaggc atgcccgcgg atatcgatgg gccccggccg aagcttcggt 9780 ccgggccatc gtggcctctt gctcttcagg atgaagagct atgtttaaac gtgcaagcgc 9840 tcaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca atcgtacgca attcagtaca ttaaaaacgt 9900 ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttttcc cttctatggt cccgtttgtt 9960 tatcctctaa attatataat ccagcttaaa taagttaaga gacaaacaaa caacacagat 10020 tattaaatag attatgtaat ctagatacct agattatgta atccataagt agaatatcag 10080 gtgcttatat aatctatgag ctcgattata taatcttaaa agaaaacaaa cagagcccct 10140 ataaaaaggg gtcaagtgga cacttggtca ctcatttaat ccctccctct cctcttttat 10200 ccctcttttt ggtgtattca ccaatagtgg tgtgcacctg tgattggctc gtaaaaattc 10260 ttggacggat ggaagagtga agagataagc aagtcaaaga aaagtaacaa cgaagcttca 10320 tcagctacaa attttggccc aactggttgc accagcacca aacttacgta tacatgatta 10380 tctctgtttc cctcatttcg aagaaaaaaa cgggtttcaa aacccactgc tttcaggagt 10440 aaaaaaagat aataatctga aacattgctt ccaccttggc ccttatttgg ttacgttgca 10500 attcacccca atccacatgt ggattgagat ggattgcagt gtagctagac aaacccttag 10560 gccctgtttg cataggaata caccaggaat tattccagct aatcaaaatt tatataaatg 10620 agagaaacaa ttcggatagg aattgttcca ggacttcatt ctgcagtaac cgaacggccc 10680 cttaatccac cccaatacac gtggattgga gtggattgag gtacagccaa acaaggccta 10740 agtgcagatc aaataaatca cccgtcatat tcttctacct acaaaaacag caataaacac 10800 ctgaatgaag ttctaatttg cacagtgtag gtaggatgaa aatagttacc tcctcatggt 10860 cagtaactct tggcacacaa cttcacatgt aatcgatgta ccacttggct cttgcctgaa 10920 acccaataca tctttagcat aagaataata ttatgatggc aaggcatgat caccagcact 10980 cctttattgt ttagtaagtc tatcactccc caaaacaatt caaatgaaca gagatgcatt 11040 gcccccaatg aattctattt caattagccg gaaaattcta cttcatcaga agcatccaaa 11100 ttgccagcat ccctactaga ctgaccatga ccaggctgcc gcagatgcct ctttttctgt 11160 cctctcctct ttgccttgag tttctcttca agatccctca ccccacgtct cttatacatc 11220 ttaaagctaa catgtctctc ctccgccatc ttcctaacct tctcagtaat ctcagcagca 11280 atctgacggt tgtacaactt cttcagcccc ttcatcaact ttgcaaatgt gtcaggctgt 11340 ggcatcagtc ctgcctctag catgtctaag caatacaggc aggcctcctt gacatgtttc 11400 ttcgcaaaca gtgcatgaat ccagatagtc catgcactca cattgagctc acagcctttg 11460 ctcacaatac atttccaaac atcctttgca agctcaagtt tctcatctct gaccaacgca 11520 ttgaggaggt ccttcagcac cccatattgc ggtaccacaa agagccccct cccaaccatg 11580 tctttaaaat aactacatgc ctcaatcagc aaaccctgcc caacaaggcc actcaccacg 11640 atagcaaatg tatcgaccac aggactgagc ccagcacttt ccatctcatt ccacaatgtc 11700 atggcttgct tggtctcccc aagcctgcag gccaaccgaa tcaccacatt gtatatcttg 11760 agatctggtg gacaccggca ctcccgcatc ctctccatca gctccaagca ctcctcaagc 11820 tgctccttct tctcgtgtgc tacaaagaaa ccatggtaca cggcagcgtc cacccgcagg 11880 ccatccctcg acatagcatc caagaactcg tacccctggg at 11922<210> 24 <211> 7390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This sequence represents the DNA molecule used to transform maize line DAS59122-7 and represents insert PHI 17662A. <221> misc_feature <222> (1)...(25) <223> T-DNA right border <221> misc_feature <222> (7366)...(7390) <223> T-DNA left border <400> 24 gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60 aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg 120 acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc actcagcaag 180 cttactagta gcgctgttta aacgctcttc aactggaaga gcggttaccc ggaccgaagc 240 ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 300 catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 360 tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 420 tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 480 acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 540 tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 600 catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 660 tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 720 tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 780 attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 840 gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 900 gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 960 accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga 1020 gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct 1080 ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca 1140 caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc 1200 caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc 1260 tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct 1320 gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg 1380 gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg 1440 aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt 1500 cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt 1560 gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc 1620 ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg 1680 gatctgtatg tgtgtgccat 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tttaggacag agccacaaac 2040 accacaagag tggattgatg atctagagag gttgcaagat agataccctt ggttggttgc 2100 tgaggttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg ctaggaacgc 2160 ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa ggttgggcct 2220 aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt ttaagtctgt 2280 ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg ctttgggata 2340 cacagcccgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc atgatgttgg 2400 tttttggcaa agggattttg agttgccagc tcctccaagg ccagttaggc cagttaccca 2460 gatctgagtc gacctgcagg catgcccgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat 2520 ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cttatagggt 2580 ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 2640 tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag ggcgagctcg gtacccgggg 2700 atcctctaga gtcgacctgc aggcatgccc gcggatatcg atgggccccg gccgaagctt 2760 cggtccgggc catcgtggcc tcttgctctt caggatgaag agctatgttt aaacgtgcaa 2820 gcgctcaatt 2830 <210> 28 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O784/O564 <400> 28 aatccacaag attggagcaa acgaccaaaa attcacaagg attggcggct gacattgcca 60 gcgcgggatc gcatgcggcg gcggcggccg gggcgagcac gggagcaggc gacagtcgag 120 ctccattgga acgtag 136 <210> 29 <211> 263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O784/O543 <400> 29 aatccacaag attggagcaa acgaccaaaa attcacaagg attggcggct gacattgcca 60 gcgcgggatc gcatgcggcg gcggcggccg gggcgagcac gggagcaggc gacagtcgag 120 ctccattgga acgtagaaat acttaagggc aaggtctcca aatacttgaa aaaataggaa 180 aaagaagaaa atacatgaaa tgatattgaa atcaattgga agatgttatg aatcttgttt 240 ttgcaaagcg aacgattcag atg 263 <210> 30 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O569/O577 <400> 30 ggtcaagtgg acacttggtc actcatttaa tccctccctc tcctctttta tccctctttt 60 tggtgtattc accaatagtg gtgtgcacct gtgattggct cgtaaaaatt cttggacgga 120 tggaagagtg aagagataag caagtcaaag aaaagtaaca acgaagcttc atcagctaca 180 aattttggcc caactggttg caccagcacc aaacttacgt atacatg 227 <210> 31 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O570/O542 <400> 31 gagtgaagag ataagcaagt caaagaaaag taacaacgaa gcttcatcag ctacaaattt 60 tggcccaact ggttgcacca gcaccaaact tacgtataca tgattatctc tgtttccctc 120 atttcgaaga aaaaaacggg tttcaaaacc cactgctttc aggagtaaaa aaagataata 180 atctgaaaca ttgcttccac cttggccctt atttggttac gttgcaattc accccaatcc 240 acatgtggat tgagatggat tgcagtgtag ctagacaaac ccttaggccc tgtttgcata 300 ggaatacacc aggaattatt ccagctaatc aaaatttata taaatgagag aaacaattcg 360 gataggaatt gttccaggac ttcattctgc agtaaccgaa cggcccctta atccacccca 420 atacacgtgg attggagtgg attgaggtac agccaaacaa ggcctaagtg cagatcaaat 480 aaatcacccg tc 492 <210> 32 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O784/O215 <400> 32 aatccacaag attggagcaa acgaccaaaa attcacaagg attggcggct gacattgcca 60 gcgcgggatc gcatgcggcg gcggcggccg gggcgagcac gggagcaggc gacagtcgag 120 ctccattgga acgtagaaat acttaagggc aaggtctcca aatacttgaa aaaataggaa 180 aaagaagaaa atacatgaaa tgatattgaa atcaattgga agatgttatg aatcttgttt 240 ttgcaaagcg aacgattcag atggcaaaac tatgaatctt tttgtttgaa gtcccaaata 300 taaaattttc tcgtactcac caacattggt gcgcacctgt gattggctca taaaaattct 360 tggagggacg gaagaaagag tgaagggata agcaagtaaa agcgctcaaa cactgatagt 420 ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt 480 atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa 540 cgttgaagga gccac 555 <210> 33 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O219/O577 <400> 33 cgtgcaagcg ctcaattcgc cctatagtga gtcgtattac aatcgtacgc aattcagtac 60 attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttttc ccttctatgg 120 tcccgtttgt ttatcctcta aattatataa tccagcttaa ataagttaag agacaaacaa 180 acaacacaga ttattaaata gattatgtaa tctagatacc tagattatgt aatccataag 240 tagaatatca ggtgcttata taatctatga gctcgattat ataatcttaa aagaaaacaa 300 acagagcccc tataaaaagg ggtcaagtgg acacttggtc actcatttaa tccctccctc 360 tcctctttta tccctctttt tggtgtattc accaatagtg gtgtgcacct gtgattggct 420 cgtaaaaatt cttggacgga tggaagagtg aagagataag caagtcaaag aaaagtaaca 480 acgaagcttc atcagctaca aattttggcc caactggttg caccagcacc aaacttacgt 540 atacatg 547 <210> 34 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O506/O476 <400> 34 tctcgtactc accaacattg gtgcgcacct gtgattggct cataaaaatt cttggaggga 60 cggaagaaag agtgaaggga taagcaagta aaagcgctca aacactgata gtttaaactg 120 aaggcgggaa acgacaatct gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg ttatgacccc 180 cgccgatgac gcgggacaag ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgttgaag 240 gag 243 <210> 35 <211> 754 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Amplicon O447/O577 <400> 35 aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta 60 aaaccaaaat ccagggcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat 120 gcccgcggat atcgatgggc cccggccgaa gcttcggtcc gggccatcgt ggcctcttgc 180 tcttcaggat gaagagctat gtttaaacgt gcaagcgctc aattcgccct atagtgagtc 240 gtattacaat cgtacgcaat tcagtacatt aaaaacgtcc gcaatgtgtt attaagttgt 300 ctaagcgtca atttttccct tctatggtcc cgtttgttta tcctctaaat tatataatcc 360 agcttaaata agttaagaga caaacaaaca acacagatta ttaaatagat tatgtaatct 420 agatacctag attatgtaat ccataagtag aatatcaggt gcttatataa tctatgagct 480 cgattatata atcttaaaag aaaacaaaca gagcccctat aaaaaggggt caagtggaca 540 cttggtcact catttaatcc ctccctctcc tcttttatcc ctctttttgg tgtattcacc 600 aatagtggtg tgcacctgtg attggctcgt aaaaattctt ggacggatgg aagagtgaag 660 agataagcaa gtcaaagaaa agtaacaacg aagcttcatc agctacaaat tttggcccaa 720 ctggttgcac cagcaccaaa cttacgtata catg 754 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 36 cgtattacaa tcgtacgcaa ttcag 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 37 ggataaacaa acgggaccat agaag 25 <210> 38 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of SEQ ID NOs: 36 and 37 <400> 38 cgtattacaa tcgtacgcaa ttcagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg 60 tctaagcgtc aatttttccc ttctatggtc ccgtttgttt atcc 104 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVR1 (0197) Primer used to generate a 226 bp amplicon as an internal positive control <400> 39 ccgctgtatc acaagggctg gtacc 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVR2 (0198) Primer used to generate a 226 bp amplicon as an internal positive control <400> 40 ggagcccgtg tagagcatga cgatc 25 App. Ref. 1895-PCT 1

Claims (49)

  1. a) 서열 19에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    b) 서열 20에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    c) 서열 23에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    d) 서열 21에 기재된 뉴클레오티드 서열; 및
    e) 서열 22에 기재된 뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
  2. 서열 19 또는 서열 20 내의 서열을 인식하는 제1 프라이머를 적어도 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    a) 서열 24의 서열; 및
    b) 서열 20의 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 서열 내의 뉴클레오티드 서열을 인식하는 제2 프라이머를 적어도 추가로 포함하는 키트.
  4. 제2항에 있어서, 제1 프라이머가
    a) 서열 19의 서열; 및
    b) 서열 20의 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 서열 내의 뉴클레오티드 서열을 인식하는 키트.
  5. 제3항에 있어서, 적어도 제1 프라이머와 제2 프라이머 각각이,
    a) 서열 18과 서열 1의 서열;
    b) 서열 10과 서열 9의 서열;
    c) 서열 2와 서열 17의 서열;
    d) 서열 8과 서열 17의 서열; 및
    e) 서열 36과 서열 37
    로 이루어진 군 중에서 선택된 서열 쌍을 포함하는 키트.
  6. a) 서열 21에 기재된 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열 22에 기재된 뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 서열과 상동성이거나 이에 상보적인, DNA 탐지 방법에서 기능하기에 충분한 길이의 연속되는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는, 옥수수 이벤트 DAS-59122-7 및 그의 자손의 연접부 DNA에 대해 특이적인 DNA 탐지용 키트.
  7. a) 서열 19와 서열 24의 서열; 및
    b) 서열 20과 서열 24의 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 서열들과 혼성화하고 이와 연속되는 서열을 포함하는 특이적 프로브를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 키트.
  8. 서열 21 또는 서열 22와 상동성이거나 이에 상보적인 충분한 길이의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하고 옥수수 이벤트 DAS-59122-7 및 그의 자손에 대해 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하는 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 DNA 탐지용 키트.
  9. 제1, 제2 및 제3 발현 카세트를 포함하는 DNA 구조물로서,
    제1 발현 카세트는
    (a) 옥수수 유비퀴틴 프로모터;
    (b) 옥수수 유비퀴틴 유전자의 5' 비해독 엑손;
    (c) 옥수수 유비퀴틴 제1 인트론;
    (d) Cry34Ab1 암호화 DNA 분자; 및
    (e) PinII 전사 종결인자
    를 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하고;
    제2 발현 카세트는
    (i) 밀 퍼옥시다제 프로모터;
    (ii) Cry35Ab1 암호화 DNA 분자; 및
    (iii) PinII 전사 종결인자
    를 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하며;
    제3 발현 카세트는
    (1) CaMV 35S 프로모터;
    (2) pat 암호화 DNA 서열; 및
    (3) (CaMV) 35S로부터의 3' 전사 종결인자
    를 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하는,
    DNA 구조물.
  10. 제9항의 DNA 구조물을 포함하는 식물.
  11. 제10항에 있어서, 옥수수 식물인 식물.
  12. 서열 19 또는 서열 20 내의 서열을 특이적으로 인식하는 프로브 또는 제1 프라이머를 사용하여 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 프라이머가 서열 19 또는 서열 20 내의 서열을 인식하고, 제2 프라이머는 서열 20 또는 서열 24 내의 서열을 인식하는 적어도 2개의 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산으로부터 DNA 단편을 증폭시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제1 프라이머가 서열 19 내의 서열을 인식하고, 제2 프라이머가 서열 24 내의 서열을 인식하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 제1 프라이머가 서열 20 내의 서열을 인식하고, 제2 프라이머가 서열 20 내의 서열을 인식하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머가 서열 18 및 서열 1의 서열을 각각 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머가 서열 10 및 서열 9의 서열을 각각 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머가 서열 2 및 서열 17의 서열을 각각 포함하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머가 서열 8 및 서열 17의 서열을 각각 포함하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머가 서열 36 및 서열 37의 서열을 각각 포함하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, DAS-59122-7 PCR 확인 프로토콜을 사용하여 약 555 bp의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, DAS-59122-7 PCR 확인 프로토콜을 사용하여 약 313 bp의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, DAS-59122-7 PCR 확인 프로토콜을 사용하여 약 547 bp의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  24. 제19항에 있어서, DAS-59122-7 PCR 확인 프로토콜을 사용하여 약 754 bp의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  25. 제20항에 있어서, DAS-59122-7 PCR 확인 프로토콜을 사용하여 약 104 bp의 단편을 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  26. (a) 생물학적 샘플로부터 DNA 샘플을 추출하는 단계;
    (b) i) 서열 18과 서열 1의 서열;
    ii) 서열 10과 서열 9의 서열;
    iii) 서열 2와 서열 17의 서열; 및
    iv) 서열 8과 서열 17의 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 DNA 프라이머 분자 쌍을 제공하는 단계;
    (c) DNA 증폭 반응 조건을 제공하는 단계;
    (d) 상기 DNA 증폭 반응을 수행함으로써, DNA 앰플리콘 분자를 생성시키는 단계; 및
    (e) 상기 DNA 앰플리콘 분자를 탐지하는 단계 (상기 DNA 증폭 반응에서 DNA 앰플리콘 분자의 탐지는 옥수수 이벤트 DAS-59122-7의 존재를 나타냄)
    를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 옥수수 이벤트 DAS-59122-7 또는 그의 자손의 존재 여부를 탐지하는 방법.
  27. 제26항의 방법에 의해 생성된 앰플리콘들 중의 어느 하나를 포함하는 단리된 DNA 분자.
  28. (a) 엄격한 혼성화 조건 하에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 유래한 DNA와 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에 비-DAS-59122-7 옥수수 식물 DNA와는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 옥수수 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플과 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및
    (c) 상기 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 탐지하는 단계 (혼성화의 탐지는 DAS-59122-7 이벤트의 존재를 나타냄)
    를 포함하는, 샘플 중에서 DAS-59122-7 이벤트에 상응하는 DNA의 존재 여부를 탐지하는 방법.
  29. 서열 1 내지 18, 36 및 37로 이루어진 군 중에서 선택된 서열, 또는 그의 상보체를 포함하는, 단리된 DNA 뉴클레오티드 프라이머 서열.
  30. 제29항에 있어서, 서열 1, 2, 8, 9, 10, 17 및 18로 이루어진 군 중에서 선택된 서열 또는 그의 상보체를 포함하는, 단리된 DNA 뉴클레오티드 프라이머 서열.
  31. 제1 DNA 분자와 제2 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자 쌍으로서, 이들 DNA 분자가 DAS-59122-7 옥수수 식물 또는 그의 자손으로부터 추출한 DNA에 대한 진단인자인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하기에 충분한 길이의 하기의 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 서열의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 DNA 분자 쌍:
    a) 서열 21에 제시된 서열 또는 그의 상보체; 및
    b) 서열 22에 제시된 서열 또는 그의 상보체.
  32. 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함하는 연접부 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
  33. 종자 샘플 중에서, 서열 19 또는 서열 20 내의 서열을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는 것을 포함하는, 종자 순도를 확인하는 방법.
  34. 종자 로트 (seed lot) 샘플 중에서, 서열 19 또는 서열 20 내의 서열을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는 것을 포함하는, 이벤트 DAS-59122-7의 존재여부에 대한 종자의 스크리닝 방법.
  35. 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA가 식물의 게놈 일부를 형성하는, 해충 저항성 옥수수 식물 또는 그의 일부.
  36. 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA가 식물의 게놈 일부를 형성하는, 제35항의 해충 저항성 옥수수 식물의 자손식물.
  37. 제35항 또는 제36항의 식물의 종자.
  38. 제35항 또는 제36항의 식물을 번식시키는 단계; 및 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써 자손을 선별하는 단계를 포함하는, 해충 저항성 옥수수 식물을 생산하는 방법.
  39. 서열 1 내지 18, 36 및 37, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA 서열.
  40. 각각 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, DNA 증폭 과정에서 함께 사용되는 경우에 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시키는 단리된 DNA 서열 쌍.
  41. 제40항에 있어서, 각 서열이
    a) 서열 21의 서열; 및
    b) 서열 22의 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열 내로부터 선택되는 단리된 DNA 서열 쌍.
  42. (a) 각각 서열 21 또는 서열 22로부터의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍을 선별하는 단계 (상기 쌍의 각 구성원은 DAS-59122-7 이벤트 삽입에 대한 진단인자인 서열의 반대측 상에 존재함);
    (b) 옥수수 조직 샘플을 상기 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계; 및
    (c) DNA 증폭을 수행하고 앰플리콘을 분석하는 단계
    를 포함하는, 옥수수 조직 중에 DAS-59122-7 이벤트 삽입의 존재를 탐지하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 프라이머 쌍이, 서열 1 내지 18, 36 및 37, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  44. (a) 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 DNA 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브와 옥수수 조직 샘플을 접촉시키는 단계;
    (b) 이러한 샘플과 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및
    (c) 상기 프로브의 혼성화를 분석하는 단계
    를 포함하는, 옥수수 조직 중에 DAS-59122-7 이벤트 삽입의 존재를 탐지하는 방법.
  45. 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 DNA 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 탐지용 키트.
  46. 각각 서열 21 및 서열 22 내로부터의 10개 이상 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍 (각각은 DAS-59122-7 이벤트 삽입에 대한 진단인자인 서열의 반대측 상에 존재함)을 포함하는 DNA 탐지용 키트.
  47. 제46항에 있어서, 프라이머 쌍이, 서열 1 내지 18, 36 및 37, 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택되는 DNA 탐지용 키트.
  48. 서열 23 내의 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7를 확인하기 위한 키트.
  49. 서열 23 내의 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는, 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7를 확인하는 방법.
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